CN101709321A

CN101709321A - 一种燕麦多肽及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN101709321A
Application number: CN200910241723A
Authority: CN
Inventors: 何聪芬; 王昌涛; 董银卯; 赵华; 韩扬
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2009-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2010-05-19
Anticipated expiration: 2029-12-02
Also published as: CN101709321B

Abstract

本发明公开了一种燕麦多肽及其制备方法与应用。该燕麦多肽的制备方法，包括如下步骤：1)将燕麦麸皮与水混合，调节pH为8.5-9.5，在温度为50-60℃条件下，进行超声波预处理；2)在预处理后的液体中加入碱性蛋白酶，在50-60℃下搅拌处理2-5小时；然后，加入风味蛋白酶，在50-60℃下搅拌处理1-2小时；3)将酶解后的液体离心取上清液，在上清液中加入β-葡聚糖酶，中温淀粉酶和糖化酶反应2-4小时，过滤得到澄清液体；将澄清液体用大孔吸附树脂吸附纯化得到含燕麦多肽的溶液。该燕麦多肽具有抑制ACE酶的活性，可以广泛应用于降压保健食品等领域。本发明方法操作简单，具有较高的纯度和得率。

Description

一种燕麦多肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种燕麦多肽及其制备方法与应用，特别涉及一种燕麦多肽及其制备方法与其在制备抑制ACE活性和降血压的食品或药物中的应用。

背景技术

燕麦，禾本科燕麦族燕麦属，一年生或多年生草本植物。燕麦营养价值丰富而全面，其蛋白质、脂肪、维生素E、膳食纤维以及钙、镁、铁、磷等矿物元素含量均高于其它谷类作物，具有降血脂、降低胆固醇、降血压、降血糖和抗氧化性等多种生物活性功能。

血管紧张素转化酶(Angiotensin-I-convertingen enzyme，ACE，EC 3.4.15.1)是一种含锌二肽羧酶，广泛分布于哺乳动物组织中并对其血压调节起着关键性的作用。ACE在人体肾素-血管紧张素系统(Renin angiotensin system，RAS)和激肽-激肽生成酶系统(Kallikerni-kinin system，KKS)中，对血压调节起着重要的作用，具体调节机理如图1所示。因此通过抑制体内ACE活性来达到治疗高血压的目的是一条非常重要的途径。

近年来，一些具有特定生理活性的短肽，如ACE抑制肽、阿片肽、免疫调节肽等引起了人们的极大关注，这些肽具有安全性高，无副作用、来源广泛等优点。植物蛋白以其不可替代的优点成为人们研究活性肽的主要来源。燕麦降压肽即是从燕麦蛋白中得到的一种活性多肽。燕麦麸皮是燕麦加工过程中的副产物，其中蛋白质含量很高，目前国内外对燕麦麸皮的研究主要集中在膳食纤维方面，对燕麦麸皮蛋自身的利用很少。

发明内容

本发明的目的是提供一种燕麦多肽及其制备方法与其应用。

本发明所提供的燕麦多肽的制备方法，包括如下步骤：

1)预处理：将燕麦麸皮与水混合，调节pH为8.5-9.5，在温度为50-60℃条件下，进行超声波预处理；

2)酶处理：在经过步骤1)预处理后的液体中加入碱性蛋白酶，在50-60℃下搅拌处理2-5小时；然后，加入风味蛋白酶，在50-60℃下搅拌处理1-2小时；

3)燕麦降压肽的纯化：将步骤2)酶解后的液体离心取上清液，在上清液中加入β-葡聚糖酶，中温淀粉酶和糖化酶反应2-4小时，过滤得到澄清液体；将澄清液体用大孔吸附树脂吸附纯化得到含燕麦多肽的溶液。

所述步骤1)中，所述超声预处理时间为30-50min；所述超声预处理的超声波频率50kHz，功率176W。所述燕麦麸皮的大小为20-60目；所述燕麦麸皮∶水的重量比为1∶8-1∶12。

所述步骤2)中，所述碱性蛋白酶的添加量为10000-70000U/g燕麦麸皮，优选为50000U/g燕麦麸皮；所述风味蛋白酶的添加量为5000-15000U/g燕麦麸皮，优选为10000U/g燕麦麸皮。所述碱性蛋白酶和所述风味蛋白酶可为四川新星化工有限公司产品，所述中温淀粉酶可为湖北楚轩化工制造有限公司产品。

所述步骤3)中，所述大孔吸附树脂吸附纯化的步骤包括将所述澄清液体加入到以打孔吸附树脂为填料的吸附柱中，然后用去离子水冲洗至洗脱液中没有糖分和盐分，最后用乙醇溶液洗脱得到含燕麦多肽的溶液。所述大孔吸附树脂为DA201-C吸附树脂；所述乙醇溶液的体积百分比浓度为50％-75％。所述澄清液体优选按照DA201-C吸附树脂的2倍体积加入到柱中；所述乙醇溶液添加的体积优选为柱体积的2倍

所述步骤3)中，β-葡聚糖酶的用量为15000-70000U/g燕麦麸皮，中温淀粉酶的用量为125-500U/g燕麦麸皮，糖化酶的用量为500-2000U/g燕麦麸皮；所述过滤的滤径为0.5-0.8μm。

上述方法中，还包括将含燕麦多肽溶液旋转蒸发浓缩至固含物为20％(可溶性固形物含量)以上，冷冻干燥得到燕麦多肽干粉。

上述的方法制备的燕麦多肽即本发明所要保护的燕麦多肽。

本发明的方法将燕麦麸皮用单频超声波处理辅助酶法降解燕麦麸皮蛋白成为燕麦多肽，通过板框过滤、树脂吸附等手段将其分离提纯，所得燕麦降压肽89％的分子量在1500Da以下，具有抑制ACE的活性，可以广泛应用于降压保健食品或制备降压药物等领域。

附图说明

图1为血管紧张素转化酶对血压的调节机理图

图2为本发明制备燕麦多肽的工艺流程图；

图3为75％乙醇洗脱纯化燕麦降压肽的曲线。

图4为本发明制备的燕麦多肽相对分子量的分布

图5为本发明制备的燕麦多肽(超声处理)与ACE抑制肽活性比较图；

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、燕麦降压肽的制备

一、燕麦降压肽的制备

提取燕麦降压肽的工艺流程图如图2所示，具体步骤如下：

1、燕麦麸皮处理：

为了更多获得燕麦降压肽，燕麦麸皮选用20目到60目之间的成分(可以粉碎)，凯氏定氮法测定其中蛋白含量可达25％。

2、预处理：

将80g步骤1所述20目到60目的燕麦麸皮与去离子水按重量比1∶8混合，调pH值到9.0，在55℃水浴中进行超声波预处理(超声波频率50kHz，功率176W)，处理时间为40min。

3、酶处理：

预处理后测定液体pH值至8.0-8.5，加入碱性蛋白酶(购自四川新星化工有限公司，比活力为50万U/g)，添加量为50000U/g燕麦麸皮。在温度55℃条件下，继续搅拌加温2小时；然后加入风味蛋白酶(四川新星化工有限公司，比活力为50万U/g)，添加量为10000U/g燕麦麸皮，在55℃继续搅拌加温1小时。

4、将步骤3酶解后的液体在4000rpm下离心10分钟取上清液，在上清液中加入β-葡聚糖酶(购自银川和氏璧生物技术有限公司，添加量为35000U/g燕麦麸皮)，中温淀粉酶(购自湖北楚轩化工制造有限公司，添加量为250U/g燕麦麸皮)和糖化酶(购自青岛北方霞光食品配料有限公司，添加量为1000U/g燕麦麸皮)反应3小时，利用板框过滤机(滤径为0.5-0.8μm)过滤，加入硅藻土助滤，得到棕色澄清液体。

5、将步骤4得到的澄清液体按照2∶1倍体积加入到装有DA201-C吸附树脂的吸附柱中，用去离子水冲洗至洗脱液没有糖分和盐分。再用75％(体积百分含量)的乙醇水溶液洗脱，接收洗脱液体积为柱体积的2倍，吸附树脂洗脱曲线如图3所示。旋转蒸发浓缩至固含物(可溶性固形物含量)到20％，冷冻干燥得10g燕麦降压肽。

二、燕麦肽的分子量分析

将步骤一获得的燕麦降压肽的相对分子量分布测定，采用HPLC法，测定色谱条件：安捷仑高效液相色谱仪1100；色谱柱：TSKge12000 SWXL体积排阻色谱柱(300mm×7.8mm)；流动相：乙腈/冰醋酸/三氟乙酸：45/55/0.1(v/v/v)；检测：UV220nm；流速：0.5ml/min；柱温：30℃。结果表明如图4所示，95％的多肽分子量在1500Da以下，是较好的ACE抑制肽源。

实施例2、燕麦降压肽的制备

一、燕麦降压肽的制备

提取燕麦降压肽的工艺流程图如图2所示，具体步骤如下：

1、燕麦麸皮处理：

2、预处理：

将80g步骤1所述20目到60目的燕麦麸皮与去离子水按重量比1∶10混合，调pH值到9.5，在50℃水浴中进行超声波预处理(超声波频率50kHz，功率176W)，处理时间为50min。

3、酶处理：

预处理后测定液体pH值至8.5，加入碱性蛋白酶(购自四川新星化工有限公司，比活力为50万U/g)，添加量为10000U/g燕麦麸皮。在温度60℃条件下，继续搅拌加温5小时；然后加入风味蛋白酶(购自四川新星化工有限公司，比活力为50万U/g)，添加量为15000U/g燕麦麸皮，在60℃继续搅拌加温1小时。

4、将步骤3酶解后的液体在4000rpm下离心10分钟取上清液，在上清液中加入β-葡聚糖酶(购自银川和氏璧生物技术有限公司，添加量为35000U/g燕麦麸皮)，中温淀粉酶(购自湖北楚轩化工制造有限公司，添加量为250U/g燕麦麸皮)和糖化酶(购自青岛北方霞光食品配料有限公司，添加量为1000U/g燕麦麸皮)反应4小时，利用板框过滤机(滤径为0.5-0.8μm)过滤，加入硅藻土助滤，得到棕色澄清液体。

5、将步骤4得到的澄清液体按照2∶1倍体积加入到装有DA201-C吸附树脂的吸附柱中，用去离子水冲洗至洗脱液没有糖分和盐分。再用75％(体积百分含量)的乙醇水溶液洗脱，接收洗脱液体积为柱体积的2倍。旋转蒸发浓缩至固含物(可溶性固形物含量)到20％，冷冻干燥得10g燕麦降压肽。

二、燕麦肽的分子量分析

将步骤一获得的燕麦降压肽的相对分子量分布测定，采用HPLC法，测定色谱条件：安捷仑高效液相色谱仪1100；色谱柱：TSKge12000 SWXL体积排阻色谱柱(300mm×7.8mm)；流动相：乙腈/冰醋酸/三氟乙酸：45/55/0.1(v/v/v)；检测：UV220nm；流速：0.5ml/min；柱温：30℃。结果表明，85％的多肽分子量在1500Da以下，是较好的ACE抑制肽源。

实施例3、燕麦降压肽的制备

一、燕麦降压肽的制备

提取燕麦降压肽的工艺流程图如图2所示，具体步骤如下：

1、燕麦麸皮处理：

2、预处理：

将80g步骤1所述20目到60目的燕麦麸皮与去离子水按重量比1∶12混合，调pH值到8.5，在50℃水浴中进行超声波预处理(超声波频率50kHz，功率176W)，处理时间为30min。

3、酶处理：

预处理后测定液体pH值至8.0，加入碱性蛋白酶(购自四川新星化工有限公司，比活力为50万U/g)，添加量为70000U/g燕麦麸皮。在温度50℃条件下，继续搅拌加温3小时；然后加入风味蛋白酶(购自四川新星化工有限公司，比活力为50万U/g)，添加量为5000U/g燕麦麸皮，在50℃继续搅拌加温2小时。

4、将步骤3酶解后的液体在4000rpm下离心10分钟取上清液，在上清液中加入β-葡聚糖酶(购自银川和氏璧生物技术有限公司，添加量为35000U/g)，中温淀粉酶(购自湖北楚轩化工制造有限公司，添加量为250U/g U/g燕麦麸皮)和糖化酶(购自青岛北方霞光食品配料有限公司，添加量为1000U/g U/g燕麦麸皮)反应2小时，利用板框过滤机(滤径为0.5-0.8μm)过滤，加入硅藻土助滤，得到棕色澄清液体。

二、燕麦肽的分子量分析

将步骤一获得的燕麦降压肽的相对分子量分布测定，采用HPLC法，测定色谱条件：安捷仑高效液相色谱仪1100；色谱柱：TSKge12000 SWXL体积排阻色谱柱(300mm×7.8mm)；流动相：乙腈/冰醋酸/三氟乙酸：45/55/0.1(v/v/v)；检测：UV220nm；流速：0.5ml/min；柱温：30℃。结果表明，80％的多肽分子量在1500Da以下，是较好的ACE抑制肽源。

实施例4、本发明燕麦降压肽抑制ACE活性的实验

将实施例1-3制备的燕麦降压肽进行ACE抑制活性的测定，参照Cushman等的方法略有改动，具体方法如下所述：

取5mmol/L HCl溶液80μl(pH8.3，含0.3mol/L NaCl)分别与40μl实施例1、实施例2或实施例3制备的燕麦降压肽混合，37℃水浴预热5min后，分别加入0.1U/mlACE(血管紧张素转化酶，Sigma公司)溶液10μl，继续37℃水浴30min，随后加入1mol/L HCl溶液200μl终止反应，再加入1.2ml乙酸乙酯均匀混合15s，以萃取反应体系中的马尿酸。离心(4000rpm)10min后分别取出0.9ml酯层溶液转入另一试管中，80℃烘干，并重新溶于2ml去离子水中在228nm处测定吸光度。

ACE抑制率如下式计算：

ACE抑制率(％)＝(OD_b-OD_a)/(OD_b-OD_c)×100％

OD_a——ACE及ACE抑制肽都存在条件下的吸光度；

OD_b——不存在ACE抑制肽条件下的吸光度；

OD_c——ACE不参与反应条件下的吸光度。

水浴处理：按照与实施例1所述方法，在步骤2所述的预处理步骤将燕麦麸皮液在水浴中震荡摇匀，替代超声处理，温度、时间相同，其余步骤同实施例1，得到燕麦降压肽，作为水浴对照。

超声处理酶解液：按照与实施例1所述方法，但是将预处理的步骤中的超声处理步骤去除，将步骤3的酶处理步骤中加入碱性蛋白酶后直接进行超声处理，超声处理的时间为2小时40分钟，温度与酶解温度相同，其余的步骤同实施例1，得到燕麦降压肽，作为超声处理酶解液。

结果表明实施例1、实施例2或实施例3制备的燕麦降压肽的ACE抑制率远高于水浴组，超声处理酶解液组，其中实施例1制备的燕麦降压肽(图5中超声波辅助酶解)的ACE抑制率结果如图5所示。

蛋白质水解度测定方法：甲醛滴定法。

DH％＝h/h_tot×100％

其中，h即是蛋白质水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔数(mmol/g蛋白质)，而h_tot则是指每克原料蛋白中肽键的毫摩尔数。

实验结果表明，超声辅助酶解的蛋白质水解度高于水浴和超声处理酶解液，说明超声辅助酶解处理后游离氨基酸的释放效果越好。

IC₅₀即ACE抑制率为50％时的多肽浓度，将冷冻干燥得到的燕麦降压肽配成不同浓度，测定其ACE抑制率，以抑制率为纵坐标(％)，以log(多肽浓度)为横坐标绘制曲线，通过回归分析等到回归方程用于计算IC₅₀。

IC₅₀是客观评价ACE抑制肽活性强弱的常用指标，通过对实施例1、实施例2或实施例3制备的燕麦降压肽的IC₅₀的测定，其中，实施例1制备的燕麦降压肽IC₅₀值为0.291mg/ml，与已报道的其它食物蛋白源ACE抑制肽，如牛血浆蛋白(IC₅₀＝0.56mg/ml)，虾蛋白(IC₅₀＝0.98mg/ml)等相比，表明本发明的燕麦降压肽具有较强的ACE抑制活性，这说明施例1、实施例2或实施例3制备的燕麦降压肽具有更好的降血压能力。

Claims

1.一种制备燕麦多肽的方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述超声预处理时间为30-50min；所述超声预处理的超声波频率50kHz，功率176W。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述燕麦麸皮的大小为20-60目；所述燕麦麸皮∶水的重量比为1∶8-1∶12。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述碱性蛋白酶的添加量为10000-70000U/g燕麦麸皮，优选为50000U/g燕麦麸皮；所述风味蛋白酶的添加量为5000-15000U/g燕麦麸皮，优选为10000U/g燕麦麸皮。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述大孔吸附树脂吸附纯化的步骤包括将所述澄清液体加入到以打孔吸附树脂为填料的吸附柱中，然后用去离子水冲洗至洗脱液中没有糖分和盐分，最后用乙醇溶液洗脱得到含燕麦多肽的溶液。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，β-葡聚糖酶的用量为15000-70000U/g燕麦麸皮，中温淀粉酶的用量为125-500U/g燕麦麸皮，糖化酶的用量为500-2000U/g燕麦麸皮；所述过滤的滤径为0.5-0.8μm。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂为DA201-C吸附树脂；所述乙醇溶液的体积百分比浓度为50％-75％。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括将含燕麦多肽溶液旋转蒸发浓缩至可溶性固形物含量为20％以上，冷冻干燥得到燕麦多肽干粉。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法制备的燕麦多肽。

10.权利要求9所述的燕麦多肽在制备降血压药物或降血压保健食品中的应用。