CN104762357B - 马面鲀鱼皮锌螯合肽制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种马面鲀鱼皮锌螯合肽制备方法，具体讲是以马面鲀鱼皮为原料，采用酸碱脱除鱼皮非胶原蛋白和矿物质后提取鱼皮明胶，利用中性蛋白酶和胰蛋白酶对鱼皮明胶进行酶解，采用超滤、固定化锌离子亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化得到锌螯合肽Gly‑Pro‑Tyr‑Gly‑Pro‑Phe‑Gly‑Pro‑Trp‑Gly（GPYGPFGPWG），ESI‑MS测定分子量为1034.09 Da。
Description
技术领域
本发明涉及一种水产品加工产物多肽，尤其涉及马面鲀鱼皮锌螯合肽制备方法。
背景技术
马面鲀俗名橡皮鱼、剥皮鱼，隶属于鲀形目、革鲀科，是我国的一种常见鱼类。马面鲀皮较厚且硬，无食用价值，多数扔掉，造成资源的浪费和环境污染。锌是人体必须的微量元素，儿童锌缺乏可导致生长发育不良、智力发育落后、免疫力降低等病症；孕妇缺锌，胎儿畸形率增高。传统的锌补充剂如硫酸锌和葡萄糖酸锌等吸收利用率低，肠胃刺激大，不利于长期服用。而锌螯合肽即可促进锌的吸收利用，同时又能满足机体对活性肽、氨基酸等的需求，而且无副作用，得到了广泛关注。
但是，申请人发现，以马面鲀鱼皮为原料制备马面鲀鱼皮锌螯合肽及其工艺研究处于空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状提供一种具有较强的锌螯合能力、易于消化吸收和安全无毒副作用的马面鲀鱼皮锌螯合肽的制备方法。
本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：马面鲀鱼皮锌螯合肽制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）马面鲀鱼皮明胶的制备：将马面鲀鱼皮绞碎，按照料液比1 g:15～20 mL加入到0.3～0.5%的NaOH溶液中搅拌5～8 h，用双蒸水洗至中性；然后按照1 g:10～15 mL加入到0.3～0.5%的H2SO4中，室温浸泡2 d，每8 h换水一次；最后将处理过的鱼皮匀浆，按照料液比1 g:8～10 mL加入到双蒸水中，于70℃动态提取12～15 h，然后于6 000g离心25～30 min，取上清液，冻干得马面鲀鱼皮明胶。
）马面鲀鱼皮明胶的酶解：将马面鲀鱼皮明胶按照料液比1 g:8～12 mL加入到巴比妥钠-盐酸中，调pH值至7. 0，于45～50℃保温5～10 min，按照鱼皮质量的2～3%加入中性蛋白酶（1.0×105 U/g），于45～50℃酶解3～5 h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持5～10 min后，冷却至35～40℃；调溶液pH值至8. 0，按照明胶质量的1.5～2.0%向溶液中加入胰蛋白酶（1.9×104 U/g），于温度35～40℃下酶解3～4 h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，10 000g离心15～20 min，取上清液，即为酶解产物；
3）马面鲀鱼皮锌螯合肽的制备：将制备的酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液依次经固定化锌离子亲和层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到马面鲀鱼皮锌螯合肽。
作为优选，所述步骤1）中的马面鲀为绿鳍马面鲀（Navodon septentrionalis）。
作为改进，所述步骤3）的固定化锌离子亲和层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化的具体过程为：
固定化锌离子亲和层析：将上述超滤酶解液溶于双蒸水配成浓度为8～10 mg/mL的溶液，经过固定化锌离子Sepharose 6B亲和层析柱吸附后，用3～5倍柱体积双蒸水洗脱除去未吸附的多肽，然后用5～8倍柱体积的pH 3.0的双蒸水洗脱层析柱，收集洗脱液，冻干，得亲和层析酶解物；
RP-HPLC纯化：将上述亲和层析酶解物用双蒸水配成100～120 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对锌离子的螯合活性得1个高Zn螯合活性多肽Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly（GPYGPFGPWG）。
优选，所述RP-HPLC条件为：进样量10～15 μL；色谱柱为Gemini C18（250 ×4.6mm，5 μm）；柱温为25～30 ℃；流动相：30%乙腈（含0.1%三氟乙酸）；洗脱速度0.5～0.8mL/min；紫外检测波长220 nm。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明选用中性蛋白酶和胰蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，制得的多肽具有较强的锌螯合能力，且具有易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作补锌药品或功能产品。
附图说明
图1是本发明的固定化锌离子亲和层析酶解物的RP-HPLC色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
马面鲀鱼皮锌螯合肽制备方法，工艺流程如下：马面鲀鱼皮"脱非胶原蛋白、脱钙、提取明胶"酶解"超滤"固定化锌离子亲和层析"高效液相色谱纯化"锌螯合肽"结构鉴定、活性评价。
实施例：
1）马面鲀鱼皮明胶的制备：将绿鳍马面鲀（Navodon septentrionalis）鱼皮绞碎，按照料液比1 g:15 mL加入到0.3%的NaOH溶液中搅拌5 h，用双蒸水洗至中性；然后按照1g:10 mL加入到0.4%的H2SO4中，室温浸泡2 d，每8 h换水一次；最后将处理过的鱼皮匀浆，按照料液比1:10加入到双蒸水中，于70℃动态提取15 h，于6 000g离心30 min，取上清液，冻干得马面鲀鱼皮明胶。
）马面鲀鱼皮明胶的酶解：将马面鲀鱼皮明胶按照料液比1 g: 12 mL加入到巴比妥钠-盐酸缓冲液中，调pH值至7. 0，于50℃保温10 min，按照鱼皮质量的2%加入中性蛋白酶（1.0×105 U/g），于50℃酶解3 h，将溶液升温至90℃，并于此温度保持15min后，冷却至37℃；调溶液pH值至8. 0，按照明胶质量的1.5%向溶液中加入胰蛋白酶（1.9×104 U/g），于温度37℃下酶解4 h，将溶液升温至95℃，并于此温度保持10min后，10 000g离心15 min，取上清液，即为酶解产物；
3）马面鲀鱼皮锌螯合肽的制备：将制备的酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液依次经固定化锌离子亲和层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到马面鲀鱼皮锌螯合肽。
①固定化锌离子亲和层析：将上述超滤酶解液溶于双蒸水配成浓度为8～10 mg/mL的溶液，经过固定化锌离子Sepharose 6B亲和层析柱吸附后，用3～5倍柱体积双蒸水洗脱除去未吸附的多肽，然后用5～8倍柱体积的pH 3.0的双蒸水洗脱层析柱，收集洗脱液，冻干，得亲和层析酶解物；
②RP-HPLC纯化：将上述亲和层析酶解物用双蒸水配成120 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（条件：进样量15 μL；色谱柱为Gemini C18（250 × 4.6mm，5 μm）；柱温为30℃；流动相30%乙腈（含0.1%三氟乙酸）；洗脱速度0.8 mL/min；紫外检测波长220 nm），根据对锌离子的螯合活性得1个高Zn螯合活性多肽（图1）。
③结构检测：收集Zn螯合活性最高的多肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly（GPYGPFGPWG），ESI-MS测定分子量为1034.09 Da。
Zn螯合肽对锌离子的螯合作用采用EDTA 滴定法测定。取待测样品100 mg 放入到100 mL烧杯中，加水50 mL和HCl（6 mol/L）数滴，在水浴上加热使样品完全溶解，冷却后定容至l00 mL，从中吸取l0 mL于三角瓶，平行3 份，加入l0 mL的NH3-NH4Cl缓冲液（pH 10），铬黑T作指示剂，然后用Na2EDTA溶液（0.01 mol/L）滴定至蓝色，记录消耗EDTA的毫升数，计算螯合物含锌量。
测定结果表明：纯化得到的Zn螯合胶原肽Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly（GPYGPFGPWG）对锌离子的螯合能力为56.74 μg/mg，与马面鲀鱼皮明胶酶解物（23.97 μg/mg）相比其对Zn的螯合能力有了显著提高。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋学院
<120> 马面鲀鱼皮锌螯合肽制备方法
<130> zjou-wb-201504-3
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Gly Pro Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Trp Gly
1 5 10
Claims (1)
1.马面鲀鱼皮锌螯合肽制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）马面鲀鱼皮明胶的制备：将马面鲀鱼皮绞碎，按照料液比1g:15mL～1g:20mL加入到0.3～0.5%的NaOH溶液中搅拌5～8h，用双蒸水洗至中性；然后按照1g:10mL～1g:15mL加入到0.3～0.5%的H2SO4中，室温浸泡2d，每8h换水一次；最后将处理过的鱼皮匀浆，按照料液比1:10加入到双蒸水中，于70℃动态提取12～15h，于6000g离心25～30min，取上清液，冻干得马面鲀鱼皮明胶；2）马面鲀鱼皮明胶的酶解：将马面鲀鱼皮明胶按照料液比1g:8～12mL加入到巴比妥钠-盐酸缓冲液中，调pH值至7.0，于45～50℃保温10～15min，按照鱼皮质量的2～3%加入中性蛋白酶，于45～50℃酶解3～5h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，冷却至35～40℃；调溶液pH值至8.0，按照明胶质量的1.5～2.0%向溶液中加入胰蛋白酶，于温度35～40℃下酶解3～4h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，10000g离心15～20min，取上清液，即为酶解产物；3）马面鲀鱼皮锌螯合肽的制备：将制备的酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液依次经固定化锌离子亲和层析和反相高效液相色谱纯化，得到马面鲀鱼皮锌螯合肽；
所述步骤1）中的马面鲀为绿鳍马面鲀；
所述步骤3）的固定化锌离子亲和层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：固定化锌离子亲和层析：将上述超滤酶解液溶于双蒸水配成浓度为8～10mg/mL的溶液，经过固定化锌离子Sepharose 6B亲和层析柱吸附后，用3～5倍柱体积双蒸水洗脱除去未吸附的多肽，然后用5～8倍柱体积的pH 3.0的双蒸水洗脱层析柱，收集洗脱液，冻干，得亲和层析酶解物；反相高效液相色谱纯化：将上述亲和层析酶解物用双蒸水配成100～120μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对锌离子的螯合活性得1个锌螯合肽Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly；所述反相高效液相色谱纯化条件为：进样量10～15μL；色谱柱为规格是250×4.6mm，5μm的Gemini C18柱；柱温为30℃；流动相为含0.1%三氟乙酸的30%乙腈；洗脱速度0.5～0.8mL/min；紫外检测波长220nm。
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