CN104945471B

CN104945471B - 贻贝蛋白降压肽

Info

Publication number: CN104945471B
Application number: CN201510177322.8A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 迟长凤; 赵玉勤; 孙坤来
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: ANHUI SHENGMEINUO BIOLOGY TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2035-04-15
Also published as: CN104945471A

Abstract

本发明公开了一种具有降血压活性的贻贝蛋白降压肽及其制备方法和用途，该降压肽的氨基酸序列为Val‑Ser‑Trp‑Pro‑Cys‑Arg‑Trp（VSWPCRW），ESI‑MS测定分子量为935.07 Da。贻贝经去壳取肉、酶解、超滤、琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和反相高效液相色谱制（RP‑HPLC）纯化，得活性肽Val‑Ser‑Trp‑Pro‑Cys‑Arg‑Trp（VSWPCRW）。本发明制备的活性肽具有显著的血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性，可用于高血压治疗相关的药物。

Description

贻贝蛋白降压肽

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种贻贝蛋白降压肽。

背景技术

血管紧张素转化酶(ACE)又称为肽基-羧基肽酶或者激肽酶Ⅱ，分子量为150,000Da，属血管内皮细胞膜结合酶。ACE可以将十肽的血管紧张素Ⅰ水解成八肽的血管紧张素Ⅱ，促使血管进一步收缩，导致血压升高。同时，ACE也可通过作用于肾上腺皮质而促进醛固酮的分泌。因此，ACE是肾素-血管紧张素-醛固酮(RAS)的重要成分。另外，ACE还可以催化具有降压作用的缓激肽水解而使其失去活性。因此，寻找合适的抑制体内ACE活性的物质，就可以达到降低或者控制血压的目的。

血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)是一类发展迅速的抗高血压药物，其主要通过抑制ACE活性，致使血管紧张素Ⅰ不能转换为血管紧张素Ⅱ，同时抑制ACE对缓激肽的灭活作用，从而产生降压效应。临床上常用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)多为化学药物，如卡托普利(Captopril)、阿拉普利(Alacepril)、赖诺普利(Lisinopril)和福辛普利(Fosinopril)等。但是，此类化学合成药物临床应用过程中出现较多副作用，如粒细胞减少、咳嗽、皮疹、发热和味觉异常等，给患者带来一定痛苦。

目前，ACE抑制活性肽(ACEP)由于其显著的生理活性受到广泛关注，与化学合成的ACEI相比较，ACEP的优点主要体现在：(1)采用食用级蛋白酶水解制备获得，安全性高，毒副作用小，多种ACEP动物实验及临床检验结果，未观察到明显毒副作用；(2)食用蛋白原料来源广，酶解制备条件温和，易于产业化；(3)ACEP降压效果专一，分子量低更易于消化吸收。因此，研究和开发出具有降血压作用的活性肽食品或药物，成为水产品高效利用的一条重要途径。

近年来，磁性微球作为固定化酶载体的研究引起了广泛重视。而采用“乳化复合技术”对琼脂糖进行改性，制备的琼脂糖磁性微球具有以下显著优点：(1)具有磁性，在磁场作用下可迅速进行分离；(2)生物相容性好；(3)表面含有大量功能基团，吸附能力强；(4)分散性和稳定性好。采用琼脂糖磁性微球做载体，制备的磁性微球固定化ACE，在溶液中可与ACEP特异性吸附，在磁场作用下又可以迅速的与酶解液分离。但是，研究者发现目前尚未有利用该技术从贻贝酶解物中制备降压肽的研究。

基于此，本发明采用酶解技术降解贻贝蛋白，利用超滤、磁性微球固定化ACE吸附和高效液相色谱技术制备降压肽，为贻贝的高值化利用提供一条新的途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状提供一种对血管紧张素转化酶(ACE)具有显著的抑制作用的贻贝蛋白降压肽。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种贻贝蛋白降压肽，该降压肽的氨基酸序列为Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp(VSWPCRW)，ESI-MS测定分子量为935.07Da。

该贻贝蛋白降压肽的快速制备方法为：

1)琼脂糖磁性微球的制备与活化：按照重量体积比1～1.5g:30mL将琼脂糖加入到水中，共同煮沸至琼脂糖完全溶解，加入1ml Fe₃O₄磁流体，在旋涡混合器上充分混合；在搅拌下将混合液滴入到80℃的有机相(Span-80:液体石蜡＝1g:25mL)中，并在80℃下反应15～20min；有机相冷却至40℃后于250rpm转速机械搅拌10～15min使微球成形，并在磁场中分离，制得的微球分别用石油醚和去离子水清洗3次，以清除残余有机相，得琼脂糖磁性微球；将NaBH₄按照重量体积比2～3mg:1mL加入到NaOH溶液(0.8～1.0mol/L)中，然后将环氧氯丙烷按照体积比0.5～0.7:1再加入到NaOH溶液(0.8～1.0mol/L)中，最后按照重量体积比2～3g:1mL将琼脂糖磁性微球加入到NaOH溶液(0.8～1.0mol/L)中，于40℃下搅拌3～5h，得活化琼脂糖磁性微球。

2)ACE的固定：按照质量比1～1.5:10将血管紧张素转化酶(ACE)和活化的琼脂糖磁性微球加入硼酸盐缓冲液(0.1mol/L)中，40～50℃振荡2～3h后，混合液放入磁场中，将琼脂糖磁性微球分离出来，并用蒸馏水充分洗涤，直至无酶蛋白被洗出，真空冷冻干燥得琼脂糖磁性微球固定化ACE。

3)贻贝蛋白的酶解和超滤：将贻贝去壳，贻贝肉与甘氨酸-NaOH缓冲液按照1g：3～5mL的重量体积比混合、匀浆，调节pH值至9.5～10，得混合液；混合液调温度至45～55℃，按照贻贝肉质量的0.5～0.8％加入碱性蛋白酶(2.0×10⁵U/g)，酶解4～6h；酶解液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后；调温度至35～40℃，用1mol/LNaOH溶液调pH至8.5～9.0，按照贻贝肉质量的0.8～1.0％加入胰蛋白酶(1.9×10⁴U/g)，酶解4～6h后，将酶解液采用1kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，冻干，即为超滤酶解物。

4)贻贝蛋白降压肽的制备：将超滤酶解物依次经琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得降压肽。

作为优选，所述步骤3)中的贻贝为厚壳贻贝(Mytilus coruscus)。

作为改进，所述步骤4)中的琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和RP-HPLC纯化为：琼脂糖磁性微球固定化ACE的吸附：向硼酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH 7.8)加入NaCl至浓度为0.2mol/L，然后加入超滤酶解物至浓度为5～8mg/mL，最后按照溶液中酶解物重量的30～50倍加入琼脂糖磁性微球固定化ACE，吸附45min后，利用磁场将磁性微球与溶液分离，用硼酸盐缓冲液反复洗涤微球至洗涤液220nm和280nm无紫外吸收后，将磁性微球在1.0mol/L的NaCl溶液中解吸附，利用磁场将磁性微球与溶液分离，溶液冻干，得降压肽混合物。

RP-HPLC纯化：将降压肽混合物配成45～55μg/mL溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对ACE的抑制活性的得降压肽Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp(VSWPCRW)。

优选，所述RP-HPLC条件为：进样量为19～21μL；色谱柱为Zorbax C18(250×4.6mm，5μm)；流动相为40％乙腈；洗脱速度为1.0mL/min；紫外检测波长为220nm。

本发明的酶解贻贝蛋白制备降压肽的方法，具有如下优点：本发明采用的是一种生物酶法，易通过对酶解过程的监控，使ACEP最大程度地释放出来，提高原料的利用率。所制备的ACEP是贻贝肉经酶水解制得，安全、无毒副作用，ACE抑制活性显著，对高血压患者具有降压作用。

本发明的产品可以作为药品和保健食品等，工艺科学合理，操作简单，具有较强的工业实施性。较之现有的制备方法，本发明同时融合了酶解、超滤、磁性微球固定化酶吸附和RP-HPLC多种手段，方法更加完善，而且得到的降压肽具有较高的活性。

附图说明

图1是本发明实施例用Zorbax C18(250×4.6mm，5μm)柱进行层析时所获得的色谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例：

一种贻贝蛋白降压肽的快速制备方法，制备流程如下：贻贝肉"组织破碎"酶解"超滤"琼脂糖磁性微球固定化ACE的吸附"RP-HPLC纯化"降压肽。

1)琼脂糖磁性微球的制备与活化：按照重量体积比1.5g:30mL将琼脂糖加入到水中，共同煮沸至琼脂糖完全溶解，加入1ml Fe₃O₄磁流体，在旋涡混合器上充分混合；在搅拌下将混合液滴入到80℃的有机相(Span-80:液体石蜡＝1g:25mL)中，并在80℃下反应20min；有机相冷却至40℃于250rpm转速机械搅拌15min使微球成形，并在磁场中分离，制得的微球分别用石油醚和去离子水清洗3次，以清除残余有机相，得琼脂糖磁性微球；将NaBH₄按照重量体积比2mg:1mL加入到NaOH溶液(0.8mol/L)中，然后将环氧氯丙烷按照体积比0.5:1再加入到NaOH溶液(0.8mol/L)中，最后按照重量体积比3g:1mL将琼脂糖磁性微球加入到NaOH溶液(0.8mol/L)中，于40℃下搅拌3h，得活化琼脂糖磁性微球。

2)ACE的固定：按照质量比1.5:10将血管紧张素转化酶(ACE)和活化的琼脂糖磁性微球加入硼酸盐缓冲液(0.1mol/L)中，50℃振荡3h后，混合液放入磁场中，分离琼脂糖磁性微球，并用蒸馏水充分洗涤，直至无酶蛋白被洗出，真空冷冻干燥得琼脂糖磁性微球固定化ACE。

3)贻贝蛋白的酶解和超滤：将厚壳贻贝(Mytilus coruscus)去壳，贻贝肉与甘氨酸-NaOH缓冲液按照1g：4mL的重量体积比混合、匀浆，调节pH值至9.5，得混合液；混合液调温度至50℃，然后按照贻贝肉质量的0.8％加入碱性蛋白酶(2.0×10⁵U/g)，酶解5h；酶解液升温至95℃，并于此温度保持10min后；调温度至37℃，用1mol/L NaOH溶液调pH至8.6，按照贻贝肉质量的1.0％加入胰蛋白酶(1.9×10⁴U/g)，酶解6h后，将酶解液采用1kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，冻干，即为超滤酶解物。

4)贻贝蛋白降压肽的制备：将超滤酶解物依次经琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和反相高效液相色谱制(RP-HPLC)纯化，得降压肽。

①琼脂糖磁性微球固定化ACE的吸附：向硼酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH 7.8)加入NaCl至浓度为0.2mol/L，然后加入超滤酶解物至浓度为6mg/mL，最后按照溶液中酶解物重量的40倍加入琼脂糖磁性微球固定化ACE，吸附45min后，利用磁场将磁性微球与溶液分离，用硼酸盐缓冲液反复洗涤微球至洗涤液220nm和280nm无紫外吸收后，然后将磁性微球在1.0mol/L的NaCl溶液中解吸附，利用磁场将磁性微球与溶液分离，溶液冻干，得降压肽混合物。

②RP-HPLC纯化：将降压肽混合物配成45μg/mL溶液，利用RP-HPLC(条件：进样量为20μL；色谱柱为Zorbax C18(250×4.6mm，5μm)；流动相为40％乙腈；洗脱速度为1.0mL/min；紫外检测波长为220nm)进行纯化，根据对ACE的抑制活性得一个高活性降压肽(见图1)。

③结构检测：收集活性最高的降压肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp(VSWPCRW)，ESI/MS检测分子量为935.07Da。

将上述制得的贻贝蛋白降压肽Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp(VSWPCRW)进行ACE抑制活性实验。实验结果表明：该多肽的半数抑制率(IC₅₀)为37.53±1.09μM。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋学院

<120> 贻贝蛋白降压肽

<130> zjou-wb-201504-4

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Val Ser Trp Pro Cys Arg Trp

1 5

Claims

1.贻贝蛋白降压肽，其特征在于该降压肽的氨基酸序列为Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp，ESI-MS测定分子量为935.07 Da。