CN112940079B - 一种大米降压肽及其酶解制备方法 - Google Patents

一种大米降压肽及其酶解制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112940079B
CN112940079B CN202110297112.8A CN202110297112A CN112940079B CN 112940079 B CN112940079 B CN 112940079B CN 202110297112 A CN202110297112 A CN 202110297112A CN 112940079 B CN112940079 B CN 112940079B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
antihypertensive peptide
antihypertensive
peptide
selecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110297112.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112940079A (zh
Inventor
孟航
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Shangjiahe Health Technology Co.,Ltd.
Original Assignee
Guangzhou Mingchuang Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Mingchuang Biotechnology Co ltd filed Critical Guangzhou Mingchuang Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110297112.8A priority Critical patent/CN112940079B/zh
Publication of CN112940079A publication Critical patent/CN112940079A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112940079B publication Critical patent/CN112940079B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/10—Process efficiency

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种大米降压肽及其酶解制备方法，大米降压肽的氨基酸序列为ACHHQENYGNPTV，其酶解制备方法如下：(1)预处理；(2)碾碎处理；(3)酶解处理；(4)离心和超滤处理；(5)吸附处理；(6)真空冷冻干燥处理。本发明制备的降压肽具有很好的ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性，其IC50值小于0.069mg/mL；同时还具有很好的抗氧化活性，其对DPPH自由基的清除率高达91.5％。经体内模型试验，降压肽具有较好的降血压活性，接近药物卡托普利的治疗效果，可用作潜在的口服液产品；同时，在服用24h后，使用降压肽的组内仅出现轻微血压上调，这说明本发明制备的降压肽具有缓释降压的效果。

Description

一种大米降压肽及其酶解制备方法
技术领域
本发明涉及生物制造技术领域，特别是涉及一种大米降压肽及其酶解制备方法。
背景技术
生物活性肽是指有益于生物机体的生命活动或者具有生理作用的肽类化合物，又称功能肽，其生理功能主要有抗菌活性、免疫活性、抗氧化作用、抗高血压活性、降胆固醇作用、结合矿物质、促生长作用、抗血栓作用、抑制肿瘤转移等。
目前世界上研究米及米糠资源最早的国家是美国和日本。美国稻谷创新公司、利普曼公司在这方面遥遥领先于其他企业，它们已开发出具有明确的功能因子和确切的保健作用的各种米糠营养食品，如可溶性米糠营养素、米糠蛋白、米糠纤维等产品。ACE抑制肽最早是由日本开发出来的，已有多种产品上市。目前大米ACE抑制肽分离纯化技术一般，提纯后活性较低，同时关于其动物实验的报道较少，尤其是体内灌胃实验。
发明内容
本发明的目的是提供一种大米降压肽及其酶解制备方法，本发明制备的降压肽具有很好的ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性，其IC50值小于0.069mg/mL；同时还具有很好的抗氧化活性，其对DPPH自由基的清除率高达91.5％。经体内模型试验，降压肽具有较好的降血压活性，接近药物卡托普利的治疗效果，可用作潜在的口服液产品；同时，在服用24h后，使用降压肽的组内仅出现轻微血压上调，这说明本发明制备的降压肽具有缓释降压的效果。
为了实现上述目的，本发明提供一种大米降压肽，所述的大米降压肽的氨基酸序列为ACHHQENYGNPTV。
一种如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，包括以下步骤：
(1)预处理：筛选和清洗大米；
(2)碾碎处理：选择步骤(1)预处理后的大米，转移至碾碎机中进行低温碾碎，得到碎米粒；
(3)酶解处理：选择步骤(2)得到的碎米粒，转移至料液槽中进行浸泡处理，边搅拌边加热；
(4)离心和超滤处理：选择步骤(3)酶解处理后的料液，进行高速离心，离心后取上清液，然后将上清液进行超滤，得到滤液；
(5)吸附处理：选择步骤(4)得到的滤液，并选择大孔吸附树脂进行降压肽的吸附，然后将降压肽用生理盐水洗脱下来；
(6)真空冷冻干燥处理：选择步骤(5)吸附处理后的降压肽，转移到真空冷冻干燥设备中，最后收集粉末状降压肽，并在超低温冰箱-80℃下保藏，即可。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的筛选标准为表面无杂质、无霉腐坏点、无机械损伤的大米。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的清洗步骤为用清水清洗干净并在阴凉处晾干。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(2)中的碎米粒的粒径范围为0.1mm-0.5mm；
步骤(2)中低温碾碎的温度为4℃-6℃。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中搅拌的速度为400r/min；
步骤(3)中搅拌的温度为37℃；
步骤(3)中搅拌的时间为40min。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中料液槽内的溶液为含碱性蛋白酶、胰蛋白酶及柠檬酸钠的磷酸盐缓冲液；其中磷酸盐缓冲液为含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾的溶液，其中磷酸二氢钾的质量浓度为0.35g/L，其中磷酸氢二钠的质量浓度为1.30g/L，其中氯化钠的质量浓度为10.0g/L，其中氯化钾的质量浓度为0.1g/L；其中碱性蛋白酶的质量浓度为10mg/L，其中胰蛋白酶的质量浓度为15mg/L；其中柠檬酸钠的质量浓度为20mg/L。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(4)中高速离心的离心力为7000g，其中高速离心的时间为1h，其中高速离心的温度为4℃；
步骤(4)中超滤的步骤如下：
选择5kDa的超滤膜进行第一次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择3kDa的超滤膜进行第二次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择1kDa的超滤膜进行第三次过滤，洗脱液为生理盐水；
收集分子量小于1kDa的过滤液。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(5)中大孔吸附树脂的骨架选自二乙烯苯与丙烯酰胺的混合物，其中二乙烯苯与丙烯酰胺的用量比为2：3；
步骤(5)中大孔吸附树脂的上样流速为0.5mL/min；
步骤(5)中大孔吸附树脂的解吸剂为75％乙醇。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(6)中真空冷冻干燥的最低温度控制在-40℃。
上述技术方案所提供的缓释面膜及其酶解制备方法，具有以下有益效果：
本发明制备的降压肽具有很好的ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性，其IC50值小于0.069mg/mL；同时还具有很好的抗氧化活性，其对DPPH自由基的清除率高达91.5％。经体内模型试验，降压肽具有较好的降血压活性，接近药物卡托普利的治疗效果，可用作潜在的口服液产品；同时，在服用24h后，使用降压肽的组内仅出现轻微血压上调，这说明本发明制备的降压肽具有缓释降压的效果。
附图说明
图1是本发明实施例大米降压肽酶解制备方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
最优方案
本实施例提供一种大米降压肽，所述的大米降压肽的氨基酸序列为ACHHQENYGNPTV，详见序列表的SEQ ID NO.1。
需要提醒的是，本发明使用的大米为黑龙江五常大米，采购自五常市乔府大院农业股份有限公司。
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)预处理：筛选和清洗大米；
(2)碾碎处理：选择步骤(1)预处理后的大米，转移至碾碎机中进行低温碾碎，得到碎米粒；
(3)酶解处理：选择步骤(2)得到的碎米粒，转移至料液槽中进行浸泡处理，边搅拌边加热；
(4)离心和超滤处理：选择步骤(3)酶解处理后的料液，进行高速离心，离心后取上清液，然后将上清液进行超滤，得到滤液；
(5)吸附处理：选择步骤(4)得到的滤液，并选择大孔吸附树脂进行降压肽的吸附，然后将降压肽用生理盐水洗脱下来；
(6)真空冷冻干燥处理：选择步骤(5)吸附处理后的降压肽，转移到真空冷冻干燥设备中，最后收集粉末状降压肽，并在超低温冰箱-80℃下保藏，即可。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的筛选标准为表面无杂质、无霉腐坏点、无机械损伤的大米。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的清洗步骤为用清水清洗干净并在阴凉处晾干。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(2)中的碎米粒的粒径为0.1mm；
步骤(2)中低温碾碎的温度为4℃。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中搅拌的速度为400r/min；
步骤(3)中搅拌的温度为37℃；
步骤(3)中搅拌的时间为40min。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中料液槽内的溶液为含碱性蛋白酶、胰蛋白酶及柠檬酸钠的磷酸盐缓冲液；其中磷酸盐缓冲液为含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾的溶液，其中磷酸二氢钾的质量浓度为0.35g/L，其中磷酸氢二钠的质量浓度为1.30g/L，其中氯化钠的质量浓度为10.0g/L，其中氯化钾的质量浓度为0.1g/L；其中碱性蛋白酶的质量浓度为10mg/L，其中胰蛋白酶的质量浓度为15mg/L；其中柠檬酸钠的质量浓度为20mg/L。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(4)中高速离心的离心力为7000g，其中高速离心的时间为1h，其中高速离心的温度为4℃；
步骤(4)中超滤的步骤如下：
选择5kDa的超滤膜进行第一次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择3kDa的超滤膜进行第二次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择1kDa的超滤膜进行第三次过滤，洗脱液为生理盐水；
收集分子量小于1kDa的过滤液。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(5)中大孔吸附树脂的骨架选自二乙烯苯与丙烯酰胺的混合物，其中二乙烯苯与丙烯酰胺的用量比为2：3；
步骤(5)中大孔吸附树脂的上样流速为0.5mL/min；
步骤(5)中大孔吸附树脂的解吸剂为75％乙醇。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(6)中真空冷冻干燥的最低温度控制在-40℃。
对比例1
本实施例提供一种大米降压肽，所述的大米降压肽的氨基酸序列为ACHHQENYGNPTV，详见序列表的SEQ ID NO.1。
需要提醒的是，本发明使用的大米为黑龙江五常大米，采购自五常市乔府大院农业股份有限公司。
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，包括以下步骤：
(1)预处理：筛选和清洗大米；
(2)碾碎处理：选择步骤(1)预处理后的大米，转移至碾碎机中进行低温碾碎，得到碎米粒；
(3)酶解处理：选择步骤(2)得到的碎米粒，转移至料液槽中进行浸泡处理，边搅拌边加热；
(4)离心和超滤处理：选择步骤(3)酶解处理后的料液，进行高速离心，离心后取上清液，然后将上清液进行超滤，得到滤液；
(5)吸附处理：选择步骤(4)得到的滤液，并选择大孔吸附树脂进行降压肽的吸附，然后将降压肽用生理盐水洗脱下来；
(6)真空冷冻干燥处理：选择步骤(5)吸附处理后的降压肽，转移到真空冷冻干燥设备中，最后收集粉末状降压肽，并在超低温冰箱-80℃下保藏，即可。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的筛选标准为表面无杂质、无霉腐坏点、无机械损伤的大米。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的清洗步骤为用清水清洗干净并在阴凉处晾干。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(2)中的碎米粒的粒径为0.1mm；
步骤(2)中低温碾碎的温度为4℃。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中搅拌的速度为400r/min；
步骤(3)中搅拌的温度为37℃；
步骤(3)中搅拌的时间为40min。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中料液槽内的溶液为含碱性蛋白酶的磷酸盐缓冲液；其中磷酸盐缓冲液为含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾的溶液，其中磷酸二氢钾的质量浓度为0.35g/L，其中磷酸氢二钠的质量浓度为1.30g/L，其中氯化钠的质量浓度为10.0g/L，其中氯化钾的质量浓度为0.1g/L；其中碱性蛋白酶的质量浓度为10mg/L。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(4)中高速离心的离心力为7000g，其中高速离心的时间为1h，其中高速离心的温度为4℃；
步骤(4)中超滤的步骤如下：
选择5kDa的超滤膜进行第一次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择3kDa的超滤膜进行第二次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择1kDa的超滤膜进行第三次过滤，洗脱液为生理盐水；
收集分子量小于1kDa的过滤液。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(5)中大孔吸附树脂的骨架选自二乙烯苯与丙烯酰胺的混合物，其中二乙烯苯与丙烯酰胺的用量比为2：3；
步骤(5)中大孔吸附树脂的上样流速为0.5mL/min；
步骤(5)中大孔吸附树脂的解吸剂为75％乙醇。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(6)中真空冷冻干燥的最低温度控制在-40℃。
对比例2
本实施例提供一种大米降压肽，所述的大米降压肽的氨基酸序列为ACHHQENYGNPTV，详见序列表的SEQ ID NO.1。
需要提醒的是，本发明使用的大米为黑龙江五常大米，采购自五常市乔府大院农业股份有限公司。
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，包括以下步骤：
(1)预处理：筛选和清洗大米；
(2)碾碎处理：选择步骤(1)预处理后的大米，转移至碾碎机中进行低温碾碎，得到碎米粒；
(3)酶解处理：选择步骤(2)得到的碎米粒，转移至料液槽中进行浸泡处理，边搅拌边加热；
(4)离心和超滤处理：选择步骤(3)酶解处理后的料液，进行高速离心，离心后取上清液，然后将上清液进行超滤，得到滤液；
(5)吸附处理：选择步骤(4)得到的滤液，并选择大孔吸附树脂进行降压肽的吸附，然后将降压肽用生理盐水洗脱下来；
(6)真空冷冻干燥处理：选择步骤(5)吸附处理后的降压肽，转移到真空冷冻干燥设备中，最后收集粉末状降压肽，并在超低温冰箱-80℃下保藏，即可。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的筛选标准为表面无杂质、无霉腐坏点、无机械损伤的大米。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的清洗步骤为用清水清洗干净并在阴凉处晾干。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(2)中的碎米粒的粒径为0.1mm；
步骤(2)中低温碾碎的温度为4℃。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中搅拌的速度为400r/min；
步骤(3)中搅拌的温度为37℃；
步骤(3)中搅拌的时间为40min。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中料液槽内的溶液为含胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液；其中磷酸盐缓冲液为含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾的溶液，其中磷酸二氢钾的质量浓度为0.35g/L，其中磷酸氢二钠的质量浓度为1.30g/L，其中氯化钠的质量浓度为10.0g/L，其中氯化钾的质量浓度为0.1g/L；其中胰蛋白酶的质量浓度为15mg/L。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(4)中高速离心的离心力为7000g，其中高速离心的时间为1h，其中高速离心的温度为4℃；
步骤(4)中超滤的步骤如下：
选择5kDa的超滤膜进行第一次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择3kDa的超滤膜进行第二次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择1kDa的超滤膜进行第三次过滤，洗脱液为生理盐水；
收集分子量小于1kDa的过滤液。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(5)中大孔吸附树脂的骨架选自二乙烯苯与丙烯酰胺的混合物，其中二乙烯苯与丙烯酰胺的用量比为2：3；
步骤(5)中大孔吸附树脂的上样流速为0.5mL/min；
步骤(5)中大孔吸附树脂的解吸剂为75％乙醇。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(6)中真空冷冻干燥的最低温度控制在-40℃。
对比例3
本实施例提供一种大米降压肽，所述的大米降压肽的氨基酸序列为ACHHQENYGNPTV，详见序列表的SEQ ID NO.1。
需要提醒的是，本发明使用的大米为黑龙江五常大米，采购自五常市乔府大院农业股份有限公司。
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，包括以下步骤：
(1)预处理：筛选和清洗大米；
(2)碾碎处理：选择步骤(1)预处理后的大米，转移至碾碎机中进行低温碾碎，得到碎米粒；
(3)酶解处理：选择步骤(2)得到的碎米粒，转移至料液槽中进行浸泡处理，边搅拌边加热；
(4)离心和超滤处理：选择步骤(3)酶解处理后的料液，进行高速离心，离心后取上清液，然后将上清液进行超滤，得到滤液；
(5)吸附处理：选择步骤(4)得到的滤液，并选择大孔吸附树脂进行降压肽的吸附，然后将降压肽用生理盐水洗脱下来；
(6)真空冷冻干燥处理：选择步骤(5)吸附处理后的降压肽，转移到真空冷冻干燥设备中，最后收集粉末状降压肽，并在超低温冰箱-80℃下保藏，即可。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的筛选标准为表面无杂质、无霉腐坏点、无机械损伤的大米。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的清洗步骤为用清水清洗干净并在阴凉处晾干。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(2)中的碎米粒的粒径为0.1mm；
步骤(2)中低温碾碎的温度为4℃。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中搅拌的速度为400r/min；
步骤(3)中搅拌的温度为37℃；
步骤(3)中搅拌的时间为40min。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中料液槽内的溶液为含碱性蛋白酶、胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液；其中磷酸盐缓冲液为含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾的溶液，其中磷酸二氢钾的质量浓度为0.35g/L，其中磷酸氢二钠的质量浓度为1.30g/L，其中氯化钠的质量浓度为10.0g/L，其中氯化钾的质量浓度为0.1g/L；其中碱性蛋白酶的质量浓度为10mg/L，其中胰蛋白酶的质量浓度为15mg/L。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(4)中高速离心的离心力为7000g，其中高速离心的时间为1h，其中高速离心的温度为4℃；
步骤(4)中超滤的步骤如下：
选择5kDa的超滤膜进行第一次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择3kDa的超滤膜进行第二次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择1kDa的超滤膜进行第三次过滤，洗脱液为生理盐水；
收集分子量小于1kDa的过滤液。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(5)中大孔吸附树脂的骨架选自二乙烯苯与丙烯酰胺的混合物，其中二乙烯苯与丙烯酰胺的用量比为2：3；
步骤(5)中大孔吸附树脂的上样流速为0.5mL/min；
步骤(5)中大孔吸附树脂的解吸剂为75％乙醇。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(6)中真空冷冻干燥的最低温度控制在-40℃。
对比例4
本实施例提供一种大米降压肽，所述的大米降压肽的氨基酸序列为ACHHQENYGNPTV，详见序列表的SEQ ID NO.1。
需要提醒的是，本发明使用的大米为黑龙江五常大米，采购自五常市乔府大院农业股份有限公司。
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，包括以下步骤：
(1)预处理：筛选和清洗大米；
(2)碾碎处理：选择步骤(1)预处理后的大米，转移至碾碎机中进行低温碾碎，得到碎米粒；
(3)酶解处理：选择步骤(2)得到的碎米粒，转移至料液槽中进行浸泡处理，边搅拌边加热；
(4)离心和超滤处理：选择步骤(3)酶解处理后的料液，进行高速离心，离心后取上清液，然后将上清液进行超滤，得到滤液；
(5)吸附处理：选择步骤(4)得到的滤液，并选择大孔吸附树脂进行降压肽的吸附，然后将降压肽用生理盐水洗脱下来；
(6)真空冷冻干燥处理：选择步骤(5)吸附处理后的降压肽，转移到真空冷冻干燥设备中，最后收集粉末状降压肽，并在超低温冰箱-80℃下保藏，即可。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的筛选标准为表面无杂质、无霉腐坏点、无机械损伤的大米。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(1)中大米的清洗步骤为用清水清洗干净并在阴凉处晾干。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(2)中的碎米粒的粒径为0.1mm；
步骤(2)中低温碾碎的温度为4℃。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中搅拌的速度为400r/min；
步骤(3)中搅拌的温度为37℃；
步骤(3)中搅拌的时间为40min。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(3)中料液槽内的溶液为含碱性蛋白酶、胰蛋白酶及柠檬酸钠的磷酸盐缓冲液；其中磷酸盐缓冲液为含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾的溶液，其中磷酸二氢钾的质量浓度为0.35g/L，其中磷酸氢二钠的质量浓度为1.30g/L，其中氯化钠的质量浓度为10.0g/L，其中氯化钾的质量浓度为0.1g/L；其中碱性蛋白酶的质量浓度为20mg/L，其中胰蛋白酶的质量浓度为20mg/L；其中柠檬酸钠的质量浓度为20mg/L。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(4)中高速离心的离心力为7000g，其中高速离心的时间为1h，其中高速离心的温度为4℃；
步骤(4)中超滤的步骤如下：
选择5kDa的超滤膜进行第一次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择3kDa的超滤膜进行第二次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择1kDa的超滤膜进行第三次过滤，洗脱液为生理盐水；
收集分子量小于1kDa的过滤液。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(5)中大孔吸附树脂的骨架选自二乙烯苯与丙烯酰胺的混合物，其中二乙烯苯与丙烯酰胺的用量比为2：3；
步骤(5)中大孔吸附树脂的上样流速为0.5mL/min；
步骤(5)中大孔吸附树脂的解吸剂为75％乙醇。
上述所述的大米降压肽的其酶解制备方法中，
步骤(6)中真空冷冻干燥的最低温度控制在-40℃。
对比例5
基本同实施例1，不同的地方在于：
步骤(5)中大孔吸附树脂的骨架选自二乙烯苯。
对比例6
基本同实施例1，不同的地方在于：
步骤(5)中大孔吸附树脂的骨架选自丙烯酰胺。
测试方案
选择实施例1及对比例1-6制备的大米降压肽，并参考如下现有技术进行测试：
(1)王申.大米活性肽降血压功效及吸收评价[D].武汉轻工大学.
(2)陈季旺,刘英,夏文水,等.大米降压肽酶法制备工艺及其性质研究[J].农业工程学报,2007(05):210-213.
(3)中国发明专利，申请号：CN201810646683.6，公开公告号：CN108841905A，公开了一种具抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽及其制备方法
(4)Li G H,Qu M R,Wan J Z,et al.Antihypertensive Effect of RiceProtein Hydrolysate with in Vitro Angiotensin I-Converting Enzyme InhibitoryActivity in Spontaneously Hypertensive Rats[J].Asia Pacific Journal ofClinical Nutrition,2007,16(S1):275-280.
(5)毋瑾超,汪依凡,方长富.水产蛋白酶解降血压肽的降压功能及毒理学研究[J].中华中西医杂志,2006.
降压肽的ACE抑制能力按照如下方法进行测定：
ACE抑制率的方法。用高效液相色谱在228nm下定量检测释放出的Hip量，从而计算出多肽的ACE抑制率。
(1)试剂的配置
pH8.3的磷酸盐缓冲溶液：用超纯水配制，其中含磷酸盐50mmol/L，NaCl 300mmol/L，调整pH到8.3；
ACE酶液：将2mL的磷酸盐缓冲液加入1U的ACE中，使其浓度变为0.5U/mL。
HHL溶液：使用磷酸缓冲液溶解HHL，使其终浓度为5mmol/L。
样品溶液：称取适量样品，用磷酸盐缓冲液所需浓度的溶液。
(2)ACE抑制率测定的色谱条件
检测波长：228nm；流速：1mL/min；流动相A：超纯水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：甲醇(含0.1％三氟乙酸)；进样量：10μL，手动进样。
(3)测定ACE抑制活性的方法
取120μL HHL底物溶液，加入20μL的样品混合均匀，在37℃恒温水浴中保温10min。然后加入10μL ACE酶液在37℃恒温水浴中反应30min，再加入150μL 1mol/L的HCl终止反应，得到反应液。该反应液利用HPLC进行分析，同时设置空白对照组。ACE抑制活性计算公式如下：
ACE抑制活性％＝(M-N)/M×100％
式中，M为对照组中马尿酸的峰面积，N为添加的样品组中马尿酸的峰面积。
(4)半抑制浓度的测定
按照ACE抑制肽体外检测方法测定其抑制活性，以浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算出IC50值
上述相关测试如表1所示，
表1
Figure BDA0002984754100000151
Figure BDA0002984754100000161
由表1可知，本发明制备的降压肽具有很好的ACE(血管紧张素转化酶)抑制活性，其IC50值小于0.069mg/mL。需要注意的是，ACE浓度越高，导致血管收缩占优势，血压升高。抑制ACE的活性是治疗高血压的重要途径之一。
降压肽的抗氧化能力按照如下方法进行测定：
对DPPH自由基的清除作用
样品溶于双蒸水配制成一系列质量浓度梯度的样品溶液，取2mL各质量浓度的样品，加入到2mL 0.1mmol/L DPPH溶液(溶于无水乙醇)中。混合均匀后，室温下放置30min后在517nm测得各个质量浓度样品吸光度(Ai)。平行测定3次，取平均值。同时以2mL样品溶液加入2mL无水乙醇测得吸光度(Aj)。除此之外，在取2mL无水乙醇代替样品加入2mLDPPH自由基溶液测得空白吸光度(Ao)。
按照式(I)计算DPPH自由基清除率。
Figure BDA0002984754100000162
上述相关测试如表2所示，
表2
Figure BDA0002984754100000163
Figure BDA0002984754100000171
由表2可知，本发明制备的降压肽具有很好的抗氧化活性，其对DPPH自由基的清除率高达91.5％。
降压肽的体内降压实验按照如下方法进行测定：
需要注意的是，以实施例1制备的大米降压肽为测定样品。
以原发性高血压大鼠(SHRs)和正常对照组(WKYs)为研究对象，进行一次灌胃试验，观察其收缩压(systolic blood pressure，SBP)的变化。
SHR和WKY饲养于中山大学实验动物中心SPF级小动物实验室。饲养环境温度保持在(25±1)℃，每日照明为12小时光照-黑暗交替，照明时间从上午8:00-20:00。在实验开始前，SHR和WKY均有一周的环境适应期，整个饲养过程的执行严格遵照《实验动物饲养和使用伦理指南》。本研究在中山大学大学动物试验伦理委员会的批准下进行。
一周适应期后，SHR随机分为5组，每组10只，分别为：阳性对照组(卡托普利)，大米降压肽高、中、低剂量组和阴性对照组(蒸馏水)。WKY随机分为3组，每组10只，分别为阳性对照组(卡托普利)、大米肽高剂量组和阴性对照组(蒸馏水)。具体如表3所示。
表3
Figure BDA0002984754100000172
Figure BDA0002984754100000181
实验动物血压的测量
SHR大鼠的动脉血压通过尾部套管法测定，所用仪器为日本Softron公司的BP-100A智能无创血压计。在测定血压时，将鼠尾装进鼠套内，37℃下预热5-10min，待血压计上出现稳定的、正常的大鼠脉搏波形后，开始测量其舒张压。每次测定重复5次，测定值取去除最大值和最小值后的平均值。所有测定均由同一实验者在安静环境中完成，以尽量消除测定干扰。
一次灌胃降压效果实验
SHR和WKY大鼠按照实验动物分组剂量进行一次灌胃，灌胃后，分别在第0h、4h、8h、10h、24h测其舒张压值。具体如表4所示。
表4
Figure BDA0002984754100000182
Figure BDA0002984754100000191
由表4可知，本发明制备的降压肽具有较好的降血压活性，接近药物卡托普利的治疗效果，可用作潜在的口服液产品。同时，在服用24h后，使用降压肽的组内仅出现轻微血压上调，这说明本发明制备的降压肽具有缓释降压的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州明创生物科技有限公司
<120> 一种大米降压肽及其酶解制备方法
<130> 20201220
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 1
Ala Cys His His Gln Glu Asn Tyr Gly Asn Pro Thr Val
1 5 10

Claims (1)

1.一种大米降压肽，其特征在于，
所述的大米降压肽的氨基酸序列为ACHHQENYGNPTV；
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，包括以下步骤：
(1)预处理：筛选和清洗大米；
(2)碾碎处理：选择步骤(1)预处理后的大米，转移至碾碎机中进行低温碾碎，得到碎米粒；
(3)酶解处理：选择步骤(2)得到的碎米粒，转移至料液槽中进行浸泡处理，边搅拌边加热；
(4)离心和超滤处理：选择步骤(3)酶解处理后的料液，进行高速离心，离心后取上清液，然后将上清液进行超滤，得到滤液；
(5)吸附处理：选择步骤(4)得到的滤液，并选择大孔吸附树脂进行降压肽的吸附，然后将降压肽用生理盐水洗脱下来；
(6)真空冷冻干燥处理：选择步骤(5)吸附处理后的降压肽，转移到真空冷冻干燥设备中，最后收集粉末状降压肽，并在超低温冰箱-80℃下保藏，即可；
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，步骤(1)中大米的筛选标准为表面无杂质、无霉腐坏点、无机械损伤的大米；
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，步骤(1)中大米的清洗步骤为用清水清洗干净并在阴凉处晾干；
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，步骤(2)中的碎米粒的粒径范围为0.1mm-0.5mm；
步骤(2)中低温碾碎的温度为4℃-6℃；
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，
步骤(3)中搅拌的速度为400r/min；
步骤(3)中搅拌的温度为37℃；
步骤(3)中搅拌的时间为40min；
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，步骤(3)中料液槽内的溶液为含碱性蛋白酶、胰蛋白酶及柠檬酸钠的磷酸盐缓冲液；其中磷酸盐缓冲液为含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾的溶液，其中磷酸二氢钾的质量浓度为0.35g/L，其中磷酸氢二钠的质量浓度为1.30g/L，其中氯化钠的质量浓度为10.0g/L，其中氯化钾的质量浓度为0.1g/L；其中碱性蛋白酶的质量浓度为10mg/L，其中胰蛋白酶的质量浓度为15mg/L；其中柠檬酸钠的质量浓度为20mg/L；
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，步骤(4)中高速离心的离心力为7000g，其中高速离心的时间为1h，其中高速离心的温度为4℃；
步骤(4)中超滤的步骤如下：
选择5kDa的超滤膜进行第一次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择3kDa的超滤膜进行第二次过滤，洗脱液为生理盐水；
选择1kDa的超滤膜进行第三次过滤，洗脱液为生理盐水；
收集分子量小于1kDa的过滤液；
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，步骤(5)中大孔吸附树脂的骨架选自二乙烯苯与丙烯酰胺的混合物，其中二乙烯苯与丙烯酰胺的用量比为2：3；
步骤(5)中大孔吸附树脂的上样流速为0.5mL/min；
步骤(5)中大孔吸附树脂的解吸剂为75％乙醇；
如上述所述的大米降压肽的酶解制备方法，步骤(6)中真空冷冻干燥的最低温度控制在-40℃。
CN202110297112.8A 2021-03-19 2021-03-19 一种大米降压肽及其酶解制备方法 Active CN112940079B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110297112.8A CN112940079B (zh) 2021-03-19 2021-03-19 一种大米降压肽及其酶解制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110297112.8A CN112940079B (zh) 2021-03-19 2021-03-19 一种大米降压肽及其酶解制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112940079A CN112940079A (zh) 2021-06-11
CN112940079B true CN112940079B (zh) 2022-09-09

Family

ID=76227693

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110297112.8A Active CN112940079B (zh) 2021-03-19 2021-03-19 一种大米降压肽及其酶解制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112940079B (zh)

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04279529A (ja) * 1991-03-06 1992-10-05 Gekkeikan Sake Co Ltd 経口摂取物
CN101126105A (zh) * 2007-06-28 2008-02-20 武汉工业学院 一种用大米分离蛋白制备降血压肽的方法
CN101709321A (zh) * 2009-12-02 2010-05-19 北京工商大学 一种燕麦多肽及其制备方法与应用
CN102864200A (zh) * 2012-09-17 2013-01-09 武汉工业学院 复合酶水解大米分离蛋白制备ace抑制肽的方法
JP2014043442A (ja) * 2012-07-31 2014-03-13 Sunstar Inc 米糠酵素処理組成物
CN103980347A (zh) * 2014-05-22 2014-08-13 浙江海洋学院 一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途
CN104450839A (zh) * 2014-11-05 2015-03-25 哈尔滨商业大学 具有ace抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法
CN104762358A (zh) * 2015-04-15 2015-07-08 浙江海洋学院 贻贝蛋白降压肽的快速制备方法
CN108840909A (zh) * 2018-07-24 2018-11-20 中国科学院海洋研究所 一种紫菜降压肽和紫菜降压肽提取物及应用
CN108892710A (zh) * 2018-07-24 2018-11-27 中国科学院海洋研究所 龙须菜降压肽提取物和龙须菜降压肽及其应用
CN110183516A (zh) * 2019-05-23 2019-08-30 合肥工业大学 一种降血压银杏果蛋白肽的制备方法
CN110194786A (zh) * 2019-05-23 2019-09-03 合肥工业大学 一种具有ace抑制活性的银杏果蛋白肽及其制备方法
CN111484545A (zh) * 2020-03-31 2020-08-04 华南农业大学 一种米酒糟来源的降血压寡肽及其制备方法与应用

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04279529A (ja) * 1991-03-06 1992-10-05 Gekkeikan Sake Co Ltd 経口摂取物
CN101126105A (zh) * 2007-06-28 2008-02-20 武汉工业学院 一种用大米分离蛋白制备降血压肽的方法
CN101709321A (zh) * 2009-12-02 2010-05-19 北京工商大学 一种燕麦多肽及其制备方法与应用
JP2014043442A (ja) * 2012-07-31 2014-03-13 Sunstar Inc 米糠酵素処理組成物
CN102864200A (zh) * 2012-09-17 2013-01-09 武汉工业学院 复合酶水解大米分离蛋白制备ace抑制肽的方法
CN103980347A (zh) * 2014-05-22 2014-08-13 浙江海洋学院 一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途
CN104450839A (zh) * 2014-11-05 2015-03-25 哈尔滨商业大学 具有ace抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法
CN104762358A (zh) * 2015-04-15 2015-07-08 浙江海洋学院 贻贝蛋白降压肽的快速制备方法
CN108840909A (zh) * 2018-07-24 2018-11-20 中国科学院海洋研究所 一种紫菜降压肽和紫菜降压肽提取物及应用
CN108892710A (zh) * 2018-07-24 2018-11-27 中国科学院海洋研究所 龙须菜降压肽提取物和龙须菜降压肽及其应用
CN110183516A (zh) * 2019-05-23 2019-08-30 合肥工业大学 一种降血压银杏果蛋白肽的制备方法
CN110194786A (zh) * 2019-05-23 2019-09-03 合肥工业大学 一种具有ace抑制活性的银杏果蛋白肽及其制备方法
CN111484545A (zh) * 2020-03-31 2020-08-04 华南农业大学 一种米酒糟来源的降血压寡肽及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"大米活性肽降血压功效及吸收评价";王申;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 工程科技I辑》;20150415(第4期);全文 *
"大米降压肽酶法制备工艺及其性质研究";陈季旺等;《农业工程学报》;20070531;第05卷;全文 *
"碎米蛋白ACE抑制肽制备工艺的研究";蒋艳等;《食品科技》;20120520;第37卷(第05期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112940079A (zh) 2021-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113215212B (zh) 一种具有抗氧化和ace抑制功能的大豆蛋白肽及其制备方法
Gran et al. Cyclic peptides from Oldenlandia affinis DC. Molecular and biological properties
CN105624247B (zh) 一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的制备方法
CN104710511A (zh) 一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽及其制备方法和用途
CN109320588A (zh) 一种刺参来源的ace抑制活性肽
CN111269290B (zh) 一种鲟鱼抗炎肽的制备方法
CN106699846B (zh) 一种抗肥胖十一肽nalkcchscpa
CN108841905B (zh) 一种具有ace抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽及其制备方法
CN112940079B (zh) 一种大米降压肽及其酶解制备方法
CN109206483A (zh) 一种贻贝来源的ace抑制及抗肿瘤活性肽
CN106749524B (zh) 一种抗肥胖七肽npvwkrk
CN115057916B (zh) 一种马氏珠母贝肉抗氧化多肽及其制备方法与应用
CN115960165B (zh) 一种来源于辣木叶的富硒ace抑制肽及其应用
CN115974969A (zh) 一种来源于富硒牡蛎的具有ace抑制活性的肽及其应用
CN112028970B (zh) 一种牡丹籽粕ace抑制肽及其制备方法与应用
CN114195857A (zh) 一种降压肽及其制备方法和应用
CN108101960B (zh) 一种具有ace抑制活性和抗肿瘤的多肽分子及其制备方法
CN106831947A (zh) 一种牡蛎来源的新型功能肽及其用途
CN106749533B (zh) 一种抗肥胖十七肽lnnpsvcdcdcmmkaar
CN115960166B (zh) 一种降血压富硒肽及其应用
KR20080034712A (ko) 대두 발효 조성물의 제조방법 및 이 조성물
CN104762357B (zh) 马面鲀鱼皮锌螯合肽制备方法
CN113444145B (zh) 一种聚球藻血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法与应用
CN116496355B (zh) 一种耐盐防弧菌抗菌肽fh-18及其制备方法和应用
CN113880916B (zh) 一种牦牛皮抗氧化多肽及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221128

Address after: 313000 Floor 2, Building 2, No. 85, Longtou Road, Luoshe Town, Deqing County, Huzhou City, Zhejiang Province

Patentee after: Zhejiang Shangjiahe Health Technology Co.,Ltd.

Address before: 510000 room 09, Room 201, 424 Gangwan Road, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province (office only)

Patentee before: Guangzhou mingchuang Biotechnology Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right