CN114591397B - 具有降血压功能的多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及功能食品及药品领域，具体涉及具有降血压功能的多肽及其制备方法。所述多肽的氨基酸序列为Pro‑Met‑His‑Ile‑Arg，其具有优秀的ACE抑制活性和优异的消化稳定性，且来源易得、制备简单。此外，其还可以从天然食用物料中获取，有利于保证安全性。因此，可将本发明的功能性多肽用于高血压患者的保健品以及降血压药的先导化合物。
Description
技术领域
本发明涉及功能食品及药品领域，具体涉及具有降血压功能的多肽及其制备方法。
背景技术
高血压是以体循环动脉血管收缩压或舒张压增高为主要特征，同时伴有心、脑、肾、视网膜等器官的功能或器质性损害的一种临床综合征。血管紧张素转化酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE)是一种含有Zn2+辅基的二肽羧肽酶，主要存在于哺乳动物的肺、脑、肾、眼球等各种组织的内皮细胞中。目前，临床上用于治疗高血压的药物主要是人工合成的ACE抑制剂，如卡托普利(Captopril)、福辛普利(Fosinopril)、赖诺普利(Lisinopril)等。ACE抑制剂通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-Angiotensin-Aldosterone System,RAAS)和激肽释放酶-激肽系统(Kallilrein-kinin system,KKS)调控机体血压。
由于临床使用的人工合成的ACE抑制剂药物往往伴随着咳嗽、高血钾、低血糖、味觉障碍、肾功能损伤、血管神经性水肿等诸多副作用，食源性ACE抑制肽因其安全高效、副作用小的的特点受到广泛关注。
目前，ACE抑制肽的来源主要有乳蛋白、发酵乳制品、鱼蛋白、植物蛋白质等。如CN113024633 A提供了一种珍珠贝肉来源ACE活性抑制肽及其制备方法，其将酶解物经超滤、凝胶色谱法、高效液相色谱法等一系列方法分离纯化，结合生物信息学筛选得到一个高纯度的ACE抑制四肽，其氨基酸序列为：Phe-Arg-Val-Trp，通过生物合成后进行活性测定，其对ACE的IC50值仅为18.34μM，且制备过程繁琐复杂。如何提供一种具有较高ACE抑制活性和较好消化稳定性的ACE抑制肽仍然是本领域需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种功能性多肽及其制备方法。
本发明的第二目的是提供一种乳清蛋白肽及其制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述的功能性多肽和乳清蛋白肽在药品、食品或食品添加剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种功能性多肽，其氨基酸序列为：Pro-Met-His-Ile-Arg(PMHIR)，所述功能性多肽具有优秀的ACE抑制活性。
本领域人员可以通过人工合成的方法获得上述功能性多肽，也可以天然蛋白为原料制备得到上述功能性多肽。
进一步地，本发明还提供了一种血管紧张素转换酶抑制剂，其含有上述的功能性多肽作为活性成分。
进一步地，本发明提供了一种乳清蛋白肽的制备方法，对Hilmar公司生产的乳清蛋白肽粉Hilmar 8350进行超滤处理，获得分子量小于3000道尔顿的乳清蛋白肽液。
所述乳清蛋白肽粉Hilmar 8350的水解度为12.5％，其蛋白质含量为82％，其中分子量小于1000Da的低聚肽占40.5％，分子量小于5000Da的低聚肽占67.2％。
在具体实施前，还包括将乳清蛋白肽粉Hilmar 8350溶于纯水中。
所述超滤处理可采用陶瓷膜超滤处理；作为优选，依次选用孔径为5000道尔顿、3000道尔顿、1000道尔顿的陶瓷膜超滤处理，最终获得分子量小于3000道尔顿的乳清蛋白肽液。
进一步地，所述制备方法还包括对分子量小于3000道尔顿的乳清蛋白肽液进行反相高效液相色谱分离获得氨基酸序列为Pro-Met-His-Ile-Arg的功能性多肽的对应洗脱峰。
在具体实施过程中，还包括进一步采用质谱分析鉴定其中的肽段。
作为优选，所述反相高效液相色谱可采用色谱柱为C18(250×4.6-10mm,5μm)进行分离，最优选，色谱柱为C18(250×10mm,5μm)。
进一步的，本发明还提供了一种乳清蛋白肽，其由上述乳清蛋白肽的制备方法制得，所述乳清蛋白肽中含有氨基酸序列为Pro-Met-His-Ile-Arg的功能性多肽。
此外，本发明还提供所述的功能性多肽、血管紧张素转换酶抑制剂或所述的乳清蛋白肽在制备药品、食品或食品添加剂中的应用。
作为优选，所述药品、食品或食品添加剂被用于以下至少一方面：
(1)预防、缓解或治疗高血压；
(2)抑制血管紧张素转化酶活性。
进一步的，本发明还提供了一种药品、食品或食品添加剂，其含有上述的功能性多肽、血管紧张素转换酶抑制剂或乳清蛋白肽。
基于上述技术方案，本发明的有益效果如下：
本发明的功能性多肽具有优秀的ACE抑制活性和优异的消化稳定性，且来源易得、制备简单。此外，其还可以从天然食用物料中获取，有利于保证安全性。因此，可将本发明的功能性多肽用于高血压患者的保健品以及降血压药的先导化合物。
附图说明
图1为PMHIR毒性预测结果图。
图2为PMHIR致敏性预测结果图。
图3为胃蛋白酶对PMHIR消化稳定性预测结果图。
图4为糜蛋白酶对PMHIR消化稳定性预测结果图。
图5为胰蛋白酶对PMHIR消化稳定性预测结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1来自天然食用原料的PMHIR的制备
(1)将Hilmar公司生产的乳清蛋白肽粉Hilmar 8350(水解度为12.5％，蛋白质含量82％，分子量小于1000Da的低聚肽占40.5％，分子量小于5000Da的低聚肽占67.2％)溶于纯水后，依次选用孔径为5000道尔顿、3000道尔顿、1000道尔顿的陶瓷膜超滤处理，最终获得分子量小于3000道尔顿的乳清蛋白肽液；
(2)通过色谱柱为C18(250×10mm,5μm)的反向高效液相色谱获得功能性多肽。其中洗脱采用溶剂A(0.1％TFA溶于水)和溶剂B(0.1％TFA溶于乙腈)；洗脱程序为：溶剂B，10％-40％(0-30min)；溶剂B，40％(30-35min)；溶剂B，40-10％(35-40min)。总洗脱时间为40分钟，上样100μL，速率3mL/min，收集28-30分钟分离的蛋白肽溶液。
实施例2小于3000道尔顿的乳清蛋白肽液ACE抑制活性测定测定原理：马脲酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)在血管紧张素转化酶(ACE)的作用下可水解为马尿酸(Hip)和组氨酰-亮氨酸(HL)，通过邻苯二甲醛法可测得单位时间内所产生的组氨酰亮氨酸含量，进而计算反应速率及抑制率。
测定方法：ACE酶购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。缓冲液使用含0.3M氯化钠、pH为8.3的0.1M硼酸-硼砂缓冲液。取12.5μL乳清蛋白肽液与25μL 4.7mM的HHL溶液混合均匀，在37℃下温育5min。之后加入25μL 0.025U/mL的ACE酶，在37℃下反应30min，反应结束后立即加入375μL 0.3M的NaOH终止反应。向混合液中加入25μL 2％(w/v)的邻苯二甲醛溶液，10min避光反应后加入50μL 3.0M的HCl结束反应。随后使用荧光分光光度计在340nm激发光和455nm发射光下测定反应溶液的荧光值。
ACE抑制率％＝{1-(F样品-F空白对照)/(F阴性对照-F空白对照)}×100
F样品：12.5μL样品液+25μL HHL溶液+25μL ACE酶；
F空白对照：12.5μL硼酸钠缓冲液+25μL HHL溶液+25μL硼酸钠缓冲液；
F阴性对照：12.5μL硼酸钠缓冲液+25μL HHL溶液+25μL ACE酶。
在测定不同浓度下的抑制率后，通过非线性拟合计算半抑制浓度(IC50)。
表1.不同浓度<3000Da乳清蛋白肽液对ACE的抑制率
由表1计算可得<3000道尔顿乳清蛋白肽液对ACE的半数抑制浓度为45.91±3.58ug/mL，结果表明其具有优秀的ACE抑制活性，可用作适于高血压患者的保健品以及降血压药的先导化合物。
实施例3 Pro-Met-His-Ile-Arg的ACE抑制活性测定
测定原理：马脲酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)在血管紧张素转化酶(ACE)的作用下可水解为马尿酸(Hip)和组氨酰-亮氨酸(HL)，通过邻苯二甲醛法可测得单位时间内所产生的组氨酰亮氨酸含量，进而计算反应速率及抑制率。
测定方法：实验用的功能性多肽PMHIR通过委托上海诺优生物科技有限公司合成，ACE酶购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。缓冲液使用含0.3M氯化钠、pH为8.3的0.1M硼酸-硼砂缓冲液。取12.5μL功能性多肽溶液与25μL 4.7mM的HHL溶液混合均匀，在37℃下温育5min。之后加入25μL 0.025U/mL的ACE酶，在37℃下反应30min，反应结束后立即加入375μL 0.3M的NaOH终止反应。向混合液中加入25μL 2％(w/v)的邻苯二甲醛溶液，10min避光反应后加入50μL 3.0M的HCl结束反应。随后使用荧光分光光度计在340nm激发光和455nm发射光下测定反应溶液的荧光值。
ACE抑制率％＝{1-(F样品-F空白对照)/(F阴性对照-F空白对照)}×100
F样品：12.5μL样品液+25μL HHL溶液+25μL ACE酶；
F空白对照：12.5μL硼酸钠缓冲液+25μL HHL溶液+25μL硼酸钠缓冲液；
F阴性对照：12.5μL硼酸钠缓冲液+25μL HHL溶液+25μL ACE酶。
在测定不同浓度下的抑制率后，通过非线性拟合计算半抑制浓度(IC50)。
表2.不同浓度PMHIR对ACE的抑制率
由表2计算可得PMHIR对ACE的半数抑制浓度为17.29±1.26nM，结果表明其具有优秀的ACE抑制活性，可用作适于高血压患者的保健品以及降血压药的先导化合物。
实施例4 Pro-Met-His-Ile-Arg的消化稳定性以及安全性测定
由多肽毒性(http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/)，致敏性(https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/index.html)及可消化性(https://www.novopro.cn/tools/protease-digestion-tool.html)预测软件分析，PMHIR没有毒性(图1)，致敏性极低(图2)，且不能被主要消化酶胃蛋白酶(图3)、糜蛋白酶(图4)、胰蛋白酶(图5)消化。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 河北东康乳业有限公司
<120> 具有降血压功能的多肽及其制备方法
<130> KHP211123160.7
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Met His Ile Arg
1 5
Claims (7)
1.一种乳清蛋白肽，其特征在于，氨基酸序列为：Pro-Met-His-Ile-Arg。
2.一种血管紧张素转换酶抑制剂，其特征在于，以权利要求1所述的乳清蛋白肽作为活性成分。
3.权利要求1所述乳清蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括：对Hilmar公司生产的乳清蛋白肽粉Hilmar 8350进行超滤处理，获得分子量小于3000道尔顿的乳清蛋白肽液，对分子量小于3000道尔顿的乳清蛋白肽液进行反相高效液相色谱分离，获得氨基酸序列为Pro-Met-His-Ile-Arg的乳清蛋白肽的对应洗脱峰；所述乳清蛋白肽液中含有氨基酸序列为Pro-Met-His-Ile-Arg的乳清蛋白肽。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述超滤处理为依次通过孔径为5000道尔顿、3000道尔顿、1000道尔顿的陶瓷膜。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱的色谱柱规格为250× 4.6-10 mm, 5 μm。
6.权利要求1所述的乳清蛋白肽、或权利要求2所述的血管紧张素转换酶抑制剂或权利要求3~5中任一项所述的制备方法在制备药品中的应用；所述药品用于缓解或治疗高血压。
7.一种药品，其特征在于，其含有权利要求1所述的乳清蛋白肽或权利要求2所述的血管紧张素转换酶抑制剂。
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