JPH09194390A - 内臓脂肪蓄積抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 内臓における脂肪の蓄積を抑制して、成人病
の大きな原因ともいわれている内臓脂肪型肥満を防止す
ることのできる、安全性に優れる内臓脂肪蓄積抑制剤を
提供すること。 【解決手段】 小麦由来のアミラーゼ阻害物質を有効成
分とする本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤によって上記の目
的を達成することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は内臓脂肪蓄積抑制剤
に関する。より詳細には、小麦由来のアミラーゼ阻害物
質を有効成分とする内臓脂肪蓄積抑制剤に関するもので
あり、本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤を摂取すると、内臓
脂肪の蓄積を抑制して、成人病の原因ともいわれている
内臓脂肪型肥満を防止することができる。

【０００２】

【従来の技術】近年わが国では食生活が豊かになり、動
脈硬化や糖尿病のような成人病が急増している。これら
の原因としては、加齢によって基礎代謝量が減少してい
るにも拘わらず、脂肪や糖類を過剰摂取し、さらには運
動不足の要因も重なり、肥満体型になることが指摘され
ている。特に、内臓に脂肪が蓄積する内臓脂肪型肥満
は、皮下に脂肪が蓄積する皮下脂肪型肥満と比べて、成
人病にかかる危険が極めて高く、成人病の予防のために
は内臓脂肪型肥満を防止することが重要であるとされて
いる。かかる点から、内臓脂肪の蓄積を円滑に抑制する
ことができ、しかも安全性に優れる物質や剤の開発が求
められているが、未だその目的を充分に達成できていな
いのが実情である。

【０００３】また、従来より小麦由来のアミラーゼ阻害
物質が人間の膵臓α−アミラーゼの活性を阻害し、摂取
した澱粉の消化を緩やかにして血糖値の上昇を抑制した
り、インシュリンの分泌を低下させて、血糖値の高い人
や、糖尿病予備軍とされている人にとって有効であるこ
とが知られている。また、小麦由来のアミラーゼ阻害物
質にはダイエット効果があることも知られている。

【０００４】

【発明の内容】上記のような状況下に、本発明者らは、
小麦由来のアミラーゼ阻害物質に関して、その機能およ
び化学構造などに関して研究を重ねてきた。そして、高
いアミラーゼ阻害活性を有するアミラーゼ阻害物質を小
麦粉等の抽出液から工業的に効率よく製造し得る方法を
確立して先に出願した（特開平５−３０１８９８号公
報、特開平７−４８２６８号公報および特開平７−４８
４００号公報）。さらに本発明者らは、前記の方法とは
異なる特定の調製方法によって、極めて高い活性を有す
る、配列番号１で表されるサブユニット２個からなる新
規な蛋白質を見出して先に出願した（特開平７−４１４
９９号公報）。

【０００５】そして、上記した本発明者らによる発明を
ベースとして、更に研究を続けてきたが、小麦由来のア
ミラーゼ阻害物質が、内臓脂肪の蓄積抑制に効果がある
ことを見出して本発明を完成した。小麦由来のアミラー
ゼ阻害物質が内臓脂肪の蓄積抑制を有するという本発明
者らによるかかる知見は、これまでに知られている小麦
由来のアミラーゼ阻害物質の機能、すなわち、澱粉の消
化抑制機能、血糖値の上昇抑制機能、インシュリン分泌
の抑制機能およびダイエット機能とは異質の機能であ
り、全く予想外のものであった。

【０００６】したがって、本発明は、小麦由来のアミラ
ーゼ阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする内
臓脂肪蓄積抑制剤である。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下に、本発明について詳細に説
明する。本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤では、その有効成
分であるアミラーゼ阻害物質として、小麦由来のアミラ
ーゼ阻害物質であって且つ高いアミラーゼ阻害活性を有
するものであればいずれも使用でき、特に制限されな
い。

【０００８】小麦由来のアミラーゼ阻害物質としては、
本発明者らが見出した配列番号１で表されるサブユニッ
ト２個からなる蛋白質（以下これを「０．２６ＡＩ_a」
という）（特開平７−４１４９９号公報参照）、本発明
者らがさらに新たに見出した配列番号２で表されるサブ
ユニット２個からなる蛋白質（以下これを「０．２６Ａ
Ｉ_b」という）、配列番号３で表されるサブユニット２
個からなる従来公知の蛋白質（以下これを「０．１９Ａ
Ｉ」という）［Biochim. Biophys. Acta, Vol.828, 212
−221（1985）、特開平５−３０１９８号公報、特開平
７−４８２６８号公報等を参照］、配列番号４で表され
るサブユニット２個からなる蛋白質（以下これを「０．
５３ＡＩ」という）［Biochim. Biophys. Acta, Vol. 7
43, 52−57（1983）参照］および配列番号５で表される
蛋白質（以下これを「０．２８ＡＩ」という）［Phytoc
hemistry. Vol. 20, No.8, 1781−1784（1981）参照］
などを挙げることができる。そして、前記した蛋白質は
いずれもアミラーゼ阻害活性を有しているが、そのうち
でも、下記の表１に示すように、０.２６ＡＩ_a、０．２
６ＡＩ_bおよび０．１９ＡＩが高いアミラーゼ阻害活性
を有している。したがって、本発明の内臓脂肪蓄積抑制
剤は、その有効成分であるアミラーゼ阻害物質として、
高いアミラーゼ阻害活性を有する０．２６ＡＩ_a、０．
２６ＡＩ_bおよび０．１９ＡＩの少なくとも１種を高割
合で含んでいるのが好ましい。

【０００９】

【表１】 小麦由来の蛋白質の種類 アミラーゼ阻害活性（Ｕ／ｍｇ） ０．２６ＡＩ_a（配列番号１） ２６,１００ ０．２６ＡＩ_b（配列番号２） ２０,５００ ０．１９ＡＩ （配列番号３） ２０,３００ ０．５３ＡＩ （配列番号４） ３,９４０ ０．２８ＡＩ （配列番号５） ８４０

【００１０】ここで、上記の表１の場合を含めて、本明
細書における小麦由来の蛋白質のアミラーゼ阻害活性の
値は、人膵臓α−アミラーゼに対する阻害活性の値で表
したものであって、次の測定法により得られる値であ
る。

【００１１】人膵臓α−アミラーゼに対する阻害活性の
測定法：試料水溶液と人膵臓α−アミラーゼを、５０ｍ
Ｍ NaCl、５ｍＭ CaCl₂および０．０２％卵白アルブミン
を含む２０ｍＭ ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エ
タンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ６．９）中に加えて３７
℃で３０分間放置した後、１．５％可溶性澱粉溶液（ｐ
Ｈ６．９）を０．５ｍｌ混合する。この液を３７℃に１
０分間保って反応を行わせた後、２．５ｍｌの反応停止
液（０．０８ＭＨＣｌおよび０．４Ｍ酢酸）を加える。
反応液より０．２ｍｌ採取し、これに２．５ｍｌのヨウ
素液（０．０５％ ＫＩおよび０．００５％ヨウ素）を
加えて、６６０ｎｍでの吸光度を測定する。なお、測定
に当たっては、試料液を含まないときに吸光度を８０％
減少させるアミラーゼ量を用い、このときのアミラーゼ
活性を５０％阻害するアミラーゼ阻害活性を１ユニット
（Ｕ）として表わす。

【００１２】本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤は、１種類の
小麦由来のアミラーゼ阻害物質のみを含有していても、
または２種以上の小麦由来のアミラーゼ阻害物質を含有
していてもよい。例えば、本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤
は、有効成分であるアミラーゼ阻害物質として、０．２
６ＡＩ_a、０．２６ＡＩ_bおよび０．１９ＡＩのうちの１
種類のみを含有していても、２種類を含有していても、
または３種類（全部）を含有していてもよい。或いは、
本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤は、０．２６ＡＩ_a、０．
２６ＡＩ_bおよび０．１９ＡＩのうちの少なくとも１種
を高割合で含有し、０．５３ＡＩ、０．２８Ａなどのア
ミラーゼ阻害活性のあまり高くないアミラーゼ阻害物質
を低割合で含有するものであってもよい。

【００１３】一般に、小麦由来のアミラーゼ阻害物質を
工業的に生産性よく得るには、０．２６ＡＩ_a、０．２
６ＡＩ_bまたは０．１９ＡＩなどの各々の蛋白質（アミ
ラーゼ阻害物質）が高純度で得られるまで精製するより
は、０．２６ＡＩ_a、０．２６ＡＩ_b、０．１９ＡＩ、お
よび場合により０．５３ＡＩや０．２８Ａなどを含む、
複数の蛋白質（アミラーゼ阻害物質）の混合物（粗精製
物）の形態で得る方が便利であり、そのような混合物
（粗精製物）であっても、そのアミラーゼ阻害活性が高
いときには良好な内臓脂肪蓄積抑制効果を示す。したが
って、本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤では、有効成分であ
るアミラーゼ阻害物質として、高度に精製した０．２６
ＡＩ_a、０．２６ＡＩ_bまたは０．１９ＡＩを用いる場
合、およびそれらの混合物の形態の粗精製物を用いる場
合の両方を包含しており、前記した複数のアミラーゼ阻
害活性を有する蛋白質の混合物（粗精製物）からなるア
ミラーゼ阻害物質を用いる場合は、低コストで内臓脂肪
蓄積抑制剤を得ることができる。

【００１４】何ら限定されるものではないが、本発明の
内臓脂肪蓄積抑制剤で有効に使用し得る、０．２６ＡＩ
_a、０．２６ＡＩ_b、０．１９ＡＩやその他のアミラーゼ
阻害活性を有する蛋白質の混合物（粗精製物）からなる
アミラーゼ阻害物質としては、例えば下記の〜のも
のを挙げることができる。

【００１５】本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤で用い得るア
ミラーゼ阻害物質（混合物）の例： （ａ₁）小麦、小麦粉または小麦グルテンを水、希
酸、希アルカリまたは含水アルコールで抽出してアミラ
ーゼ阻害物質を含有する液を得る工程；（ｂ₁）前記工
程で得たアミラーゼ阻害物質を含有する液に、アミラー
ゼ阻害物質と不溶性の複合体を形成する多糖類を加え
て、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性の複合体を
生成させ、その複合体を液から分別する工程；（ｃ₁）
前記工程で分別した複合体から多糖類を分離除去してア
ミラーゼ阻害物質を含有する液を分取する工程；および
（ｄ₁）前記工程で分取したアミラーゼ阻害物質を含有
する液を陽イオン交換体で処理して陽イオン交換体非吸
着画分からアミラーゼ阻害物質を回収する工程によって
得られるアミラーゼ阻害物質（特開平５−３０１８９８
号公報参照）。

【００１６】 （ａ₂）小麦、小麦粉または小麦グル
テンを水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールで抽
出して得られたアミラーゼ阻害物質を含有する液、或い
は小麦粉から澱粉および／またはグルテンを採取する際
に排出されるアミラーゼ阻害物質を含有する水洗廃液
に、アミラーゼ阻害物質と不溶性の複合体を形成する多
糖類を加えて、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性
の複合体を生成させ、その複合体を液から分別する工
程；（ｂ₂）前記工程で分別した複合体から多糖類を分
離除去してアミラーゼ阻害物質を含有する液を分取する
工程；（ｃ₂）前記工程で得たアミラーゼ阻害物質を含
有する液中の蛋白質の４０〜７０％の蛋白質を沈殿さ
せ、沈殿した蛋白質を分取した後それを水に溶解させて
アミラーゼ阻害物質を含有する液を得る工程；（ｄ₂）
前記工程で得た液にカルシウムイオンとリン酸イオンを
加えてアミラーゼ阻害物質を含む不溶性複合体を生成さ
せ、その不溶性複合体を分別する工程；および（ｅ₂）
前記工程で分別した不溶性複合体からアミラーゼ阻害物
質を水に可溶化させてアミラーゼ阻害物質を含有する液
を得る工程を包含し、且つ上記工程（ｃ₂）の終了まで
の任意の段階で不純蛋白質およびその他の不純物を除去
する処理工程により得られるアミラーゼ阻害物質（特開
平７−４８２６８号公報参照）。

【００１７】 （ａ₃）小麦、小麦粉または小麦グル
テンを水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールで抽
出して得られたアミラーゼ阻害物質を含有する液、或い
は小麦粉から澱粉および／またはグルテンを採取する際
に排出されるアミラーゼ阻害物質を含有する水洗廃液を
処理して液中に含まれる可溶性の不純蛋白質およびその
他の不純物を不溶性固形分の形態に変えて分離除去する
工程；（ｂ₃）上記工程（ａ₃）で得た不純物除去後の液
中で不溶性のリン酸カルシウムゲルを形成させると共に
液中に含まれているアミラーゼ阻害物質をリン酸カルシ
ウムゲルに吸着させた後、アミラーゼ阻害物質を吸着含
有するリン酸カルシウムゲルを液から分離回収する工
程；（ｃ₃）上記工程（ｂ₃）で回収したアミラーゼ阻害
物質を吸着含有する不溶性リン酸カルシウムゲルからア
ミラーゼ阻害物質を水に可溶化させてアミラーゼ阻害物
質を含有する液を得る工程；および（ｄ₃）上記工程
（ｃ₃）で得た液からアミラーゼ阻害物質を回収する工
程により得られるアミラーゼ阻害物質（特開平７−４８
４００号公報参照）。

【００１８】また、本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤で用い
る得る上記した０．２６ＡＩ_bは、今回本発明者らが新
たに見出した新規なアミラーゼ阻害物質であり、限定さ
れるものではないが、この０．２６ＡＩ_bは、例えば、
上記した〜のアミラーゼ阻害物質（アミラーゼ阻害
活性を有する複数の蛋白質の混合物からなるアミラーゼ
阻害物質；粗精製物）を、高速液体クロマトグラフィー
にかけて、例えば０．１％トリフルオロ酢酸水溶液をＡ
液とし、８０％アセトニトリルと０．１％トリフルオロ
酢酸の水溶液をＢとして、時間／濃度勾配を有する高圧
リニアグラジエント溶出を行って、それぞれのアミラー
ゼ阻害物質（蛋白質）をそのリテンションタイムの違い
によって分画し、０．２６ＡＩ_bに相当する画分を回収
することによって得ることができる。

【００１９】より具体的には、下記の参考例１の（１）
〜（４）の工程を行って、その工程（４）で得られた乾
燥粉末１ｇを０．１％トリフルオロ酢酸水溶液１００ｍ
ｌに溶解し、下記の表２に示す条件の高速液体クロマト
グラフィーに供して分画すると、０．２６ＡＩ_bが分離
し、それを回収することによって０．２６ＡＩ_bを得る
ことができる。

【００２０】

【表２】 高速液体クロマトグラフィー条件 カラム： 充填材：CAPCELL PAK C18 SG120Å(粒径3μｍ)(資生堂社製) サイズ：４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ 温 度：５０℃ 流 速：０．５ｍｌ／分 検 出：２８０ｎｍにおける吸光度 移動相： Ａ液；０．１％トリフルオロ酢酸水溶液 Ｂ液；８０％アセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢酸の水溶液 よりなる下記の時間／濃度勾配を有する高圧リニアグラジエンド溶出 時間(分) Ａ液(％) Ｂ液(％) ０ ６５.５ ３４.５ ３０ ６５.５ ３４.５ ６０ ６４.５ ３５.５ ６０.１ ０ １００ ６５.０ ０ １００

【００２１】本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤は、小麦由来
のアミラーゼ阻害物質（複数のアミラーゼ阻害活性を有
する蛋白質の混合物からなるアミラーゼ阻害物質である
場合は全合計）を、内臓脂肪蓄積抑制剤１ｍｇ当たり、
アミラーゼ阻害活性値で、２，０００〜３０，０００ユ
ニット（Ｕ）の割合で含有するのが、その内臓脂肪の蓄
積抑制効果を発揮させる上から好ましい。

【００２２】また、本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤は、上
記したアミラーゼ阻害物質のみからなっていても、また
はアミラーゼ阻害物質の他に場合により小麦に由来する
他の成分、例えば蛋白質類、ペプチド類、その他の物質
（澱粉、食物繊維、ビタミン、無機質など）を含有して
いてもよい。

【００２３】本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤は、そのまま
直接摂取しても、または公知の担体や助剤等を使用して
液剤、顆粒剤、錠剤等の形態にして使用することができ
る。更に、内臓脂肪蓄積抑制剤を、食品、特に澱粉質を
多く含むパン、クッキー、麺類等の炭水化物系食品に添
加して使用したり、お茶類、スープ類、ふりかけ、バタ
ー、ジャム等のスプレッド類に添加して使用することが
できる。そして、本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤を食品な
どに添加して使用する場合は、小麦由来のアミラーゼ阻
害物質は高温（通常１００℃以上）に加熱されるとその
アミラーゼ阻害活性を失ったり、低減したりすることが
多いので、アミラーゼ阻害物質のアミラーゼ阻害活性が
失われないように注意することが肝要である。また、本
発明の内臓脂肪蓄積抑制剤を食品に添加する場合は、１
食当たり、１００ｍｇ〜１０ｇになるように調整するの
が好ましい。

【００２４】

【実施例】以下に実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はそれらの例により限定されない。

【００２５】《参考例 １》［アミラーゼ阻害物質の調
製］ （１） 小麦粉８００ｋｇに水４００リットルを加え、
混練して生地を形成させた。この生地を６０００リット
ルの水を用いて洗浄して、グルテン４００ｋｇおよび小
麦澱粉５００ｋｇを回収した。その際に、５７８０リッ
トルの廃液が発生したので、この廃液（水抽出液）に塩
酸を加えてｐＨ３に調整し、３０分間放置した後、アン
モニアでｐＨを６．５に調整すると不溶物が沈殿した。
沈殿を除去して上澄み液４８５０リットルを回収した。

【００２６】（２） 上記で回収した上澄み液１０００
リットルにアルギン酸ナトリウム３００ｐｐｍを添加し
た後、ｐＨを４．０に調整して生成したゲル４０リット
ルを回収した。回収したゲルに、カルシウム濃度が４０
０ｐｐｍとなるように塩化カルシウム（２水和物）を加
え充分に撹拌した後１時間放置した。次いでゲルをドラ
バル型遠心分離機にかけ約１０リットルの沈殿物を回収
した。沈殿物に更に３０リットルの水を加えて沈殿物を
充分洗浄し、再びドラバル型遠心分離機にかけて６．５
ｋｇの沈殿物を得た。得られた沈殿物に２５リットルの
水を加え、カルシウム濃度が３０００ｐｐｍとなるよう
に塩化カルシウム（２水和物）を添加して充分撹拌し、
ドラバル型遠心分離機を使用して上澄み液を２５リット
ル回収した。一方、遠心分離によって分離された沈殿物
５リットルは、１２リットルの塩化カルシウム溶液（３
０００ｐｐｍ）で更に充分洗浄し、洗浄液をドラバル型
遠心分離機を使用して回収した。この液と先ほどの２５
リットルの上澄み液を合わせて３９リットルの溶出液を
得た。

【００２７】（３） 上記（２）で得た溶出液３９リッ
トルにリン酸水素二ナトリウム塩２９．１ｇを加え、ｐ
Ｈを７．２に調整した。この液を８０℃まで加熱し、熱
に不安定な物質をドラバル型遠心分離機を使用して除去
し、更に限外濾過膜［日東電工(株)製；ＮＴＵ−３２５
０ＣＩＲ］を用いて濃縮し、併せて余剰カルシウム塩の
脱塩を行って濃縮液を得た。 （４） 上記（３）で得た濃縮液１４リットルをアンモ
ニアでｐＨ７．５に調整し、フィルタープレスにて不純
物を除去した後、３ｋｇの陽イオン交換樹脂［三菱化成
（株）製；ダイヤイオンＨＰＫ−５５］で処理し、処理
液をクエン酸を用いてｐＨ４に調整した。ｐＨ調整した
液を８０℃で加熱処理し、凍結乾燥機にて乾燥を行い約
２５０ｇの乾燥粉末を得た。

【００２８】（５） 上記（４）で得た乾燥粉末のアミ
ラーゼ阻害活性を上記した方法で測定したところ約８０
００Ｕ／ｍｇであり、これをそのままアミラーゼ阻害物
質（内臓脂肪蓄積抑制剤）として用いた。なお、この乾
燥粉末を、上記の表２に示した高速液体クロマトグラフ
ィー条件したで分画処理してそこに含まれる蛋白質の種
類を調査したところ、図１に示すチャートになり、この
乾燥粉末中には、上記した０．２６ＡＩ_a、０．２６Ａ
Ｉ_b、０．１９ＡＩ、０．５３ＡＩ、０．２８ＡＩなど
が含まれていた。ちなみに、図１において、ピーク１０
の画分は０．１９ＡＩ、ピーク１２の画分は０．２６Ａ
Ｉ_b、ピーク１３の画分は０．２６ＡＩ_a、ピーク１４の
画分は０．５３ＡＩ、およびピーク１７の画分は０．２
８ＡＩであった。

【００２９】《実施例 １》 （１） ６週令のＷｉｓｔａｒ系雄ラット１６匹を８匹
ずつ２群に分けてその平均体重を測定した。 （２） 第１群（実験群）のラットに対しては、上記の
参考例１の（４）で得られた乾燥粉末（アミラーゼ阻害
物質；内臓脂肪蓄積抑制剤）を下記の表３に示す基本合
成飼料に飼料重量に基づいて２．４％の割合で添加して
給与して２週間にわたって自由に摂取させた。 （３） 一方、第２群（対照群）のラットに対しては、
上記の参考例１の（４）で得られた乾燥粉末（アミラー
ゼ阻害物質；内臓脂肪蓄積抑制剤）４００ｇを２，００
０ｍｌの湯（６０℃）に溶解し、ｐＨを９．２に調整し
た後、この液を９０℃以上で１０分間加熱処理してアミ
ラーゼ阻害活性を完全に失活させ、これを凍結乾燥した
後、粉砕して粉末化したものを下記の表３に示す基本合
成飼料に飼料重量に基づいて２．４％の割合で添加して
給与して２週間にわたって自由に摂取させた。

【００３０】

【表３】 基本合成飼料配合（重量部） α−コーンスターチ ５５ カゼイン ２０ ラード １３ コーン油 ２.０ セルロース ５.０ ミネラルミックス ３.５ ビタミンミックス １.０ ＤＬ−メチオニン ０.３ 重酒石酸コリン ０.２ 合 計 １００

【００３１】（４） ２週間後に、両群のラットを屠殺
し、肝臓、副睾丸脂肪組織および腸間膜脂肪組織を採取
して、その重量を測定して１匹当たりの平均値を求めた
ところ下記の表４に示すとおりであった。

【００３２】（５） さらに、上記で採取した副睾丸脂
肪組織より細胞質分画を調製し、その細胞質分画に含ま
れる脂肪酸合成系酵素（脂肪酸合成酵素、リンゴ酸脱水
素酵素およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素）の活
性を下記の方法で測定して、８匹のラットの平均値を採
ったところ、下記の表４に示すとおりであった。

【００３３】副睾丸脂肪組織の細胞質分画の脂肪酸合成
系酵素の活性の測定法：酵素液の調製および酵素活性の
測定は、ＭｕｔｏとＧｉｂｓｏｎの方法［Biochem．Bio
phys．Res．Commu．Vol．38，9−15（1970）］に従い、
脂肪組織における脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）、リンゴ酸
脱水素酵素（ＭＥ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵
素（Ｇ６ＰＤＨ）の酵素活性を測定した。

【００３４】（ｉ）酵素液の調製：０．５ｇのラットの
副睾丸脂肪組織に、１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）［０．２５Ｍのシュークロース、０．０７Ｍ
の炭酸水素カリウム、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸
二ナトリウム（ＥＤＴＡ−Ｎａ₂）、１ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）を含む］を加え、テフロンホモジナ
イザーを用いて氷冷下で組織をホモジナイズした。ホモ
ジナイズした液を４℃にて８，０００×ｇで２０分間遠
心分離してミトコンドリア画分を除いた。得られた上澄
部を更に超高速遠心分離機を用いて４℃にて１０５，０
００×ｇで６０分間遠心分離し、得られた上澄み画分を
酵素液として用いた。以下におけるＦＡＳ活性の測定は
酵素液を調製した日に行った。また、上記で得られた上
澄み画分（酵素液）の一部を−７０℃で凍結し、凍結後
２日以内に下記のＭＥ活性とＧ６ＰＤＨ活性の測定を行
った。

【００３５】（ii）ＦＡＳの測定：酵素反応液として１
２ｍＭ ＮＡＤＰＨ２０μｌ（最終濃度３００μＭ）、
７ｍＭアセチルＣｏＡ ２０μｌ（最終濃度１７６μ
Ｍ）、カクテル液（０．１１４Ｍ Ｌ−ヒスチジン塩酸
緩衝液；ｐＨ６．５、５．７ｍＭのＤＴＴ、４．５７ｍ
ＭのＥＤＴＡ−Ｎａ₂を含む）７００μｌ（最終濃度；
ヒスチジン１００ｍＭ、ＤＴＴ ５ｍＭ、ＥＤＴＡ ４ｍ
Ｍ）、および酵素液４０μｌをキュベット内に順次加え
てよく混和した。直ちに３７℃にセットした自記分光光
度計（島津製作所製「ＵＶ２６５−ＦＳ」）中で２分間
プレインキュベートした後、３．２ｍＭマロニルＣｏＡ
２０μｌ（最終濃度７８μＭ）を加えて反応させて、
反応中の３４０ｎｍの吸光度の減少速度を測定した。Ｎ
ＡＤＰＨのモル吸光係数を６２３０とし、反応により消
費されたＮＡＤＰＨの量からＦＡＳの活性値を求めた。

【００３６】（iii）ＭＥ活性の測定：酵素反応液とし
て、蒸留水８０μｌ、０．１Ｍ 塩化マグネシウム４０
μｌ（最終濃度４ｍＭ）、１２ｍＭ β−ＮＡＤＰ ２０
μｌ（最終濃度０．２４ｍＭ）、カクテル液（０．１２
５Ｍ トリス塩酸緩衝液；ｐＨ７．４、０．１２５ｍＭ
ＤＴＴ）８００μｌ（最終濃度；０．１Ｍトリスおよび
０．１ｍＭ ＤＴＴ）、並びにカクテル液で適宜（２〜
５倍）希釈した酵素液４０μｌをキュベット内に順次加
えてよく混和した。直ちに３７℃にセットした自記分光
光度計（島津製作所製「ＵＶ２６５−ＦＳ」）中で２分
間プレインキュベートした後、０．１５ＭＬ−リンゴ酸
ナトリウム２０μｌ（最終濃度３μＭ）を加えて反応さ
せて、３４０ｎｍの吸光度の増加速度を測定した。反応
により生成したＮＡＤＰＨの量からＭＥの活性値を求め
た。

【００３７】（iv）Ｇ６ＰＤＨ活性の測定：酵素反応液
として、蒸留水１００μｌ、１２ｍＭ β−ＮＡＤＰ ４
０μｌ（最終濃度０．４８ｍＭ）、カクテル液（０．１
２５Ｍ トリス塩酸緩衝液；ｐＨ８．０、１７．５ｍＭ
塩化マグネシウム）８００μｌ（最終濃度；０．１Ｍト
リスおよび１４ｍＭ ＭｇＣｌ₂）、並びに２０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜（２〜５倍）希釈し
た酵素液２０μｌをキュベット内に順次加えてよく混和
した。直ちに３７℃にセットした自記分光光度計（島津
製作所製「ＵＶ２６５−ＦＳ」）中で２分間プレインキ
ュベートした後、２０ｍＭグルコース−６−リン酸４０
μｌ（最終濃度０．８ｍＭ）を加えて反応させて、３４
０ｎｍの吸光度の増加速度を測定した。反応により生成
したＮＡＤＰＨの量からＧ６ＰＤＨの活性値を求めた。

【００３８】（ｖ）酵素活性の表し方：脂肪酸合成系酵
素の活性は、酵素液中の蛋白質１ｍｇ当たりの酵素が１
分間に消費または生成したＮＡＰＤＨの量（比活性）を
ｎｍｏｌで表した。

【００３９】

【表４】 第１群 第２群 （実験群） （対照群） ○体重（ｇ／匹） 実験開始時 117±1 116±1 実験終了時(１４日後) 169±1 169±2 ○飼料摂取量(ｇ／１４日・２匹) 154±2.4 157±3.4 ○肝臓重量(ｇ／匹) 6.68±0.11 6.59±0.19 ○副睾丸脂肪組織重量(ｇ／匹) 2.83±0.05²⁾ 3.06±0.07 ○腸間膜脂肪組織重量(ｇ／匹) 2.26±0.06²⁾ 2.47±0.07 ○脂肪酸合成系酵素活性(nmol/min・mg protein) 脂肪酸合成酵素 52.8±3.7¹⁾ 67.6±2.5 リンゴ酸脱水素酵素 392±35²⁾ 514±28 グルコース−６−リン酸脱水素酵素 101.3±7.5²⁾ 125.9±6.6 注: 表４の表示はすべて平均値±Ｓ．Ｅ（Standard Error） 1) 対照群に比較して危険率１％で有意差あり 2) 対照群に比較して危険率５％で有意差あり

【００４０】上記の表４の結果から、実験終了時体重、
飼料摂取量および肝臓重量については、第１群（実験
群）および第２群（対照群）との間に殆ど差がなく同じ
であったが、副睾丸脂肪組織重量および腸間膜脂肪組織
重量において、アミラーゼ阻害物質を含有する飼料を給
与した第１群（実験群）の方がアミラーゼ阻害活性のな
い飼料を給与した第２群（対照群）に比べて有意に低
く、小麦由来のアミラーゼ阻害物質が、内臓脂肪の蓄積
抑制に効果があることがわかる。また、上記の表４で
は、アミラーゼ阻害物質を含有する飼料を給与した第１
群（実験群）では、第２群（対照群）に比べて、脂肪組
織における脂肪合成系酵素の活性が低くなっており、か
かる結果から、小麦由来のアミラーゼ阻害物質からなる
本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤は、内臓における脂肪合成
系酵素の活性を低減させて、内臓における脂肪の蓄積を
抑制することが確認された。

【００４１】

【発明の効果】小麦由来のアミラーゼ阻害物質を有効成
分とする本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤は、内臓における
脂肪の蓄積を抑制することができ、それによって成人病
の原因ともいわれている内臓脂肪型肥満を防止すること
ができる。本発明の内臓脂肪蓄積抑制剤は、小麦に由来
するために安全であり、そのまま直接、または食品など
に添加して、経口投与などにより簡単に且つ違和感なく
摂取することができる。

【００４２】

【配列表】

【００４３】配列番号：１ 配列の長さ：１２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Gly Pro Trp Met Cys Tyr Pro Gly Tyr Ala Phe Lys Val Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Gly Cys Arg Pro Val Leu Lys Leu Gln Cys Asn Gly Ser Gln 20 25 30 Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asp Ile 35 40 45 Ser Glu Trp Cys Arg Cys Gly Ala Leu Tyr Ser Met Leu Asp Ser Met 50 55 60 Tyr Lys Glu His Gly Val Gln Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe 65 70 75 80 Pro Ser Cys Arg Arg Glu Val Val Lys Leu Thr Ala Ala Ser Ile Thr 85 90 95 Ala Val Cys Lys Leu Pro Ile Val Ile Asp Ala Ser Gly Asp Gly Ala 100 105 110 Tyr Val Cys Lys Gly Val Ala Ala Tyr Pro Asp Ala 115 120

【００４４】配列番号：２ 配列の長さ：１２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Gly Pro Trp Met Cys Tyr Pro Gly Tyr Ala Phe Lys Val Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Gly Cys Arg Pro Val Leu Lys Leu Gln Cys Asn Gly Ser Gln 20 25 30 Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asp Ile 35 40 45 Ser Glu Trp Cys Arg Cys Gly Ala Leu Tyr Ser Met Leu Asp Ser Met 50 55 60 Tyr Lys Glu His Gly Val Gln Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe 65 70 75 80 Pro Ser Cys Arg Arg Glu Val Val Lys Leu Thr Ala Ala Ser Ile Thr 85 90 95 Ala Val Cys Lys Leu Pro Ile Val Ile Asp Ala Ser Gly Asp Gly Ala 100 105 110 Tyr Val Cys Lys Gly Val Ala Ala Tyr Pro 115 120

【００４５】配列番号：３ 配列の長さ：１２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Gly Pro Trp Met Cys Tyr Pro Gly Gln Ala Phe Gln Val Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Ala Cys Arg Pro Leu Leu Arg Leu Gln Cys Asn Gly Ser Gln 20 25 30 Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala His Ile 35 40 45 Ser Glu Trp Cys Arg Cys Gly Ala Leu Tyr Ser Met Leu Asp Ser Met 50 55 60 Tyr Lys Glu His Gly Ala Gln Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe 65 70 75 80 Pro Arg Cys Arg Arg Glu Val Val Lys Leu Thr Ala Ala Ser Ile Thr 85 90 95 Ala Val Cys Arg Leu Pro Ile Val Val Asp Ala Ser Gly Asp Gly Ala 100 105 110 Tyr Val Cys Lys Asp Val Ala Ala Tyr Pro Asp Ala 115 120

【００４６】配列番号：４ 配列の長さ：１２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Gly Pro Trp Met Cys Tyr Pro Gly Gln Ala Phe Gln Val Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Gly Cys Arg Pro Leu Leu Lys Leu Gln Cys Asn Gly Ser Gln 20 25 30 Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asp Ile 35 40 45 Ser Glu Trp Pro Arg Cys Gly Ala Leu Tyr Ser Met Leu Asp Ser Met 50 55 60 Tyr Lys Glu His Gly Val Ser Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe 65 70 75 80 Pro Ser Cys Arg Arg Glu Val Val Lys Leu Thr Ala Ala Ser Ile Thr 85 90 95 Ala Val Cys Arg Leu Pro Ile Val Val Asp Ala Ser Gly Asp Gly Ala 100 105 110 Tyr Val Cys Lys Asp Val Ala Ala Tyr Pro Asp Ala 115 120

【００４７】配列番号：５ 配列の長さ：１２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Gly Pro Trp Ser Trp Cys Asn Pro Ala Thr Gly Tyr Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Leu Thr Gly Cys Arg Ala Met Val Lys Leu Gln Cys Val Gly Ser 20 25 30 Gln Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asp 35 40 45 Ile Asn Asn Glu Trp Cys Arg Cys Gly Asp Leu Ser Ser Met Leu Arg 50 55 60 Ala Val Tyr Gln Glu Leu Gly Val Arg Glu Gly Lys Glu Val Leu Pro 65 70 75 80 Gly Cys Arg Lys Glu Val Met Lys Leu Thr Ala Ala Ser Val Pro Glu 85 90 95 Val Cys Lys Val Pro Ile Pro Asn Pro Ser Gly Asp Arg Ala Gly Val 100 105 110 Cys Tyr Gly Asp Trp Cys Ala Tyr Pro Asp Val 115 120

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の参考例１において、複数のアミラーゼ
阻害物質を含有する粗精製物を高速液体クロマトグラフ
ィーにかけて得られた画分のピークを示す図である。

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【手続補正書】

【提出日】平成８年９月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２０】

【表２】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】 （５） 上記（４）で得た乾燥粉末のア
ミラーゼ阻害活性を上記した方法で測定したところ約８
０００Ｕ／ｍｇであり、これをそのままアミラーゼ阻害
物質（内臓脂肪蓄積抑制剤）として用いた。なお、この
乾燥粉末を、上記の表２に示した高速液体クロマトグラ
フィー条件下で分画処理してそこに含まれる蛋白質の種
類を調査したところ、図１に示すチャートになり、この
乾燥粉末中には、上記した０．２６ＡＩ_ａ、０．２６Ａ
Ｉ_ｂ、０．１９ＡＩ、０．５３ＡＩ、０．２８ＡＩなど
が含まれていた。ちなみに、図１において、ピーク１０
の画分は０．１９ＡＩ、ピーク１２の画分は０．２６Ａ
Ｉ_ｂ、ピーク１３の画分は０．２６ＡＩ_ａ、ピーク１４
の画分は０．５３ＡＩ、およびピーク１７の画分は０．
２８ＡＩであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 村山 隆二 兵庫県宍粟郡山崎町三谷40番地１ (72)発明者 高瀬 幸子 静岡県静岡市曲金３丁目３番３号 東カン マンション903号 (72)発明者 合田 敏尚 静岡県清水市川原町21番11号 県立大学住 宅104号

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 小麦由来のアミラーゼ阻害物質を有効成
   分として含むことを特徴とする内臓脂肪蓄積抑制剤。
2. 【請求項２】 小麦由来のアミラーゼ阻害物質が、配列
   番号１で表されるサブユニット２個からなる蛋白質、配
   列番号２で表されるサブユニット２個からなる蛋白質お
   よび配列番号３で表されるサブユニット２個からなる蛋
   白質のうちの少なくとも１種を含有するものである請求
   項１の内臓脂肪蓄積抑制剤。
3. 【請求項３】 １ｍｇ当たり、小麦由来のアミラーゼ阻
   害物質を、アミラーゼ阻害活性値で２，０００〜３０，
   ０００ユニットの割合で含有する請求項１または２の内
   臓脂肪蓄積抑制剤。