CN108841905B - 一种具有ace抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及功能性食品加工领域，具体公开了一种具有ACE抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽及其制备方法，所述制备方法包括：将蜂蛹蛋白液先经过碱性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解，再经过木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的酶解，最后经过风味蛋白酶的酶解，收集分子量小于2000道尔顿的蛋白肽液，再经过层析分离纯化，即得蜂蛹蛋白肽。本发明以蜂拥为原料，通过对蜂蛹的超高压、高温、高频超声波等预处理，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白复合酶进行分步酶解，通过膜分离、凝胶分离及反相HPLC分离技术，开发了具有ACE抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽。
Description
技术领域
本发明涉及功能性食品加工领域，具体地说，涉及一种具有ACE抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽及其制备方法。
背景技术
高血压是对人类健康危害极大的一种疾病，潜伏期长。高血压的早期阶段，一般没有明显不适症，直至发生临床迹象心脏病发作、脑血管破裂而导致死亡。
血管紧张素转化酶(Angiotensin I converting enzyme，ACE)为肾素-血管紧张素系统的关键酶。血管紧张素原在肾素的作用下转化为血管紧张素I，血管紧张素I在ACE的作用下转化为血管紧张素II，刺激血管收缩，造成血压上升。抑制ACE的活性对血压控制有着积极的作用，因而开发有效的ACE抑制剂引起人们的极大关注。虽然来源于食物的ACE抑制肽比人工合成的ACE抑制剂作用弱，但是它有其独特的优点，不会产生降压过度的问题，安全性高，无副作用，除降压功能外，往往同时具有免疫促进、易消化吸收等功能。由于药物疗法存在副作用，天然食物中的降血压功能因子的开发利用将成为今后高血压非药物治疗的重要部分。
疲劳是机体脑力或体力到达一定阶段时必然出现的一种正常的生理现象。它是防止机体发生威胁生命的过度机能衰竭所产生的一种保护性反应。抗疲劳肽不仅可以提供人体所必需的氨基酸和能源物质、同时又能够维持机体酶的活性以及内环境的稳定、增强抗氧化能力、防止神经递质失衡等诸多功能特性，抗疲劳肽主要通过增强肌肉力量、提高机体运动耐力，从而迅速消除或延迟疲劳的产生，帮助恢复和增强体力。
目前国内外专利中未见利用蜂蛹蛋白资源制备ACE抑制肽的专利文献报道，关于利用蜂蛹开发具有ACE抑制和抗疲劳功能的蛋白多肽方面的研究很少，目前国内外均未见利用蜂蛹蛋白资源制备具有ACE抑制和抗疲劳功能肽的文献报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明以蜂蛹为原料，经过大量的实验，开发了一种具有较好ACE抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽及其制备方法。
第一方面，本发明首先提供一种具有ACE抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽的制备方法，所述制备方法包括：将蜂蛹蛋白液先经过碱性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解，再经过木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的酶解，最后经过风味蛋白酶的酶解，收集分子量小于2000道尔顿的蛋白肽液，再经过层析分离纯化，即得所述蜂蛹蛋白肽。
进一步地，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的质量之和为蜂蛹蛋白液中蛋白质量的0.2％-0.5％，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1-2:1；所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解条件为在50-60℃下进行酶解反应0.5-1.5h。
所述木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的质量之和为蜂蛹蛋白液中蛋白质量的0.1％-0.4％，所述木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的酶解条件为在45-55℃下进行酶解反应0.5-1.5h。
所述风味蛋白酶的质量为蜂蛹蛋白液中蛋白质量的0.1％～0.2％，所述风味蛋白酶的酶解条件为在50～60℃下进行酶解反应0.25～0.5h。
进一步地，经风味蛋白酶酶解后，将所得酶解液置于90-95℃下保温10-20分钟，冷却至室温，加入酶解液质量0.1％-0.3％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；再对所述分离液进行超滤，收集分子量小于2000道尔顿的蛋白肽液。
作为优选，所述超滤为二步处理，先利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜超滤，将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
进一步地，将所述分子量小于2000道尔顿的蛋白肽液经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到蜂蛹蛋白肽粉。
更进一步地，本发明所述的蜂蛹蛋白液以蜂蛹为原料，经100-200Mpa超高压处理后，加入1-3倍水，在115-125℃条件下处理1-2小时，冷却到60-85℃后，进行打浆、离心、去脂，再置于65-75℃下经90-120kH超声波处理20-30分钟而得。
作为一种优选方案，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)选用冷冻鲜蜂蛹，洗净后，先经过100-200Mpa处理1-2分钟，将蜂蛹放置于1.0-3.0倍的水中，在115-125℃条件下处理1-2小时，冷却到60-85℃，用打浆机将蜂蛹打成浆，通过离心机去脂，得到蜂蛹蛋白液；
(2)将步骤(1)得到的蜂蛹蛋白液，在65-75℃下，经90-120kH超声波处理20-30分钟；
(3)调节蜂蛹蛋白液中蛋白含量为7％-9％，第一步利用0.2-0.5％复合蛋白酶一，在50-60℃条件下进行酶解反应0.5-1.5h；然后进行第二步利用0.1％-0.4％复合蛋白酶二，在45-55℃条件下进行酶解反应0.5-1.5h；第三步利用0.1％-0.2％风味蛋白酶，在50-60℃条件下进行酶解反应0.25-0.5h；在90-95℃下保温10-20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.1-0.3％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
其中，所述复合蛋白酶一由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按照质量比为1-2：1组成；所述复合蛋白酶二由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶按质量比为1：1-2组成；
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取15-16分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到蜂蛹蛋白肽粉；通过LC-MS/MS对蜂蛹蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为AVFPSIVGR，PPVLVFV的肽的含量为53-58％。
需要说明的是，由本发明所述方法制备得到的蜂蛹蛋白肽也属于本发明的保护范围。
利用本发明所制备的蜂蛹蛋白肽制备药物或功能性食品的应用也属于本发明的保护范围。
其中，所述药物或功能性食品的功能依赖于本发明所述蜂蛹蛋白肽的ACE抑制和抗疲劳功能。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明以蜂拥为原料，通过对蜂蛹的超高压、高温高压、高频超声波等预处理，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白复合酶进行分步酶解，通过膜分离、凝胶分离及反相HPLC分离技术，开发了具有特定氨基酸多肽序列(AVFPSIVGR，PPVLVFV)的具有ACE抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽，建立一套简单高效的多功能蜂蛹蛋白肽的制备方法。
更为具体地，本发明具有的优点如下:(1)本发明开发的蜂蛹蛋白肽整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，产品灰分含量低，小于1％。(2)开发的蛋白肽具有较好的ACE抑制功能(IC50值)小于0.070mg/mL和抗疲劳功能。(3)本发明利用超高压结合特定频率超声波技术处理的蜂蛹蛋白液，可以明显改善蜂蛹蛋白对酶的敏感性，降低酶的使用量。(4)开发的产品安全，本发明采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量和肽组成的蜂蛹蛋白肽，不加任何添加剂，为100％蜂蛹蛋白肽。(5)本发明开发的蛋白肽，通过活性炭过滤具有良好的风味和色泽，能广泛应用于特需食品和营养食品。(6)本发明开发蜂蛹蛋白肽中分子量小于1500的肽的比例为93％以上，具有较明确的肽的组成，其中AVFPSIVGR，PPVLVFV的肽的含量为53％以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1具有ACE抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽的制备方法
(1)选用冷冻鲜蜂蛹100克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,蜂蛹先经过超高压(100Mpa处理2分钟)，将蜂蛹放置于1倍的水中，在115条件下处理2小时，冷却到65℃，用打浆机将蜂蛹打成浆，通过离心机去脂，得到蜂蛹蛋白液；
(2)将步骤(1)得到的蜂蛹蛋白液，温度调整到65℃，利用超声波发生器经超声波(频率为90kH)处理25分钟，改变蜂蛹蛋白的组织结构；
(3)调节蜂蛹蛋白液中蛋白含量为9％，第一步利用0.5％复合蛋白酶一(碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成，二者质量比为2：1)，在50℃条件下进行酶解反应1.0h；然后进行第二步利用0.4％复合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和中性蛋白酶组成，二者质量比为1：1)，在55℃条件下进行酶解反应1.0h；第三步利用0.1％风味蛋白酶，在55℃条件下进行酶解反应0.5h；在95℃下保温10分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.1％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取15-16分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到蜂蛹蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蜂蛹蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为AVFPSIVGR、PPVLVFV的肽的含量为55％。
实施例2具有ACE抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽的制备方法
(1)选用冷冻鲜蜂蛹500克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,蜂蛹先经过超高压(150Mpa处理1.5分钟)，将蜂蛹放置于1.5倍的水中，在121条件下处理1.5小时，冷却到80℃，用打浆机将蜂蛹打成浆，通过离心机去脂，得到蜂蛹蛋白液；
(2)将步骤(1)得到的蜂蛹蛋白液，温度调整到70℃，利用超声波发生器经超声波(频率为80kH)处理25分钟，改变蜂蛹蛋白的组织结构；
(3)调节蜂蛹蛋白液中蛋白含量为8％，第一步利用0.4％复合蛋白酶一(碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成，二者质量比为1∶1)，在50℃条件下进行酶解反应1.5h；然后进行第二步利用0.3％复合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和中性蛋白酶组成，二者质量比为1∶1)，在50℃条件下进行酶解反应1.0h；第三步利用0.1％风味蛋白酶，在55℃条件下进行酶解反应0.25h；在95℃下保温10分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取15-16分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到蜂蛹蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蜂蛹蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为AVFPSIVGR、PPVLVFV的肽的含量为54％。
实施例3具有ACE抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽的制备方法
(1)选用冷冻鲜蜂蛹1000克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,蜂蛹先经过超高压(200Mpa处理1分钟)，将蜂蛹放置于2.0倍的水中，在125℃条件下处理1小时，冷却到85℃，用打浆机将蜂蛹打成浆，通过离心机去脂，得到蜂蛹蛋白液；
(2)将(1)得到的蜂蛹蛋白液，温度调整到75℃，利用超声波发生器经超声波(频率为60kH)处理30分钟，改变蜂蛹蛋白的组织结构；
(3)调节蜂蛹蛋白液中蛋白含量为7％，第一步利用0.3％复合蛋白酶一(碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成，二者质量比为2：1)，在55℃条件下进行酶解反应1.5h；然后进行第二步利用0.2％复合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和中性蛋白酶组成，二者质量比为1：2)，在55℃条件下进行酶解反应1.5h；第三步利用0.1％风味蛋白酶，在55℃条件下进行酶解反应0.5h；在90℃下保温15分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.3％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取15-16分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到蜂蛹蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蜂蛹蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为AVFPSIVGR、PPVLVFV的肽的含量为53％。
对比例1
(1)选用冷冻鲜蜂蛹1000克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,蜂蛹先经过超高压(200Mpa处理1分钟)，将蜂蛹放置于2.0倍的水中，在125℃条件下处理1小时，冷却到85℃，用打浆机将蜂蛹打成浆，通过离心机去脂，得到蜂蛹蛋白液；
(2)将(1)得到的蜂蛹蛋白液，温度调整到75℃，利用超声波发生器经超声波(频率为60kH)处理30分钟，改变蜂蛹蛋白的组织结构；
(3)调节蜂蛹蛋白液中蛋白含量为7％，第一步利用0.2％复合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和中性蛋白酶组成，二者质量比为1：2)，在55℃条件下进行酶解反应1.5h；然后进行第二步利用0.3％复合蛋白酶一(碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成，二者质量比为2：1)，在55℃条件下进行酶解反应1.5h；第三步利用0.1％风味蛋白酶，在55℃条件下进行酶解反应0.5h；在90℃下保温15分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.3％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取15-16分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到蜂蛹蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蜂蛹蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为AVFPSIVGR、PPVLVFV的肽的含量为23％。
对比例2
(1)选用冷冻鲜蜂蛹1000克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,蜂蛹先经过超高压(200Mpa处理1分钟)，将蜂蛹放置于2.0倍的水中，在125℃条件下处理1小时，冷却到85℃，用打浆机将蜂蛹打成浆，通过离心机去脂，得到蜂蛹蛋白液；
(2)将(1)得到的蜂蛹蛋白液，温度调整到75℃，利用超声波发生器经超声波(频率为60kH)处理30分钟，改变蜂蛹蛋白的组织结构；
(3)调节蜂蛹蛋白液中蛋白含量为7％，第一步利用0.1％风味蛋白酶，在55℃条件下进行酶解反应0.5h；然后进行第二步利用0.3％复合蛋白酶一(碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成，二者质量比为2：1)，在55℃条件下进行酶解反应1.5h；第三步利用0.2％复合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和中性蛋白酶组成，二者质量比为1：2)，在55℃条件下进行酶解反应1.5h；在90℃下保温15分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.3％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取15-16分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到蜂蛹蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蜂蛹蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为AVFPSIVGR、PPVLVFV的肽的含量为29％。
实验例1蜂蛹蛋白肽血管紧张素转化酶(ACE)抑制能力的测定试验
试验样品：样品1-3分别为实施例1-3制备的蜂蛹蛋白肽粉，样品4为由实施例1步骤(1)所得的蜂蛹蛋白液直接经过冷冻干燥得到的蜂蛹蛋白粉，样品5-6为对比例1、对比例2制备的蜂蛹蛋白肽粉，样品AVFPSIVGR和样品PPVLVFV分别为根据氨基酸序列AVFPSIVGR和PPVLVFV人工合成的多肽。
样品的ACE抑制能力按照如下方法进行测定：
ACE抑制率的方法。用高效液相色谱在228nm下定量检测释放出的Hip量，从而计算出多肽的ACE抑制率。
1、试剂的配置
pH8.3的磷酸盐缓冲溶液：用超纯水配制，其中含磷酸盐50mmol/L，NaCl 300mmol/L，调整pH到8.3；
ACE酶液：将2mL的磷酸盐缓冲液加入1U的ACE中，使其浓度变为0.5U/mL。
HHL溶液：使用磷酸缓冲液溶解HHL，使其终浓度为5mmol/L。
样品溶液：称取适量样品，用磷酸盐缓冲液所需浓度的溶液。
2、ACE抑制率测定的色谱条件
检测波长：228nm；流速:1mL/min；流动相A:超纯水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B:甲醇(含0.1％三氟乙酸)；进样量:10μL，手动进样。
3、测定ACE抑制活性的方法
取120μL HHL底物溶液，加入20μL的样品混合均匀，在37℃恒温水浴中保温10min。然后加入10μL ACE酶液在37℃恒温水浴中反应30min，再加入150μL 1mol/L的HCl终止反应，得到反应液。该反应液利用HPLC进行分析，同时设置空白对照组。ACE抑制活性计算公式如下：
ACE抑制活性％＝(M-N)/M×100％
式中，M为对照组中马尿酸的峰面积，N为添加的样品组中马尿酸的峰面积。
4、半抑制浓度的测定
按照ACE抑制肽体外检测方法测定其抑制活性，以浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算出IC50值。结果见表1。
5、蜂蛹蛋白肽中分子量分布的测定：参照GB/T22729-2008方法测定。
由表1可知，本发明制备的蜂蛹蛋白肽具有很好的ACE抑制活性，其IC50值小于0.069mg/mL，蜂蛹蛋白肽中分子量小于1500的达到93％以上。不同的酶解顺序，其ACE抑制活性有较大的差异。
表1蜂蛹蛋白肽的ACE抑制活性实验结果
实验例2本发明蜂蛹蛋白肽延缓疲劳功能的测定试验
试验样品：样品1-3分别为实施例1-3制备的蜂蛹蛋白肽粉，样品4为由实施例1步骤(1)所得的蜂蛹蛋白液直接经过冷冻干燥得到的蜂蛹蛋白粉，样品5-6分别为对比例1-2制备的蜂蛹蛋白肽粉。
按照如下方法进行：
1、实验动物饲养与分组
280只清洁级昆明种小鼠，于洁净动物实验室适应性饲养一周，每8-10只一笼，分笼饲养，保持垫料干燥卫生，每三天换洗一次。每天按时打扫，做好消毒灭菌等工作，保证洁净动物实验室干净整洁。室温25±2℃，相对湿度50±5％，光照明暗间隔为12h，以鼠标准饲料常规饲养，自由进食和饮水，每周记录一次小鼠体重。经过一周的适应期后，280只小鼠随机分为7组，即空白组、样品1组、样品2组、样品3组、样品4组、样品5组和样品6组。空白组小鼠灌胃等量的生理盐水，其它6组的剂量设为140mg/kg/d，每天上午9:00-10:30期间灌胃，灌胃30天后，检测受试样品的抗疲劳功效。
2、负重游泳实验
末次给样30min后，从各组中随机取10只小鼠，将其尾根部缠绕5％体重的铅皮后，放置于游泳箱中游泳。水深不少于30cm，水温25±1℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。
3、肝糖原、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定
末次给样30min后，从各组中随机取10只小鼠拔眼球采全血，将收集到的血液于3000r/min离心10min，取血清备用，按照CAT、SOD和GSH-Px测试盒进行测定。采血完成后，立即解剖小鼠，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏100mg，按照肝糖原检测试剂盒说明进行测定。
4、全血乳酸测定
各组中随机取10只小鼠，末次给样30min后采血，然后在温度为30℃的水中不负重游泳10min后停止，用毛细管从眼内毗采血，分别测定游泳前、游泳10min后、游泳后休息20min的全血乳酸含量。
表2蜂蛹蛋白肽对小鼠抗疲劳能力的影响
从表2可以看出，蜂蛹蛋白肽可以延长小鼠的游泳时间，可以改善小鼠能量代谢体系，促进肝糖原的合成，从而贮存更多的能源物质，提升CAT、SOD及GSH-Px酶的活力,延缓体力疲劳；对短时间运动后乳酸水平的升高有明显的抑制作用，可以在一定程度上帮助机体延缓乳酸的堆积；休息20min后，乳酸含量均有显著地下降，可以帮助机体加速清除乳酸的堆积。不同酶解方法得到的蜂蛹蛋白肽具有显著的差异。本发明开发的样品1-3抗疲劳功能显著优于其他产品。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种具有ACE抑制和抗疲劳功能的蜂蛹蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将蜂蛹蛋白液先经过碱性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解，再经过木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的酶解，最后经过风味蛋白酶的酶解，收集分子量小于2000道尔顿的蛋白肽液，再经过层析分离纯化，即得；其中，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的质量之和为蜂蛹蛋白液中蛋白质量的0.2％-0.5％，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1-2:1；所述木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的质量之和为蜂蛹蛋白液中蛋白质量的0.1％-0.4％；所述风味蛋白酶的质量为蜂蛹蛋白液中蛋白质量的0.1％～0.2％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解条件为在50-60℃下进行酶解反应0.5-1.5h。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的酶解条件为在45-55℃下进行酶解反应0.5-1.5h。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述风味蛋白酶的酶解条件为在50～60℃下进行酶解反应0.25～0.5h。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，经风味蛋白酶酶解后，将所得酶解液置于90-95℃下保温10-20分钟，冷却至室温，加入酶解液质量0.1％-0.3％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；再对所述分离液进行超滤，收集分子量小于2000道尔顿的蛋白肽液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超滤为二步处理，先利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜超滤，将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，将所述分子量小于2000道尔顿的蛋白肽液经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取15-16分收集的肽溶液，通过浓缩、冷冻干燥，得到蜂蛹蛋白肽粉。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述蜂蛹蛋白液以蜂蛹为原料，经100-200Mpa超高压处理后，加入1-3倍水，在115-125℃条件下处理1-2小时，冷却到60-85℃后，进行打浆、离心、去脂，再置于65-75℃下经90-120kH超声波处理20-30分钟而得。
9.由权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的蜂蛹蛋白肽。
10.权利要求9所述的蜂蛹蛋白肽在制备功能性食品方面的应用。
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