CN108484723A

CN108484723A - 浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108484723A
Application number: CN201810053075.4A
Authority: CN
Inventors: 徐年军; 孙雪; 徐晓婷; 操德群; 李亚鹤; 胡朝阳
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-01-19
Also published as: CN108484723B

Abstract

本发明公开了浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用，特点是抑制肽的氨基酸序列为SEQ ID NO1：Phe‑Gly‑Met‑Pro‑Leu‑Asp‑Arg和/或SEQ ID NO 2：Met‑Glu‑Leu‑Val‑Leu‑Arg，其制备方法包括制备浒苔粗蛋白的步骤；在浒苔粗蛋白溶液中添加胰蛋白酶酶解得到酶解产物的步骤；将酶解产物进行超滤分离后凝胶层析，收集含ACE抑制肽的第3个吸收峰组分的步骤；将含ACE抑制肽的组分进行凝胶层析，再采用高效液相色谱进行分离，收集含ACE抑制肽的第8个吸收峰组分得到抑制肽，优点是具有很强的降血压活性，安全性高，无毒副作用，易被人体吸收。

Description

浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法，尤其是涉及从大型海洋绿藻浒苔中分离纯化得到的具有血管紧张素转化酶 (ACE) 抑制活性的海洋功能多肽及其制备方法和应用。

背景技术

血管紧张素转化酶 (Angiotensin converting enzyme，ACE) 是一种锌金属蛋白酶，是肾素-血管紧张素系统中重要的蛋白酶之一。对人体血压调节有着重要的作用，通过作用于血管紧张素I的末端去掉His-Leu生成血管紧张素Ⅱ，它能够使动脉血管平滑肌收缩，迅速引起血压上升。抑制 ACE 活性是一种使血压下降的有效方法。当前治疗高血压的药物大多是化学合成品，存在一些不良反应，如咳嗽、味觉功能紊乱及皮疹等副作用。天然食源性ACE 抑制肽具有安全性高、毒副作用小等优点，是新一代降压药物研发的重要方向。

食品来源的 ACE 抑制剂由于其原料易得，一直受到人们的关注。海洋动物蛋白来源的降压肽也有报道，但海藻来源的ACI抑制剂还非常少，主要报道有刘淑集等利用坛紫菜(Porphyra)制备 ACE 抑制肽，其 IC₅₀值为0.67 mg/mL，其多肽氨基酸结构也不确定（食品科学，2011，32(2) ：213）；高冬芳等利用螺旋藻（Spirulina）制备 ACE 抑制肽，其 IC₅₀值为74.6μg/mL，但具体结构未知(食品科学，2011，32(7) ：7)；。宁波大学从海洋微藻球等鞭金藻（Isochrysis）中分离纯化出的ACE降压肽，其结构为Tyr--Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys（专利名称：一种海洋微藻来源的血管紧张素转化酶抑制肽，ZL201410172674.X），但是针对海藻来源的ACE抑制肽还比较少，很多由于多肽的一级结果无法确定，无法进一步应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有很强的降血压活性，安全性高，无毒副作用，易被人体吸收的浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽，所述的抑制肽的氨基酸序列为 SEQ ID NO1：Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg（FGMPLDR）和/或SEQ ID NO 2：Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg（MELVLR）。

上述浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）浒苔蛋白的制备：将新鲜浒苔按质量比1：3的比例加入到浓度为2.0wt%的氯化钠溶液中，捣碎后反复冻融，超声波提取，浸提过夜，8000r/min离心15min后；取上清液加入硫酸铵沉淀浓缩，离心后取沉淀复溶于蒸馏水，过0.45μm滤膜后用截留分子量为3500Da的透析袋于冰箱中避光透析48h，透析液冷冻干燥后得到浒苔粗蛋白，避光保存；

（2）酶解：将步骤（1）得到的浒苔粗蛋白溶于水中配制成浓度为10-20g/mL的浒苔粗蛋白溶液，在浒苔粗蛋白溶液中添加浒苔粗蛋白质量2-6wt%的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶或碱性蛋白酶进行水解，在pH为7.5-9.0，温度为22-42℃的条件下进行酶解，酶解时间为3-6h，酶解充分后100℃灭酶活15min，冰浴上冷却，于4℃，8000r/min冷冻离心15min，取上清液过0.45μm滤膜后，冷冻干燥得到酶解产物冻干粉；

（3）分离：将步骤（2）得到的酶解产物冻干粉溶于水后配制成浓度为40mg/mL的上样液，用3000 Da的超滤离心管进行超滤分离，将得到的MW＜3000Da组分进行Sephadex G-25凝胶层析，340nm下检测肽的出峰位置，收集含ACE抑制肽的第3个吸收峰组分；

（4）纯化和鉴定：将步骤（3）得到的含ACE抑制肽的组分进一步进行Sephadex G-15凝胶层析，340nm下检测肽的出峰位置，收集含ACE抑制肽的第2个吸收峰组分；进一步采用高效液相色谱进行分离，收集含ACE抑制肽的第8个吸收峰组分，进一步对该组分进行LC-MS分离和De-Novo测序鉴定，得到两个纯的有较强ACE抑制活性的化合物，即浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽，其氨基酸序列为 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

步骤（2）具体为：将步骤（1）得到的浒苔粗蛋白溶于水中配制成浓度为15g/mL的浒苔粗蛋白溶液，在浒苔粗蛋白中添加浒苔粗蛋白质量4wt%的胰蛋白酶进行水解，在pH为8.0，温度为32℃的条件下进行酶解，酶解时间为5h，酶解充分后100℃灭酶活15min，冰浴上冷却，于4℃，8000r/min冷冻离心15min，取上清液过0.45μm滤膜，得到酶解产物。

步骤（3）中Sephadex G-25凝胶层析上样液用量为1 mL，洗脱流速为0.25 mL·min^-1。

步骤（4）中液相色谱条件为：色谱柱InertsilODS-3 C18 (10×250 mm)，流动相A：含0.1%TFA的蒸馏水；流动相B：100%乙腈（含0.1%TFA）；洗脱条件：用流动A和B梯度洗脱65min（0-65min，0-50%B），流速1.5mL/min，检测波长220nm。

上述浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽在制备血管紧张素转化酶抑制剂方面的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开浒苔来源的两个血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法，该多肽是从一种海洋大型绿藻浒苔（Ulva intestinalis）中分离得到，这种大型绿藻是自然界生长的，每年在浙江宁波象山港沿海1-4月份大量繁殖，在6-9月份在青岛等地北方海域大量爆发，资源量非常丰富。获得的两个新结构的ACI抑制肽，其结构为Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg（FGMPLDR，No.1)和Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg（MELVLR，No.2)，分子量分别为834.41和759.43，对应的IC₅₀分别为219.35μM和236.85μM。食品来源的血管紧张素转化酶抑制剂的作用并非直接对血管起到降压作用，而是通过增加ACE2基因的表达，促进血管舒张达到降低血压的作用。

综上所述，本发明从大型海藻浒苔中提取纯化出来的ACE抑制活性的多肽，具有很强的降血压活性，安全性高，无毒副作用，化合物分子量小易被人体吸收，而且来源广泛，具有重要的市场价值和应用前景。

附图说明

图1 为不同酶胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和碱性蛋白酶等水解产物对ACE抑制率的影响；

图2 为不同酶解pH对浒苔粗蛋白ACE抑制率的影响；

图3 为不同酶解温度对浒苔粗蛋白ACE抑制率的影响；

图4 为不同底物浓度对浒苔粗蛋白ACE抑制率的影响；

图5 为不同酶底比（E/S）对浒苔粗蛋白ACE抑制率的影响；

图6 为不同酶解时间对浒苔粗蛋白ACE抑制率的影响；

图7为两个血管紧张素转化酶抑制肽的体内实验效果图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

1、具体实施例

浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽，该抑制肽的氨基酸序列为 SEQ ID NO1：Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg（FGMPLDR）和/或SEQ ID NO 2：Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg（MELVLR）。其制备方法包括以下步骤：

（1）浒苔蛋白的制备：将新鲜浒苔按质量比1：3的比例加入到浓度为2.0wt%的氯化钠溶液中，捣碎后反复冻融，超声波提取，浸提过夜，8000r/min离心15min后；取上清液加入硫酸铵沉淀浓缩，离心后取沉淀复溶于蒸馏水，过0.45μm滤膜后用截留分子量为3500Da的透析袋于冰箱中避光透析48h，透析液冷冻干燥后得到浒苔粗蛋白，于﹣20℃下棕色样品瓶中避光保存；

（2）酶解：将步骤（1）得到的浒苔粗蛋白溶于水中配制成浓度为15g/mL的浒苔粗蛋白溶液，在浒苔粗蛋白溶液中添加浒苔粗蛋白质量4wt%的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶或碱性蛋白酶进行水解，在pH为8.0，温度为32℃的条件下进行酶解，酶解时间为5h，酶解充分后100℃灭酶活15min，冰浴上冷却，于4℃，8000r/min冷冻离心15min，取上清液过0.45μm滤膜后，冷冻干燥得到酶解产物冻干粉，﹣20℃下保存；

（3）分离：将步骤（2）得到的酶解产物冻干粉溶于水后配制成浓度为40mg/mL的上样液，取1 mL上样液用3000 Da的超滤离心管进行超滤分离，，洗脱流速为0.25 mL·min^-1，将得到的MW＜3000Da组分进行Sephadex G-25凝胶层析，340nm下检测肽的出峰位置，收集含ACE抑制肽的第3个吸收峰组分；

（4）纯化和鉴定：将步骤（3）得到的含ACE抑制肽的组分进一步进行Sephadex G-15凝胶层析，340nm下检测肽的出峰位置，收集含ACE抑制肽的第2个吸收峰组分；进一步采用高效液相色谱进行分离，收集含ACE抑制肽的第8个吸收峰组分，进一步对该组分进行LC-MS分离和De-Novo测序鉴定，得到两个纯的有较强ACE抑制活性的化合物。其中液相色谱条件为：色谱柱InertsilODS-3 C18 (10×250 mm)，流动相A：含0.1%TFA的蒸馏水；流动相B：100%乙腈（含0.1%TFA）；洗脱条件：用流动A和B梯度洗脱65min（0-65min，0-50%B），流速1.5mL/min，检测波长220nm。

将制备得到的血管紧张素转化酶抑制肽，首先进行了该活性肽的氨基酸成分分析，结果活性肽1主要氨基酸为Phe、Pro、Leu、Gly，也含有Met、Asp和Arg。活性肽2的主要氨基酸为Met、Leu、Arg,也含有Glu和Val等。采用MALDI-TOF-MS/MS分析活性多肽的氨基酸序列分子量分别为834.4175和759.4359，测定氨基酸序列分别为Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg（No.1: FGMPLDR)和Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg（No.2: MELVLR)。对该结构进行了Denovo从头测序分析，结果与上述数据吻合，确认这两条肽链的结构为新型的活性多肽。

（5）ACE抑制率的计算：参考Shalaby等的方法适当修改。将100μL FAPGG（N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine，Sigma公司）与40μL 浒苔蛋白ACE抑制肽溶液混合，在酶标板上37℃下孵育5min，分别加入60 μL ACE溶液，37℃下启动反应，振荡20s，340nm处检测30min。空白对照组为100μLFAPGG 与40μL Tris-H Cl混合，同样操作，分别计算出空白对照组和实验组10-30分钟反应时间关于吸光度的斜率，求出ACE抑制率及IC₅₀值，其中ACE抑制率公式如下：ACE抑制率（%）＝【1－（实验组斜率/对照组斜率）】×100%。

将浒苔分离纯化得到的ACE抑制肽配制成合适的浓度梯度，分别测定各样品对应的ACE抑制率，用Excel拟合出标准曲线和方程，根据拟合曲线计算出IC₅₀。最终活性检测所得到的两个多肽的ACE抑制活性IC₅₀分别为219.35μM和236.85μM。

2、对比试验

对比试验1 ：与具体实施例制备方法基本相同，所不同的是所用的酶不同。分别用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和碱性蛋白酶对浒苔粗蛋白进行酶水解，结果如图1所示，胰蛋白酶水解产物的ACE抑制率最高。

对比试验2：与具体实施例制备方法基本相同，所不同的是酶解pH条件不同，分别设置pH6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，其他固定条件为胰蛋白酶，温度37℃，底物浓度为20mg/mL，酶底比（E/S）为4%，酶解5h后立即在100℃金属浴灭酶活15min，冰浴上冷却，离心15min（4℃、8000r/min），上清液过0.45μm滤膜后﹣80℃冻藏并冷冻干燥，冻干粉﹣20℃下保存。各pH梯度下的浒苔蛋白酶解物配制成2.5mg/ml溶液，测定ACE抑制活性，结果如图2所示，pH为8的酶解条件下，制备得到的浒苔粗蛋白ACE抑制率最高。

对比试验3：与具体实施例制备方法基本相同，所不同的是酶解温度不同，设置不同温度为22℃、27℃、32℃、37℃、42℃和47℃，其他固定条件为胰蛋白酶，pH值为8.0，底物浓度为20mg/mL，酶底比(E/S)为4.0%，酶解5h。结果如图3所示，温度为32℃的酶解条件下，制备得到的浒苔粗蛋白ACE抑制率最高。

对比试验4：与具体实施例制备方法基本相同，所不同的是酶底比不同，底物浓度设置为5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL和30mg/mL，其他固定条件为胰蛋白酶水解，pH值为8.0，温度32℃，酶底比(E/S)为4.0%，酶解5h。结果如图4所示，底物浓度设置为15mg/mL的酶解条件下，制备得到的浒苔粗蛋白ACE抑制率最高。

对比试验5：与具体实施例制备方法基本相同，所不同的是酶底比(E/S)不同，设置酶的添加量为浒苔粗蛋白质量的1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%和6.0%，其他固定条件为胰蛋白酶，pH值为8.0，温度32℃，底物浓度为15mg/mL，酶解5h。结果如图5 所示，采用酶底比(E/S)为4wt%的酶解条件下，制备得到的浒苔粗蛋白ACE抑制率最高。

对比试验6：与具体实施例制备方法基本相同，所不同的是酶解时间不同。酶解时间设置为2.0h、3.0h、4.0h、5.0h、6.0h和7.0h，其他条件固定为胰蛋白酶，pH值为8.0，温度32℃，底物浓度为15mg/mL，酶底比(E/S)为4%。结果如图6 所示，酶解时间为5h的酶解条件下，制备得到的浒苔粗蛋白ACE抑制率最高。

3、应用实施例

将具体实施例制备所获得的浒苔来源的两个降压肽分别灌胃到原发性高血压大鼠(SHR)，检测其对 SHR 血压的影响。实验选用大鼠 96 只，体重 220±20 克，大鼠随机分成4个组，每组 24只。实验设空白对照组 ( 注射等体积生理盐水)、ACE 酶抑制剂给药组（处理组SEQ ID NO1、处理组SEQ ID NO2）和阳性对照组（注射合成降压药卡托普利）。实验温度22℃，空气湿度70％，预饲养 1 周后给药处理。给药剂量为 20 mg/kg，实验时间两周，在第0、2、4、6、8h 测定尾动脉收缩压。结果表明，ACE 抑制肽组和空白对照组相比效果显著 (P<0.05)。对照组的大鼠血压基本稳定在180-190 mmHg，两个实验组和阳性对照组实验大鼠的血压降最低降到 160-165 mHg。结果如图7所示，说明本发明制备的两个血管紧张素转化酶抑制肽具有较好的治疗高血压的效果。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范畴。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg

1 5

Claims

1.浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽，其特征在于：所述的抑制肽的氨基酸序列为SEQ ID NO1：Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg和/或SEQ ID NO 2：Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg。

2.权利要求1所述的浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于步骤（2）具体为：将步骤（1）得到的浒苔粗蛋白溶于水中配制成浓度为15g/mL的浒苔粗蛋白溶液，在浒苔粗蛋白中添加浒苔粗蛋白质量4wt%的胰蛋白酶进行水解，在pH为8.0，温度为32℃的条件下进行酶解，酶解时间为5h，酶解充分后100℃灭酶活15min，冰浴上冷却，于4℃，8000r/min冷冻离心15min，取上清液过0.45μm滤膜，得到酶解产物。

4.根据权利要求2所述的浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）中Sephadex G-25凝胶层析上样液用量为1 mL，洗脱流速为0.25 mL·min^-1。

5.根据权利要求2所述的浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于步骤（4）中液相色谱条件为：色谱柱InertsilODS-3 C18，流动相A：含0.1%TFA的蒸馏水；流动相B：含0.1wt%TFA 的100%乙腈；洗脱条件：用流动A和B梯度洗脱65min，流速1.5mL/min，检测波长220nm。

6.权利要求1-5中任一项所述的浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽在制备血管紧张素转化酶抑制剂方面的应用。