CN104830823A - 一种胰激肽原酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胰激肽原酶的制备方法，采用Amino acids-Sepharose亲和柱层析进行分离纯化，具体制备方法包括有平衡液和洗脱液的配制、平衡、进样、洗涤、洗脱、除菌、冻干等工序。制备的胰激肽原酶纯度高达95％以上，效价增加360单位/mg以上，比活达到920单位/mg蛋白以上，产品收率在90.0％以上，可直接作为注射剂的原料药进行应用。

Description

一种胰激肽原酶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种胰激肽原酶的制备方法。
背景技术
胰激肽原酶原料药系自猪胰中提取的蛋白酶，为类白色或淡褐色粉末，无臭，易溶于水。胰激肽原酶是胰激肽释放酶的前体，在体内可激活生成胰激肽释放酶。胰激肽释放酶为内切性蛋白水解酶，具有高度的专一性，对于高分子量或低分子量的激肽原均有作用，胰激肽原酶在体内作用于激肽原释放出激肽，从而释放出胰激肽，胰激肽具有非常强的生理效应，能使微血管舒张，有舒展毛细血管和小动脉作用，使冠状动脉、脑、视网膜等处的血流供应量增加，血压下降。舒张微小动脉和毛细血管，改善微循环。激活磷酸脂酶A2，促使肾髓质分泌前列腺素E2，抑制氧化应激，增加血流量。促进前列环素(PGI2)分泌，抑制血栓素(TXA2)生成，避免血小板过度聚集，降低血粘度，预防血栓形成，避免加重肾脏微循环损害。胰激肽原酶作为一种国际公认的微循环改善剂，是一种疗效确切、不良反应轻微的酶类药物，适宜于长期服用，适用于各种微血管循环障碍疾病的治疗。胰激肽原酶对早期肾病的治疗效果显著，能有效地改善肾脏的微循环，与其它药物配合治疗，能降低肾小球入球动脉压，具有促使肾小球基底膜早期损伤修复等作用，该产品的市场前景十分广阔。临床主要用于高血压、冠状血管及动脉血管硬化等症，对心绞痛、血管痉挛、肢端感觉异常、冻疮等症有减轻症状作用。
胰激肽原酶是从哺乳动物的胰脏中经提取纯化而得到的，即从胰脏本身、胰酶粉以及胰激肽原酶粗品(中间体)中提取，并通过纯化而制得。现有胰激肽原酶的纯化方法包括使用多糖非树脂物料进行纯化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一种弱碱性阴离子交换纤维素上并分离(见日本专利发行No.11697/62)；或者将一种铝盐或者锌盐加入含有胰激肽原酶的水溶液中，将产生的胰激肽原酶的沉淀吸附到弱碱性的阴离子交换纤维素上或交联葡聚糖(Sephadex)上，并分离之(见日本公开专利发行No.56886/73)；另一种已知的纯化方法是使用离子交换树脂，即加入一种蛋白质沉淀剂到胰脏提取液中，产生的胰激肽原酶吸附到大孔强碱性阴离子交换树脂，并分离之(见日本公开专利No.103715/73)。然而，利用上述多糖型非树脂物料进行吸附的方法缺点是离子交换物料的物理强度不够，不能进行大规模制备。而离子交换树脂法不能使产品在洗脱时除去不需要的杂质。因此，上述方法得到产品的纯度还有待于进一步提高。
亲和层析技术的基本原理蛋白质与配体之间有一种特殊的亲和力，在一定的条件下，先将提纯的某种蛋白质的配体通过适当的化学反应，共价的连接在载体颗粒表面的功能团上，可从溶液中专一性地分离和提纯蛋白质，达到较高的纯度。只需一步就能提纯百倍，甚至千倍，从而得到纯的产品。
公开号为CN101073666的中国发明专利公开了一种制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法，其采用QAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析纯化制得胰激肽原酶的原料药，其纯度高达75％以上，效价增加55单位/mg以上，比活达到350单位/mg蛋白以上。但其存在以下缺陷：比活达不到600单位/mg蛋白，纯度达不到90％，不能作为注射剂的原料药进行应用。
公开号为CN1336434A的中国发明专利公开了胰激肽原酶的制备及其亲和层析纯化方法，采用了亲和层析胶体柱，亲和层析胶体柱是以胰蛋白酶抑制剂作为配基与琼脂糖结合的层析胶体。其效价高达在250～380之间，比活在800～1000单位/mg蛋白，产品收率85％。但该专利存在以下缺陷：产品收率较低，不能达到90％以上。其采用的亲和配基胰蛋白酶抑制剂是蛋白类配基，与氨基酸同类，并且蛋白类配基分子量较大，与胰激肽原酶结合时有空间阻隔，亲和不能达到100％，使收率降低。胰蛋白酶抑制配基使用过程如有脱落，易对蛋白酶类造成抑制，产生不良反应。蛋白类配基属大分子易致过敏反应产生。
发明人公开号为CN102787111A的中国发明专利是通过HS-Sepharose亲和柱层析纯化胰激肽原酶粗品，纯化得到的胰激肽原酶效价增加70单位/mg以上，比活达600单位/mg蛋白以上。但是原有的亲和层析偶联固定相与大分子胰激肽原酶的亲和面积以及亲和专一性还需要做进一步的改进，制备的胰激肽原酶的比活和效价增加还有待进一步的提高。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种胰激肽原酶的制备方法，采用Amino acids-Sepharose亲和柱层析进行分离纯化，制备的胰激肽原酶纯度高达95％以上，效价增加360单位/mg以上，比活达到920单位/mg蛋白以上，产品收率在90.0％以上。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种胰激肽原酶的制备方法，步骤如下：
(1)配制：配制浓度为20～30％(g/ml)的无机盐平衡液，调整pH为4.0；配制浓度为20～30％(g/ml)的无机盐洗脱液，调整pH为6.0，检测溶液的电导值；
配制无机盐平衡液和无机盐洗脱液所用的无机盐均选自硫酸钠、硫酸铵、硫酸钾，硫酸镁、氯化钠或氯化铵中的一种或多种。
(2)亲和柱层析：
1)平衡：将制备的Amino acids－Sepharose亲和层析偶联固定相填入层析柱中，用步骤(1)配制的pH4.0、浓度20～30％(g/ml)的无机盐平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；
2)进样：调整胰激肽原酶粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于平衡液电导值(以无机盐或水调整电导值)，根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上样；
3)洗涤：用pH4.0、浓度20～30％(g/ml)的无机盐平衡液冲洗柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至流出液的吸收值低于0.5时停止；
4)洗脱：用pH6.0、浓度20～30％(g/ml)的无机盐洗脱液洗脱柱子，流速300～340ml/min，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液；
5)除菌：收集液用微孔滤膜进行除菌过滤，得无菌滤液；
6)冻干：加入辅料进行冻干，即得胰激肽原酶，纯度95％以上，效价增加360单位/mg以上，比活920单位/mg蛋白以上，收率90％以上。
步骤1)中，所述Amino acids-Sepharose亲和层析偶联固定相为Arginine–Sepharose，Histidine–Sepharose，或Lysine–Sepharose中的一种或多种。
步骤1)中，所述Amino acids-Sepharose亲和层析偶联固定相制备方法为：
①将琼脂糖(Sepharose)用5-10重量倍(g/g)的纯化水溶涨，加入质量浓度为2％～5％的硫酸溶液，搅拌均匀；2％～5％硫酸溶液加入量为Sepharose湿重(“Sepharose湿重”即为加入纯化水溶胀后Sepharose的重量)30％～60％。
②向步骤①搅拌均匀后的溶液中滴加质量浓度为3％～6％硝酸钠溶液，3％～6％硝酸钠溶液的加入量为Sepharose湿重的30％～60％，搅拌，放置30分钟，水洗涤；
③将组氨酸(Histidine)、精氨酸(Arginine)或赖氨酸(Lysine)用纯化水溶解，得氨基酸水溶液，缓缓滴加到步骤②的Sepharose上，搅拌均匀；氨基酸水溶液的加入量为Sepharose湿重的6％～10％；
④调整pH值至5.0～7.0，放置3～4小时，抽滤，纯化水洗至中性，即得。
步骤1)③中，氨基酸水溶液的质量浓度为10％。
步骤1)④中，调整pH值所用的溶液为碳酸钠溶液。
步骤2)中，所述胰激肽原酶粗品液的制备方法为：取胰脏粉或胰脏，加20～30倍量(重量倍数)纯化水溶解提取，搅拌均匀后调整pH为7.0～8.0，静置沉淀进行粗提纯，冷冻静置沉淀，虹吸上清液，下层沉淀压滤得粗品液。
步骤2)①中，pH调整采用氨水调节，冷冻静置沉淀温度为零下20℃以下，离心转速为大于3000转/分。
步骤2)②中，草酸盐溶液的组成为：每100ml草酸盐溶液中含1～1.75g的草酸铵，1～1.75g的草酸钾。
步骤(2)亲和柱层析步骤中，所用层析柱直径为体积为50L；以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点。
步骤5)中，所述微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
步骤6)中，所述加辅料冻干的具体步骤如下：辅料用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，控制无菌滤液的效价在360单位/mg以上，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
所述冻干的工艺条件如下：将产品在零下20～50℃温度下预冻5～8小时(视盘中液量而定)，将导热油以10℃/小时的速度升至35～40℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华，当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。
所述辅料选自乳糖、甘露醇、明胶或右旋糖苷中的一种或多种。
步骤(1)和(2)中，调整pH均采用6mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液。
进一步的，将制备得到的胰激肽原酶进行包装，胰激肽原酶粉碎后，过80目筛，装入密闭容器中，加盖密封。
本发明的有益效果：
(1)本发明所采用的Amino acids-Sepharose亲和层析偶联固定相，为氨基酸与凝胶载体通过化学键结合而成，具有配基分子量小，无空间阻隔，易于与大分子的胰激肽原酶亲合，达到亲合面积大、亲和专一的作用。产品的效价和收率得到极大的提高。
(2)本发明所采用的Amino acids-Sepharose亲和层析偶联固定相，亲和吸附率高，层析即可提纯产品95％以上，杂质去除彻底。产品纯化步骤简化，一步即能满足要求。
(3)本发明所采用的Amino acids-Sepharose亲和层析偶联固定相，采用化学键结合，结合牢固，可反复使用300～500次以上，使用过程仅有微量脱落，并且氨基酸配基使用过程脱落亦对人体无损害，是人体所必需的氨基酸，对人体无抑制和拮抗作用。
(4)本发明制备的胰激肽原酶纯度高达95％以上，效价增加360单位/mg以上，比活达到920单位/mg蛋白以上，产品收率在90.0％以上，可直接作为注射剂的原料药进行应用。
需要说明的是，能够用于亲和层析的偶联固定相的种类有多种，现有技术中对于胰激肽原酶的纯化方法也各有不同，本发明的申请人经过无数次的实验后发现，以Amino acids–Sepharose作为亲和层析偶联固定相用于胰激肽原酶的纯化，其纯化效果极为显著，制备得到的胰激肽原酶比活最高可达1010单位/mg蛋白，效价增加360单位/mg以上，与申请人之前的纯化工艺相比，胰激肽原酶的效价提高了414.28％以上，比活提高了66.7％。与现有技术的常规纯化方法相比胰激肽原酶的效价提高了554.54％以上。而且，制备产品的安全性也得到了较大提高，取得了意想不到的技术效果。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：胰激肽原酶的制备
(1)配制：配制浓度为25％(g/ml)的硫酸铵平衡液，调整pH为4.0；配制浓度为20％(g/ml)的氯化铵洗脱液，调整pH为6.0，检测溶液的电导值；
(2)亲和柱层析：
1)平衡：将Arginine–Sepharose亲和层析偶联固定相填入直径为体积为50L的层析柱中，用步骤(1)配制的pH4.0、浓度25％(g/ml)的硫酸铵平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；
2)进样：调整胰激肽原酶粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于平衡液电导值(以无机盐或水调整电导值)，根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上样；
3)洗涤：用pH4.0、25％(g/ml)浓度的硫酸铵平衡液冲洗柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至流出液的吸收值低于0.5时停止；
4)洗脱：用pH6.0、20％(g/ml)浓度的氯化铵洗脱液洗脱柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液；以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点，收集浓液体积约为30～50L。
5)除菌：收集液用0.22μm微孔滤膜的过滤器进行除菌过滤；
6)冻干：根据浓缩液的效价加入辅料明胶，控制成品的效价在360单位/mg以上，计算辅料明胶的用量，分别用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
冻干工艺条件如下：将产品在零下30℃温度下预冻5～8小时(视盘中液量)，将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华。当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。即得胰激肽原酶，纯度97.04％，效价367.8单位/mg，比活1010单位/mg蛋白，收率90.8％。
7)包装：将冻干好的成品混合均匀后粉碎，并过80目筛装入密闭容器中，加盖密封即得。
其中，胰激肽原酶粗品液的制备方法为：胰脏粉或胰脏加20倍量纯化水溶解提取，搅拌均匀后用氨水调整pH为7.0～8.0，静置沉淀进行粗提纯，零下5℃以下冷冻静置沉淀，虹吸上清液，下层沉淀压滤得粗品液，总效价3870万单位。
Arginine–Sepharose亲和层析偶联固定相制备方法为：
①将Sepharose用10倍量纯化水溶涨，加入质量浓度为3％的硫酸溶液，3％硫酸溶液用量为Sepharose湿重的30％，搅拌均匀；
②向步骤①搅拌均匀后的溶液中滴加质量浓度为5％硝酸钠溶液，5％硝酸钠溶液用量为Sepharose湿重的40％，搅拌，放置30分钟，水洗涤；
③将精氨酸(Arginine)用纯化水溶解，10％浓度溶液用量为10％，缓缓滴加到上述Sepharose上，搅拌均匀；
④用碳酸钠溶液调整pH值至5.0～7.0，放置3小时，抽滤，纯化水洗至中性，即得。
制备得到的Arginine–Sepharose亲和层析偶联固定相的结合率为88％，亲和吸附率为96.2％。
实施例2：胰激肽原酶的制备
(1)配制：配制浓度为30％(g/ml)浓度的硫酸铵平衡液，调整pH为4.0；配制浓度为20％(g/ml)的氯化钠洗脱液，调整pH为6.0，检测溶液的电导值；
(2)亲和柱层析：
1)平衡：将Lysine–Sepharose亲和层析偶联固定相填入直径为体积为50L的层析柱中，用步骤(1)配制的pH4.0、浓度30％(g/ml)的硫酸铵平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；
2)进样：调整胰激肽原酶粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于平衡液电导值(以无机盐或水调整电导值)，根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上样；
3)洗涤：用pH4.0、30％(g/ml)浓度的硫酸铵平衡液冲洗柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至流出液的吸收值低于0.5时停止；
4)洗脱：用pH6.0、20％(g/ml)浓度的氯化钠洗脱液洗脱柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液；以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点，收集浓液体积约为30～50L。
5)除菌：收集液用0.22μm微孔滤膜的过滤器进行除菌过滤；
6)冻干：根据浓缩液的效价加入辅料明胶，控制成品的效价在360单位/mg以上，计算辅料明胶的用量，分别用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
冻干工艺条件如下：将产品在零下20～50℃温度下预冻5～8小时(视盘中液量)，将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华。当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。即得胰激肽原酶，纯度95.75％，效价371单位/mg，比活928单位/mg蛋白，收率91％。
7)包装：将冻干好的成品混合均匀后粉碎，并过80目筛装入密闭容器中，加盖密封即得。
其中，胰激肽原酶粗品液的制备方法同实施例1，制备得到的粗品液中总效价3840万单位。
Lysine–Sepharose亲和层析偶联固定相制备方法为：
①将Sepharose用5倍量纯化水溶涨，加入质量浓度为5％的硫酸溶液，5％硫酸溶液用量为Sepharose湿重的50％，搅拌均匀；
②向步骤①搅拌均匀后的溶液中滴加质量浓度为3％硝酸钠溶液，3％硝酸钠溶液用量为Sepharose湿重的30％，搅拌，放置30分钟，洗涤；
③将赖氨酸(Lysine)用纯化水溶解，10％浓度溶液用量为6％，缓缓滴加到上述Sepharose上，搅拌均匀；
④用碳酸钠溶液调整pH值至5.0～7.0，放置3小时，抽滤，纯化水洗至中性，即得。
制备得到的Lysine–Sepharose亲和层析偶联固定相的结合率为85％，亲和吸附率为95.3％。
实施例3：胰激肽原酶的制备
(1)配制：配制浓度为20％(g/ml)浓度的硫酸铵平衡液，调整pH为4.0；配制浓度为30％(g/ml)的氯化钠洗脱液，调整pH为6.0，检测溶液的电导值；
(2)亲和柱层析：
1)平衡：将Histidine–Sepharose亲和层析偶联固定相填入直径为体积为50L的层析柱中，用步骤(1)配制的pH4.0、浓度20％(g/ml)的硫酸铵平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；
2)进样：调整胰激肽原酶粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于平衡液电导值(以无机盐或水调整电导值)，根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上样；
3)洗涤：用pH4.0、20％(g/ml)浓度的硫酸铵平衡液冲洗柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至流出液的吸收值低于0.5时停止；
4)洗脱：用pH6.0、30％(g/ml)浓度的氯化钠洗脱液洗脱柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液；以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点，收集浓液体积约为30～50L。
5)除菌：收集液用0.22μm微孔滤膜的过滤器进行除菌过滤；
6)冻干：根据浓缩液的效价加入辅料明胶，控制成品的效价在360单位/mg以上，计算辅料明胶的用量，分别用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
冻干工艺条件如下：将产品在零下20～50℃温度下预冻5～8小时(视盘中液量)，将导热油以10℃/小时的速度升至40℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华。当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。即得胰激肽原酶，纯度95.33％，效价375单位/mg，比活975单位/mg蛋白。收率90.8％。
7)包装：将冻干好的成品混合均匀后粉碎，并过80目筛装入密闭容器中，加盖密封即得。
其中，胰激肽原酶粗品液的制备方法同实施例1，制备得到的粗品液中总效价3960万单位。
Histidine–Sepharose亲和层析偶联固定相制备方法为：
①将Sepharose用纯化水溶涨，加入质量浓度为5％的硫酸溶液，5％硫酸溶液用量为Sepharose湿重的30％，搅拌均匀；
②向步骤①搅拌均匀后的溶液中滴加质量浓度为3％硝酸钠溶液，3％硝酸钠溶液用量为Sepharose湿重的60％，搅拌，放置30分钟，洗涤；
③将组氨酸(Histidine)用纯化水溶解，10％浓度溶液用量为8％，缓缓滴加到上述Sepharose上，搅拌均匀；
④用碳酸钠溶液调整pH值至5.0～7.0，放置3小时，抽滤，纯化水洗至中性，即得。
制备得到的Histidine–Sepharose亲和层析偶联固定相的结合率为90.6％，亲和吸附率为95.79％。
实施例4：胰激肽原酶的制备
(1)配制：配制浓度为20％(g/ml)浓度的硫酸钠平衡液，调整pH为4.0；配制浓度为25％(g/ml)的氯化钠洗脱液，调整pH为6.0，检测溶液的电导值；
(2)亲和柱层析：
1)平衡：将Arginine–Sepharose亲和层析偶联固定相填入直径为体积为50L的层析柱中，用步骤(1)配制的pH4.0、浓度20％(g/ml)浓度的硫酸钠平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；
2)进样：调整胰激肽原酶粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于平衡液电导值(以无机盐或水调整电导值)，根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上样；
3)洗涤：用pH4.0、20％(g/ml)浓度的硫酸钠平衡液冲洗柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至流出液的吸收值低于0.5时停止；
4)洗脱：用pH6.0、25％(g/ml)浓度的氯化钠洗脱液洗脱柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液；以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点，收集浓液体积约为30～50L。
5)除菌：收集液用0.22μm微孔滤膜的过滤器进行除菌过滤；
6)冻干：根据浓缩液的效价加入辅料明胶，控制成品的效价在360单位/mg以上，计算辅料明胶的用量，分别用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
冻干工艺条件如下：将产品在零下20～50℃温度下预冻5～8小时(视盘中液量)，将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华。当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。即得胰激肽原酶，纯度95.23％，效价373单位/mg，比活925单位/mg蛋白，收率90.7％。
7)包装：将冻干好的成品混合均匀后粉碎，并过80目筛装入密闭容器中，加盖密封即得。
其中，胰激肽原酶粗品液的制备方法同实施例1，制备得到的粗品液中总效价3970万单位。
实施例5：胰激肽原酶的制备
(1)配制：配制浓度为30％(g/ml)浓度的硫酸钠平衡液，调整pH为4.0；配制浓度为20％(g/ml)浓度的氯化铵洗脱液，调整pH为6.0，检测溶液的电导值；
(2)亲和柱层析：
1)平衡：将Histidine–Sepharose亲和层析偶联固定相填入直径为体积为50L的层析柱中，用步骤(1)配制的pH4.0、浓度30％(g/ml)浓度的硫酸钠平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；
2)进样：调整胰激肽原酶粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于平衡液电导值(以无机盐或水调整电导值)，根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上样；
3)洗涤：用pH4.0、30％(g/ml)浓度的硫酸钠平衡液冲洗柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至流出液的吸收值低于0.5时停止；
4)洗脱：用pH6.0、20％(g/ml)浓度的氯化铵洗脱液洗脱柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液；以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点，收集浓液体积约为30～50L。
5)除菌：收集液用0.22μm微孔滤膜的过滤器进行除菌过滤；
6)冻干：根据浓缩液的效价加入辅料明胶，控制成品的效价在360单位/mg以上，计算辅料明胶的用量，分别用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
冻干工艺条件如下：将产品在零下20～50℃温度下预冻5～8小时(视盘中液量)，将导热油以10℃/小时的速度升至35℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华。当制品温度达到30℃时，保温3小时直至完全干燥。即得胰激肽原酶，纯度95.21％，效价372单位/mg，比活923单位/mg蛋白，收率91.1％。
7)包装：将冻干好的成品混合均匀后粉碎，并过80目筛装入密闭容器中，加盖密封即得。
其中，胰激肽原酶粗品液的制备方法同实施例1，制备得到的粗品液中总效价3790万单位。
实施例6：效果比较：
本发明的工艺制备(实施例1-实施例5)得到的胰激肽原酶均达到纯度95％以上，效价360单位/mg以上，比活920单位/mg蛋白以上，收率90％以上。各项指标均优于专利CN101073666“一种制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法”。与前申请的CN102787111“一种高纯度胰激肽原酶的制备工艺”专利相比较，在效价、比活和收率上均有大幅度提高。与前公开CN1336434胰激肽原酶的制备及其亲和层析纯化方法专利相比较，收率和纯度均优于该专利。比较结果见表1。
表1本发明制备的胰激肽原酶与现有技术制备的胰激肽原酶比较
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明批露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胰激肽原酶的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)配制：配制浓度为20～30％的无机盐平衡液，调整pH为4.0；配制浓度为20～30％的无机盐洗脱液，调整pH为6.0，检测溶液的电导值；配制无机盐平衡液和无机盐洗脱液所用的无机盐均选自硫酸钠、硫酸铵、硫酸钾，硫酸镁、氯化钠或氯化铵中的一种或多种；
(2)亲和柱层析：
1)平衡：将制备的Amino acids－Sepharose亲和层析偶联固定相填入层析柱中，用步骤(1)配制的pH4.0、浓度20～30％的无机盐平衡液平衡，直至进出层析柱的溶液pH值与电导值相同时平衡完毕；
2)进样：调整胰激肽原酶粗品液的pH值与无机盐平衡液一致，粗品液电导值等于平衡液电导值，根据每升填料最大亲和量3000万单位进行上样；
3)洗涤：用pH4.0、浓度20～30％的无机盐平衡液冲洗柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在280nm处的吸收值，冲洗至流出液的吸收值低于0.5时停止；
4)洗脱：用pH6.0、浓度20～30％(g/ml)的无机盐洗脱液洗脱柱子，同时用紫外分光光度计跟踪检测流出液在254nm处的吸收值，收集洗脱液，得收集液；
5)除菌：收集液用微孔滤膜进行除菌过滤，得无菌滤液；
6)冻干：加入辅料进行冻干，即得胰激肽原酶；
步骤1)中，所述Amino acids-Sepharose亲和层析偶联固定相为Arginine–Sepharose，Histidine–Sepharose，或Lysine–Sepharose中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的胰激肽原酶的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述Aminoacids-Sepharose亲和层析偶联固定相的制备方法为：
①将Sepharose用5-10重量倍的纯化水溶涨，加入质量浓度为2％～5％的硫酸溶液，搅拌均匀；2％～5％硫酸溶液加入量为Sepharose湿重的30％～60％；
②向步骤①搅拌均匀后的溶液中滴加质量浓度为3％～6％硝酸钠溶液，3％～6％硝酸钠溶液的加入量为Sepharose湿重的30％～60％，搅拌，放置，水洗涤；
③将组氨酸、精氨酸或赖氨酸用纯化水溶解，得氨基酸水溶液，缓缓滴加到步骤②的Sepharose上，搅拌均匀；氨基酸水溶液的加入量为Sepharose湿重的6％～10％；
④调整pH值至5.0～7.0，放置3～4小时，抽滤，纯化水洗至中性，即得。
3.如权利要求2所述的胰激肽原酶的制备方法，其特征在于，步骤1)③中，氨基酸水溶液的质量浓度为10％。
4.如权利要求2所述的胰激肽原酶的制备方法，其特征在于，步骤1)④中，调整pH值所用的溶液为碳酸钠溶液。
5.如权利要求1所述的胰激肽原酶的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述胰激肽原酶粗品液的制备方法为：取胰脏粉或胰脏，加20～30倍量纯化水溶解提取，搅拌均匀后调整pH为7.0～8.0，静置沉淀进行粗提纯，冷冻静置沉淀，虹吸上清液，下层沉淀压滤得粗品液。
6.如权利要求5所述的胰激肽原酶的制备方法，其特征在于，胰激肽原酶粗品液制备方法的步骤①中，pH调整采用氨水调节，冷冻静置沉淀温度为零下20℃以下，离心转速为大于3000转/分。
7.如权利要求5所述的胰激肽原酶的制备方法，其特征在于，胰激肽原酶粗品液制备方法的步骤②中，草酸盐溶液的组成为：每100ml草酸盐溶液中含1～1.75g的草酸铵，1～1.75g的草酸钾。
8.如权利要求1所述的胰激肽原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)亲和柱层析步骤中，所用层析柱直径为体积为50L；以洗脱液效价大于30单位/cm时为洗脱收集起点，以洗脱液效价小于20单位/cm时为洗脱收集终点。
9.如权利要求1所述的胰激肽原酶的制备方法，其特征在于，步骤7)中，所述加辅料冻干的具体步骤如下：辅料用注射用水加热溶解后过0.22μm微孔滤膜，冷却后加入到无菌滤液中，控制无菌滤液的效价在360单位/mg以上，混合均匀后放入冻干箱中冻干。
10.如权利要求1所述的胰激肽原酶的制备方法，其特征在于，所述冻干的工艺条件如下：将产品在零下20～50℃温度下预冻5～8小时，将导热油以10℃/小时的速度升至35～40℃，真空度前箱保持小于15Pa，使制品升华，当制品温度达到30℃时，保温直至完全干燥。
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