JPH09194392A - アミラーゼ阻害物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 人膵臓α−アミラーゼに対して高い阻害活性
を有し、人間の血糖値上昇抑制、インシュリン分泌の調
節、満腹感の持続による節食などを可能し、高血糖症、
糖尿病、高脂血症、動脈硬化、肥満等の予防及び治療に
有効なアミラーゼ阻害物質を提供すること。 【解決手段】 ポリアクリアミドゲル電気泳動で移動度
０．２６の位置に単一のバンドを与える１２２個のアミ
ノ酸の結合体であるサブユニット２個からなる蛋白質で
ある本発明の新規なアミラーゼ阻害物質、およびそれを
有効成分として含むアミラーゼ阻害剤、血糖値上昇抑制
剤、インシュリン分泌調節剤、食欲抑制剤等により上記
の目的が達成できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、小麦に由来する新
規なアミラーゼ阻害物質、および該アミラーゼ阻害物質
を含有するアミラーゼ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、イン
シュリン分泌調節剤、食欲抑制剤および食品に関する。
本発明の新規なアミラーゼ阻害物質は、特に人膵臓α−
アミラーゼに対して高い阻害活性を有していて、人間の
血糖値上昇抑制およびインシュリン分泌の調節を効果的
に行うことができる。更に、本発明の新規なアミラーゼ
阻害物質は食後の満腹感を持続させることができ、その
ため食欲抑制が容易に行えるようになり、成人病の原因
となり易い過食や肥満を効果的に防止することができ
る。

【０００２】

【従来の技術】近年わが国では食生活が豊かになり、糖
尿病をはじめとする代謝性疾患が急増している。過剰の
栄養摂取はインシュリンの大量分泌を誘導することによ
って間接的に代謝バランス崩壊の原因となり、耐糖機能
の低下（高血糖）、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等につ
ながる。特に、糖尿病患者ではインシュリン作用が不足
し耐糖能が低下しているので、食後の血糖値の上昇が著
しく、毛細血管の損傷や動脈硬化などの合併症の原因と
なっている。そして、このような疾患の予防および治療
には、血糖値が上昇しにくい食品や物質の摂取が有効で
あるとされており、そのため摂取した澱粉が糖に分解す
るのを抑制または阻害し得る物質が求められている。ま
た、飲食物が豊富にある我が国の現状では過食し易く、
これが肥満、高血圧、糖尿病、心臓疾患などの成人病の
原因となっている。

【０００３】上記の点から、澱粉を糖に分解するアミラ
ーゼの活性を阻害する作用を有するいわゆるアミラーゼ
阻害物質に関する研究が色々行われるようになってお
り、小麦中にもアミラーゼ阻害物質が含まれていること
が報告されて以来、小麦由来のアミラーゼ阻害物質に関
する研究や開発が種々なされるようになっている［例え
ば特開昭４６−１８３３号公報、特開昭６１−１７１４
３１号公報、Phytochemistry. Vol.20，No.8， pp1781-
1784（1981）、Eur．J．Biochem．183,37-40(1989)］。

【０００４】しかしながら、上記した従来の小麦由来の
アミラーゼ阻害物質は人以外の動物のアミラーゼに対し
てはある程度の阻害活性はあるものの、人膵臓α−アミ
ラーゼに対する阻害活性が極めて低いかまたは殆どな
く、人に経口で投与した場合に期待どおりの効果が見ら
れず、特に米飯のような加熱調理した澱粉に対しては、
その分解を阻害する作用が低いことが報告されている。
そのため、人膵臓α−アミラーゼに対する阻害活性が強
く、人に経口で投与した場合に少量で人の血糖値上昇や
インシュリン分泌を効果的に抑制することができ、特に
加熱調理した澱粉の糖への分解を効果的に抑制できる活
性の高いアミラーゼ阻害物質が求められている。

【０００５】また、血糖値の上昇やインシュリン分泌を
抑制する剤を用いた場合には、血液中の遊離脂肪酸量が
増加することが報告されている［PulsおよびKeup“Ｄia
betologia” 9，97-101(1973)］。しかしながら一方
で、血液中の遊離脂肪酸量の増加は一般に空腹感をもた
らすため過食につながり易いといわれており、このこと
が血糖値上昇抑制およびインシュリン分泌抑制を相殺す
る結果をもたらし、糖尿病などの有効な治療や予防を困
難にしていたと思われる。

【０００６】

【発明の内容】上記のような状況下に、本発明者らは小
麦中のアミラーゼ阻害物質について色々研究を行ってき
た。そして、高いアミラーゼ阻害活性を有するアミラー
ゼ阻害物質を小麦粉等の抽出液から工業的に効率よく製
造し得る方法を確立して先に出願した（特開平５−３０
１８９８号公報、特開平７−４８２６８号公報および特
開平７−４８４００号公報）。さらに本発明者らは、前
記の方法とは異なる特定の調製方法によって、極めて高
い活性を有する、配列番号２で表されるサブユニット２
個からなる新規な蛋白質を見出して先に出願した（特開
平７−４１４９９号公報）。

【０００７】そして、上記した本発明者らによる発明を
ベースとして、更に研究を続けてきたが、本発明者らに
よる上記した特開平５−３０１８９８号公報、特開平７
−４８２６８号公報および特開平７−４８４００号公報
などに記載されている、工業的な製法により得られるア
ミラーゼ阻害物質中に、これまで知られていなかった新
規なアミラーゼ阻害物質、すなわち配列番号１で表され
るサブユニット２個からなる蛋白質であるアミラーゼ阻
害物質が含まれていること、しかもその新規なアミラー
ゼ阻害物質は人膵臓α−アミラーゼの活性を阻害し、人
の血糖値の上昇およびインシュリン分泌を抑制でき、し
かも血液中の遊離脂肪酸量の増加を抑制して食後の満腹
感を持続させることができること、そのため血糖値上昇
抑制およびインシュリン分泌の抑制と同時に食欲抑制が
容易になり、糖尿病の治療や予防、肥満防止などに極め
て有効であることを見出し、それらの知見に基づいて本
発明を完成した。

【０００８】したがって、本発明は、配列番号１で表さ
れるサブユニット２個からなる蛋白質（以下これを「蛋
白質（Ａ）」という）であることを特徴とするアミラー
ゼ阻害物質である。

【０００９】さらに、本発明は、蛋白質（Ａ）を有効成
分とする、アミラーゼ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、イン
シュリン分泌調節剤または食欲抑制剤である。そして、
本発明のアミラーゼ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、インシ
ュリン分泌調節剤および食欲抑制剤は、蛋白質（Ａ）の
含有量が２０重量％以上であるか、または蛋白質（Ａ）
と配列番号２で表されるサブユニット２個からなる蛋白
質（以下これを「蛋白質０．２６ＡＩ」という）および
配列番号３で表されるサブユニット２個からなる蛋白質
（以下これを「蛋白質０．１９ＡＩ」という）の少なく
とも１種との合計含有量が２０重量％以上である剤をそ
の好ましい態様として包含する。

【００１０】そして、本発明は、蛋白質（Ａ）を添加し
たことを特徴とする食品である。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下に本発明について詳細に説明
する。本発明の新規な蛋白質（Ａ）は、Sephadex Ｇ−
７５を用いたゲル濾過クロマトグラフィーでほぼ２５，
０００の分子量を有している。また、下記の実施例の項
で詳述するように、この蛋白質（Ａ）を、Davisらの方
法［Annals New York Academy of Science，121, 404−
427（1964）］に準じて、上記した特開平７−４１４９
９号の発明におけるのと同じように、１０％濃度のゲル
を使用したポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下「Na
tive−ＰＡＧＥ」という）にかけたところ、移動度０．
２６の位置に単一のバンドが認められた。また、下記の
実施例の項で詳述するＳＤＳポリアクリルアミド電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）においては、分子量１２５００
に単一なバンドが認められた。このことから蛋白質
（Ａ）は、分子量１２，５００の２つのサブユニットか
ら構成される蛋白質であることが判明した。そして、蛋
白質（Ａ）のかかる電気泳動度および分子量は、本発明
者らが先に発明した蛋白質０．２６ＡＩ（配列番号２で
表される蛋白質）の特性とほぼ一致しているが、本発明
の蛋白質（Ａ）と蛋白質０．２６ＡＩとは、両者を含む
混合物を高速液体クロマトグラフィーにかけたときに、
そのリテンションタイムが異なっていて別々のピーク画
分として現れ、各々の画分を別々に回収することにより
個別に得られた。

【００１２】そして、本発明の蛋白質（Ａ）のサブユニ
ットのアミノ酸配列をペプチドシークエンサーＰＳＱ−
１（島津社製）を用いて調べたところ、配列番号１で表
される１２２個のアミノ酸が結合した構造（すなわち配
列番号２で示される蛋白質０．２６ＡＩのＣ末端の２残
基の欠落したアミノ酸配列）を有することが明らかにな
った。したがって、本発明の蛋白質（Ａ）は、配列番号
１で表されるサブユニット２個からなる２４４個のアミ
ノ酸から構成される蛋白質である。また、この蛋白質
（Ａ）はＳ−Ｓ結合を有し球状になっている。

【００１３】本発明の蛋白質（Ａ）は、アミラーゼ、特
に人膵臓α−アミラーゼに対して高い阻害活性を有して
おり、従来公知の小麦由来のアミラーゼ阻害物質である
配列番号４で表されるサブユニット２個からなる蛋白質
「以下「蛋白質０．５３ＡＩ」という）[Biochem．Biop
hys. Acta. 743, 52−57（1983)］や配列番号５で表さ
れる蛋白質（以下「蛋白質０．２８ＡＩ」という）［上
記したPhytochemistry. Vol.20，No.8， 1781−1784（1
981）］と比較した場合に、その数倍〜数十倍もの高い
α−アミラーゼ阻害活性を有しており、また蛋白質０．
１９ＡＩよりも多少高く、蛋白質０．２６ＡＩに次ぐ高
いアミラーゼ阻害活性を有している。

【００１４】本発明の蛋白質（Ａ）には、配列番号１で
表されるサブユニット２個から構成され且つアミラーゼ
阻害活性を有する蛋白質のいずれもが包含され、特にそ
の製法は限定されず、例えば化学合成によるものなどで
あってもよい。しかしながら、本発明の蛋白質（Ａ）
は、本発明者らの開発した上記した特開平５−３０１８
９８号公報、特開平７−４８２６８号公報、特開平７−
４８４００号公報などに記載されている方法によって得
られる、複数のアミラーゼ阻害物質からなる混合物を高
速液体クロマトグラフィーなどによってそれぞれのアミ
ラーゼ阻害物質（蛋白質）に分画することによって、工
業的に効率よく得ることができる。

【００１５】すなわち、例えば、下記の〜のいずれ
かの方法で、複数のアミラーゼ阻害物質からなる混合物
を調製し、その混合物を高速液体クロマトグラフィーに
かけて、例えば０．１％トリフルオロ酢酸水溶液をＡ液
とし、８０％アセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢
酸の水溶液をＢとして、時間／濃度勾配を有する高圧リ
ニアグラジエンド溶出を行って、それぞれのアミラーゼ
阻害物質（蛋白質）をそのリテンションタイムの違いに
よって分画し、蛋白質（Ａ）に相当する画分を回収する
ことによって、蛋白質（Ａ）を得ることができる。

【００１６】蛋白質（Ａ）を含む上記混合物の調製法
例： （ａ₁）小麦、小麦粉または小麦グルテンを水、希
酸、希アルカリまたは含水アルコールで抽出してアミラ
ーゼ阻害物質を含有する液を得る工程；（ｂ₁）前記工
程で得たアミラーゼ阻害物質を含有する液に、アミラー
ゼ阻害物質と不溶性の複合体を形成する多糖類を加え
て、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性の複合体を
生成させ、その複合体を液から分別する工程；（ｃ₁）
前記工程で分別した複合体から多糖類を分離除去してア
ミラーゼ阻害物質を含有する液を分取する工程；および
（ｄ₁）前記工程で分取したアミラーゼ阻害物質を含有
する液を陽イオン交換体で処理して陽イオン交換体非吸
着画分からアミラーゼ阻害物質を回収する工程を包含す
る方法（特開平５−３０１８９８号公報に記載の方
法）。

【００１７】 （ａ₂）小麦、小麦粉または小麦グル
テンを水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールで抽
出して得られたアミラーゼ阻害物質を含有する液、或い
は小麦粉から澱粉および／またはグルテンを採取する際
に排出されるアミラーゼ阻害物質を含有する水洗廃液
に、アミラーゼ阻害物質と不溶性の複合体を形成する多
糖類を加えて、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性
の複合体を生成させ、その複合体を液から分別する工
程；（ｂ₂）前記工程で分別した複合体から多糖類を分
離除去してアミラーゼ阻害物質を含有する液を分取する
工程；（ｃ₂）前記工程で得たアミラーゼ阻害物質を含
有する液中の蛋白質の４０〜７０％の蛋白質を沈殿さ
せ、沈殿した蛋白質を分取した後それを水に溶解させて
アミラーゼ阻害物質を含有する液を得る工程；（ｄ₂）
前記工程で得た液にカルシウムイオンとリン酸イオンを
加えてアミラーゼ阻害物質を含む不溶性複合体を生成さ
せ、その不溶性複合体を分別する工程；および（ｅ₂）
前記工程で分別した不溶性複合体からアミラーゼ阻害物
質を水に可溶化させてアミラーゼ阻害物質を含有する液
を得る工程を包含し、且つ上記工程（ｃ₂）の終了まで
の任意の段階で不純蛋白質およびその他の不純物を除去
する処理工程を有する方法（特開平７−４８２６８号公
報に記載の方法）。

【００１８】 （ａ₃）小麦、小麦粉または小麦グル
テンを水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールで抽
出して得られたアミラーゼ阻害物質を含有する液、或い
は小麦粉から澱粉および／またはグルテンを採取する際
に排出されるアミラーゼ阻害物質を含有する水洗廃液を
処理して液中に含まれる可溶性の不純蛋白質およびその
他の不純物を不溶性固形分の形態に変えて分離除去する
工程；（ｂ₃）上記工程（ａ₃）で得た不純物除去後の液
中で不溶性のリン酸カルシウムゲルを形成させると共に
液中に含まれているアミラーゼ阻害物質をリン酸カルシ
ウムゲルに吸着させた後、アミラーゼ阻害物質を吸着含
有するリン酸カルシウムゲルを液から分離回収する工
程；（ｃ₃）上記工程（ｂ₃）で回収したアミラーゼ阻害
物質を吸着含有する不溶性リン酸カルシウムゲルからア
ミラーゼ阻害物質を水に可溶化させてアミラーゼ阻害物
質を含有する液を得る工程；および（ｄ₃）上記工程
（ｃ₃）で得た液からアミラーゼ阻害物質を回収する工
程を包含する方法（特開平７−４８４００号公報に記載
の方法）。

【００１９】本発明において、上記〜のいずれかの
方法にしたがって蛋白質（Ａ）を含む混合物を得るに当
たっては、その具体的な反応条件などは上記〜の方
法がそれぞれ記載されている特開平５−３０１８９８号
公報、特開平７−４８２６８号公報または特開平７−４
８４００号公報の記載に基づいて行うことができる。し
かしながら、勿論、それに限定されるものではない。

【００２０】また、本発明において、蛋白質（Ａ）と併
用することのできる上記した蛋白質０．２６ＡＩおよび
蛋白質０．１９ＡＩの調製法なども特に制限されず、い
ずれの方法で調製したものであってもよく、例えば、本
出願人の出願に係る特開平５−３０１８９８号公報、特
開平７−４８２６８号、特開平７−４１４９９号公報な
どに記載された方法やその他の方法により得ることがで
きる。

【００２１】そして、本発明の蛋白質（Ａ）は、アミラ
ーゼ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、インシュリン分泌調節
剤、または食欲抑制剤として有効に用いることができ
る。そして、蛋白質（Ａ）を前記したアミラーゼ阻害
剤、血糖値上昇抑制剤、インシュリン分泌調節剤または
食欲抑制剤として用いる場合は、前記の剤中における蛋
白質（Ａ）の含有量が２０重量％以上であるか、または
蛋白質（Ａ）と、蛋白質０．２６ＡＩおよび蛋白質０．
１９ＡＩの少なくとも１種との合計含有量が２０重量％
以上であるものを用いるのが、その効果を充分に発揮さ
せ得ることができるので好ましい。蛋白質（Ａ）と共
に、蛋白質０．２６ＡＩおよび／または蛋白質０．１９
ＡＩを含有する場合は、各蛋白質の含有割合は特に制限
されず任意の比率であってよい。その場合に、蛋白質
（Ａ）、蛋白質０．２６ＡＩ、および蛋白質０．１９Ａ
Ｉは、いずれも高純度精製物であっても粗精製物であっ
てもよい。

【００２２】また、蛋白質（Ａ）を含むアミラーゼ阻害
剤、血糖値上昇抑制剤、インシュリン分泌調節剤または
食欲抑制剤は、蛋白質（Ａ）、蛋白質０．２６ＡＩ、蛋
白質０．１９ＡＩの他に、場合により小麦に由来する他
の成分、例えば蛋白質類、ペプチド類、その他の物質
（澱粉、食物繊維、ビタミン、無機質など）を含有して
いてもよい。

【００２３】蛋白質（Ａ）またはそれを含有する物質を
アミラーゼ阻害物質、血糖値上昇抑制剤、インシュリン
分泌調節剤、食欲抑制剤などに用いる場合は、そのまま
で、または公知の担体や助剤等を使用して液剤、顆粒
剤、錠剤等の形態にして使用することができる。更に、
蛋白質（Ａ）、或いは蛋白質（Ａ）と蛋白質０．２６Ａ
Ｉおよび／または蛋白質０．１９ＡＩは、食品、特に澱
粉質を多く含むパン、クッキー等の炭水化物系食品に添
加して使用したり、お茶類、スープ類、ふりかけ、バタ
ー、ジャム等のスプレッド類に添加して使用することが
できる。

【００２４】蛋白質（Ａ）、或いは蛋白質（Ａ）と蛋白
質０．２６ＡＩおよび／または蛋白質０．１９ＡＩとの
混合物の人への投与量や食品への添加量は、糖尿病患者
に投与するかまたは健常者に投与するかによって、或い
はそれらの被投与者の状態や症状等によって、更にはそ
れが添加される食品の種類やその摂取量などに応じて適
宜調節することができるが、本発明の剤の場合は、少量
の投与で高い、アミラーゼ阻害作用、血糖値上昇抑制効
果、インシュリン分泌調節効果および満腹感の持続効果
を図ることができる。特に、食品に添加する場合は、蛋
白質（Ａ）の添加量、或いは蛋白質（Ａ）と蛋白質０．
２６ＡＩおよび／または蛋白質０．１９ＡＩの合計添加
量が、喫食可能状態の食品１食当たり３０〜３０００ｍ
ｇになるようにして調整するのが好ましい。

【００２５】例えば、蛋白質（Ａ）の含有量、或いは蛋
白質（Ａ）と蛋白質０．２６ＡＩおよび／または蛋白質
０．１９ＡＩの合計含有量が３０重量％である本発明の
血糖値上昇抑制剤を健常者に投与した場合には、１回に
１００ｍｇの投与でも血糖値上昇抑制効果が認められ、
１回当たり２５０〜２，５００ｍｇを１日３回の摂食時
に投与すると食後の血糖値の上昇を極めて良好に抑制す
ることができる。また糖尿病患者ではそれよりも多い投
与量（一般に１回当たり約５００〜５，０００ｍｇ）で
食後の血糖値の上昇を効果的に抑制することができる。
更に、蛋白質（Ａ）の含有量、或いは蛋白質（Ａ）と蛋
白質０．２６ＡＩおよび／または蛋白質０．１９ＡＩの
合計含有量が３０重量％である食欲抑制剤を１回当たり
５００ｍｇ〜１０ｇの割合で食事と共に人に投与する
と、血液中の遊離脂肪酸量が増加せず、空腹感が抑えら
れて苦痛を感じることなく食欲を抑制することができ
る。

【００２６】したがって、本発明の上記した各種の剤
は、蛋白質（Ａ）の含有量が２０重量％以上であるか、
或いは蛋白質（Ａ）と蛋白質０．２６ＡＩおよび／また
は蛋白質０．１９ＡＩの合計含有量が２０重量％以上で
あるものを、１回の投与分当たり剤中に１００ｍｇ〜１
０ｇ、好ましくは２５０〜５，０００ｍｇの量で含有す
るように製剤しておくのが望ましく、例えば１個のカプ
セル、錠剤、丸薬またはペレット当たり、１分包の散
剤、顆粒剤当たり、或いは１本の液剤中に１００ｍｇ〜
１０ｇ含有させておいて、それらを１回につき１つ投与
するようにすると過不足なく確実に且つ簡単に摂取する
ことができる。

【００２７】

【実施例】以下に実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はそれらの例により限定されない。以下の
例において、得られた蛋白質（Ａ）のNative−ＰＡＧＥ
およびＳＤＳ−ＰＡＧＥは下記の方法にしたがって行っ
た。さらに、Sephadex Ｇ−７５を用いたゲル濾過クロ
マトグラフィーでの分子量の測定、蛋白質（Ａ）のアミ
ノ酸配列の決定、アミラーゼ阻害物質（蛋白質（Ａ）、
蛋白質０．２６ＡＩ、蛋白質０．１９Ａ、蛋白質０．５
３ＡＩ、蛋白質０．２８ＡＩ）の人膵臓α−アミラーゼ
に対する阻害活性の測定は以下のようにして行った。

【００２８】Native−ＰＡＧＥの方法：本発明者らによ
る特開平７−４１４９９号の発明と同じように、原理的
にはDavisらの方法［Annals New York Academy of Scie
nce，121,404−427（1964）］に準じて、１０％濃度の
ゲルを使用したポリアクリルアミドゲル電気泳動により
行った。 （ｉ）試薬：下記の表１に示す試薬を調製して用いた。

【００２９】

【表１】 Native−ＰＡＧＥで用いた試薬 Ａ液 ：１．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９） Ｂ液 ：０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．７） Ｃ液 ：アクリアミド２９．２ｇおよびメチレンビスアクリルアミド０．８ｇ に蒸留水を加えて１００ｍｌにしたもの Ｄ液 ：アクリアミド１０ｇおよびメチレンビスアクリルアミド２．５ｇに蒸 留水を加えて１００ｍｌにしたもの Ｅ液 ：リボフラビン４ｍｇ／１００ｍｌ Ｆ液 ：１０％過硫酸アンモニウム 上部電極液：０．０２５Ｍトリス水溶液、０．１９２Ｍグリシン水溶液および １×１０^-6％ブロムフェノールブルーの混合液 下部電極液：０．０２５Ｍトリス水溶液および０．１９２Ｍグリシン水溶液の 混合液

【００３０】（ii）分離ゲルの調製：Native−ＰＡＧＥ
はスラブ型電気泳動装置を用いて電気泳動を行った。ゲ
ル厚が１ｍｍになる１対のゲルモールドにシリコンを塗
布し、シリコンチューブで液が漏れないようにシールし
た。Ａ液４．５ｍｌ、Ｃ液６ｍｌ、蒸留水７．５ｍｌ、
Ｆ液７０μｌおよびＴＥＭＥＤ（和光純薬株式会社製）
１０μｌを加えて充分に混和した。シールしたゲルモー
ルドを垂直に立て、上記で調製した混和液をゲルモール
ドに約８割の高さまで流し込んだ。ゲル化を促進するた
めに少量のｎ−ブタノールを液面上に添加し、液面と空
気が接触しないようにしてしばらく放置し、ゲル化させ
た。 （iii）濃縮ゲルの調製：Ｂ液１ｍｌ、Ｄ液２ｍｌ、蒸
留水４ｍｌ、Ｅ液１ｍｌ、Ｆ液２０μｌおよびＴＥＭＥ
Ｄ１０μｌを加えて充分に混和して混和液を得た。上記
で調製した分離ゲルのｎ−ブタノール層を捨て、上記の
混和液でゲル面を洗浄した後、モールドを満たすように
更に上記の混和液を流し込んだ。モールド上部にサンプ
ルコウムを挿入し、液がゲル化するまで放置した。 （iv）電気泳動：上記で調製されたゲルを、シール部分
のシリコンチューブとサンプルコウムを外し、電気泳動
装置にセットした。上部電極槽に上部電極液を、下部電
極槽に下部電極液を入れ、各レーンにシュークロースを
加えて比重を重くした試料液を添加し、２５ｍＡでブロ
ムフェノールブルーがゲルの先端に達するまで電気泳動
を行った。 （ｖ）ゲルの染色および脱色：電気泳動の終了後、ゲル
をモールドから外し、一晩染色液（０．０２５％クーマ
シーブルーＲ２５０、５０％メタノール、７％酢酸）に
浸して蛋白質の染色を行った。染色終了後、ゲルを脱色
液（７％酢酸）に浸し、震盪しながら一晩放置して脱色
を行った。

【００３１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＰ
ｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア社製）を用いて
行った。 （ｉ）試料の調製：１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）（１ｍＭのＥＤＴＡ、２．５％のＳＤＳ、５％
の２−メルカプトエタノールおよび微量のブロムフェノ
ールブルーを含む）中にて１００℃で５分間処理を行っ
た。 （ii）電気泳動、染色および脱色：Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓ
ｔｅｍを使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび染色、脱色の
一連の操作を行った。ゲルはＰｈａｓｔ Ｇｅｌ Ｈｏｍ
ｏｇｅｎｅｏｕｓ ２０を使用した。

【００３２】Sephadex Ｇ−７５を用いたゲル濾過クロ
マトグラフィーでの分子量の測定：得られた蛋白質
（Ａ）に、４ｍｌの緩衝液（２０ｍＭトリス、２００ｍ
Ｍ NaCl、ｐＨ８．０）を加えて試料溶液を調製し、予
め緩衝液で平衡化しておいたSephadex Ｇ−７５のゲル
濾過カラム（１．６ｃｍ×９０ｃｍ）にかけ、０．５ｍ
ｌ／ｍｉｎの流速でゲル濾過クロマトグラフィーを行い
分子量を測定した。

【００３３】蛋白質（Ａ）のアミノ酸配列の決定：得ら
れた蛋白質（Ａ）をピリジルエチル化した後、Ｖ８プロ
テアーゼ、リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬製）を
用いて加水分解した。加水分解した試料をＨＰＬＣにか
け、加水分解されたペプチドフラグメントを得た。得ら
れたペプチドプラグメントをペプチドシークエンサーＰ
ＳＱ−１（島津社製）を用いてペプチドのＮ末端より分
析し全一次構造の決定を行った。Ｃ末端はカルボキシペ
プチダーゼで分解し、その遊離してきたアミノ酸を分析
して決定した。

【００３４】人膵臓α−アミラーゼに対する阻害活性の
測定：試料水溶液と人膵臓α−アミラーゼを、５０ｍＭ
NaCl、５ｍＭ CaCl₂および０．０２％卵白アルブミンを
含む２０ｍＭ ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタ
ンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ６．９）中に加えて３７℃
で３０分間放置した後、１．５％可溶性澱粉溶液（ｐＨ
６．９）を０．５ｍｌ混合した。この液を３７℃に１０
分間保って反応を行わせた後、２．５ｍｌの反応停止液
（０．０８ＭＨＣｌおよび０．４Ｍ酢酸）を加えた。反
応液より０．２ｍｌ採取し、これに２．５ｍｌのヨウ素
液（０．０５％ ＫＩおよび０．００５％ヨウ素）を加
えて、６６０ｎｍでの吸光度を測定した。なお、測定に
当たっては、試料液を含まないときに吸光度を８０％減
少させるアミラーゼ量を用い、このときのアミラーゼ活
性を５０％阻害するアミラーゼ阻害物質量を１ユニット
（Ｕ）として表した。

【００３５】《実施例 １》 （１） 小麦粉８００ｋｇに水４００リットルを加え、
混練して生地を形成させた。この生地を６０００リット
ルの水を用いて洗浄して、グルテン４００ｋｇおよび小
麦澱粉５００ｋｇを回収した。その際に、５７８０リッ
トルの洗浄廃液が生じたので、この洗浄廃液（水抽出
液）に塩酸を加えてｐＨ３に調整し、３０分放置した
後、アンモニアでｐＨを６．５に調整すると不溶物が沈
殿した。沈殿を除去して上澄み液５２００リットルを回
収した。 （２） 上記（１）で回収した上澄み液１０００リット
ルにアルギン酸ナトリウム３００ｐｐｍを加えた後、ｐ
Ｈを４．０に調整して生成したゲル４０リットルを回収
した。回収したゲルに、カルシウム濃度が４００ｐｐｍ
となるように塩化カルシウム（２水和物）を加え充分撹
拌した後１時間放置した。次いで、ゲルをドラバル型遠
心分離機にかけ約１０リットルの沈殿物を回収した。沈
殿物に更に３０リットルの水を加えて沈殿を充分に撹拌
し、ドラバル型遠心分離機にかけて６．５ｋｇの沈殿物
を得た。得られた沈殿に２５リットルの水を加え、カル
シウム濃度が３０００ｐｐｍとなるように塩化カルシウ
ム（２水和物）を添加して充分撹拌し、ドラバル型遠心
分離機を使用して上澄み液２５リットルを回収した。一
方、遠心分離により分離された沈殿物５リットルは、１
２リットルの塩化カルシウム溶液（３０００ｐｐｍ）で
更に充分洗浄し、洗浄液をドラバル型遠心分離機を使用
して回収した。この液と先ほどの２５リットルの上澄み
液を合わせて３９リットルの溶出液を得た。

【００３６】（３） 上記（２）で得た溶出液３９リッ
トルにリン酸二水素ナトリウム塩２９．１ｇを加え、ｐ
Ｈを７．２に調整した。この液を８０℃まで加熱し、熱
に不安定な物質をドラバル型遠心分離機を使用して除去
し、更に限外濾過膜［日東電工(株)製；ＮＴＵ−３２５
０ＣＩＲ］を用いて濃縮し、併せて余剰カルシウム塩の
脱塩を行って濃縮液を得た。 （４） 上記（３）で得た濃縮液１４リットルをアンモ
ニアでｐＨ７．５に調整し、フィルタープレスにて不純
物を除去した後、３ｋｇの陽イオン交換樹脂［三菱化成
（株）製；ダイヤイオンＨＰＫ−５５］で処理し、処理
液をクエン酸を用いてｐＨ４に調整した。ｐＨ調整した
液を８０℃に加熱処理した後、凍結乾燥機にて乾燥して
約２５０ｇの乾燥粉末を得た。 （５） 上記（４）で得た乾燥粉末１ｇを０．１％トリ
フルオロ酢酸水溶液１００ｍｌに溶解し、下記の表２に
示した条件の高速液体クロマトグラフィーに供して、分
画したところ、図１に示すとおりの各ピークを得た。

【００３７】

【表２】 高速液体クロマトグラフィー条件 カラム： 充填材：CAPCELL PAK C18 SG120Å(粒径3μｍ)(資生堂社製) サイズ：４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ 温 度：５０℃ 流 速：０．５ｍｌ／分 検 出：２８０ｎｍにおける吸光度 移動相： Ａ液；０．１％トリフルオロ酢酸水溶液 Ｂ液；８０％アセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢酸の水溶液 よりなる下記の時間／濃度勾配を有する高圧リニアグラジエンド溶出 時間(分) Ａ液(％) Ｂ液(％) ０ ６５.５ ３４.５ ３０ ６５.５ ３４.５ ６０ ６４.５ ３５.５ ６０.１ ０ １００ ６５.０ ０ １００

【００３８】（６） 次に、図１におけるピーク１３の
画分を回収して、その回収物を用いて上記したSephadex
Ｇ−７５を用いるゲル濾過クロマトグラフィーでその
分子量を測定したところ、ほぼ２５，０００の分子量を
有していた。また、上記したＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた
ところ、分子量１２，５００に相当する位置に単一のバ
ンドを与えた。したがって、これらのことからピーク１
３の画分の回収物は分子量１２，５００の２つのサブユ
ニットから構成されることが判明した。そのサブユニッ
トのアミノ酸配列を上記した方法により調べたところ、
配列番号１で表される１２２個のアミノ酸が結合した構
造を有する蛋白質（Ａ）であることが判明した。ちなみ
に、上記した方法と同様にして図１の各ピーク画分の回
収物についても、その分子量およびアミノ酸配列を調べ
たところ、図１のピーク１１の画分は蛋白質０．１９Ａ
Ｉ、ピーク１５の画分は蛋白質０．２６ＡＩ、ピーク１
７の画分は蛋白質０．５３ＡＩ、およびピーク２０の画
分は蛋白質０．２８ＩＡであった。

【００３９】（７） 上記（６）で回収した蛋白質
（Ａ）の人膵臓α−アミラーゼ阻害活性を上記した方法
で測定したところ、下記の表３に示すとおりであった。
また、上記した既知の蛋白質０．２６ＡＩ、蛋白質０．
１９ＡＩ、蛋白質０．５３ＡＩおよび蛋白質０．２８Ａ
Ｉについても、その人膵臓α−アミラ阻害活性を上記し
た方法で測定したところ、下記の表３に示すとおりであ
った。

【００４０】

【表３】 蛋白質の種類 アミラーゼ阻害活性（Ｕ／ｍｇ） 本発明の蛋白質(Ａ)(配列番号１) ２０,５００ 蛋白質０.２６ＡＩ（配列番号２) ２６,１００ 蛋白質０.１９ＡＩ（配列番号３） ２０,３００ 蛋白質０.５３ＡＩ（配列番号４） ３,９４０ 蛋白質０.２８ＡＩ（配列番号５） ８４０

【００４１】上記の表３の結果から、本発明の蛋白質
（Ａ）は、従来のアミラーゼ阻害物質（蛋白質０．５３
ＡＩ、０．２８ＡＩ）などに比べて、数倍〜数十倍もの
高いアミラーゼ阻害活性を有していること、そして高い
アミラーゼ阻害活性を有する蛋白質０．１９ＡＩよりも
そのアミラーゼ阻害活性が高く、本発明者らが既に発明
した蛋白質０．２６ＡＩに次いで高いアミラーゼ阻害活
性を有していることがわかる。

【００４２】《実施例 ２》糖尿病でない健康な男子１
０名に対して、上記の実施例１の（６）で得られた蛋白
質（Ａ）を用いて、特開平７−４１４９９号公報の実施
例６に記載されているのと同様の方法によって、血糖値
の上昇値の測定および血液中のインシュリン量の測定、
並びに満腹感の持続性の評価を行ったところ、該特開平
７−４１４９９号公報の実施例６で得られたのとほぼ同
様の結果から得られ、本発明の蛋白質（Ａ）が血糖値の
上昇抑制、インシュリン分泌の抑制および満腹感の持続
に効果があることが判明した。

【００４３】

【発明の効果】本発明の新規な蛋白質（Ａ）は、高いア
ミラーゼ阻害活性を有している。そして、本発明の蛋白
質（Ａ）を有効成分とするアミラーゼ阻害剤、血糖値上
昇抑制剤、インシュリン分泌調節剤および／または食欲
抑制剤は、人膵臓α−アミラーゼに対して高い阻害活性
を有し、人間に極めて有効であり、血糖値の上昇抑制、
インシュリン分泌の調節に高い効果を有し、満腹感を持
続させて食欲抑制を容易にすることができ、高血糖症、
糖尿病、高脂血症、動脈硬化、肥満などの予防および治
療に有効である。

【００４４】

【配列表】

【００４５】配列番号：１ 配列の長さ：１２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Gly Pro Trp Met Cys Tyr Pro Gly Tyr Ala Phe Lys Val Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Gly Cys Arg Pro Val Leu Lys Leu Gln Cys Asn Gly Ser Gln 20 25 30 Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asp Ile 35 40 45 Ser Glu Trp Cys Arg Cys Gly Ala Leu Tyr Ser Met Leu Asp Ser Met 50 55 60 Tyr Lys Glu His Gly Val Gln Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe 65 70 75 80 Pro Ser Cys Arg Arg Glu Val Val Lys Leu Thr Ala Ala Ser Ile Thr 85 90 95 Ala Val Cys Lys Leu Pro Ile Val Ile Asp Ala Ser Gly Asp Gly Ala 100 105 110 Tyr Val Cys Lys Gly Val Ala Ala Tyr Pro 115 120

【００４６】配列番号：２ 配列の長さ：１２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Gly Pro Trp Met Cys Tyr Pro Gly Tyr Ala Phe Lys Val Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Gly Cys Arg Pro Val Leu Lys Leu Gln Cys Asn Gly Ser Gln 20 25 30 Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asp Ile 35 40 45 Ser Glu Trp Cys Arg Cys Gly Ala Leu Tyr Ser Met Leu Asp Ser Met 50 55 60 Tyr Lys Glu His Gly Val Gln Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe 65 70 75 80 Pro Ser Cys Arg Arg Glu Val Val Lys Leu Thr Ala Ala Ser Ile Thr 85 90 95 Ala Val Cys Lys Leu Pro Ile Val Ile Asp Ala Ser Gly Asp Gly Ala 100 105 110 Tyr Val Cys Lys Gly Val Ala Ala Tyr Pro Asp Ala 115 120

【００４７】配列番号：３ 配列の長さ：１２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Gly Pro Trp Met Cys Tyr Pro Gly Gln Ala Phe Gln Val Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Ala Cys Arg Pro Leu Leu Arg Leu Gln Cys Asn Gly Ser Gln 20 25 30 Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala His Ile 35 40 45 Ser Glu Trp Cys Arg Cys Gly Ala Leu Tyr Ser Met Leu Asp Ser Met 50 55 60 Tyr Lys Glu His Gly Ala Gln Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe 65 70 75 80 Pro Arg Cys Arg Arg Glu Val Val Lys Leu Thr Ala Ala Ser Ile Thr 85 90 95 Ala Val Cys Arg Leu Pro Ile Val Val Asp Ala Ser Gly Asp Gly Ala 100 105 110 Tyr Val Cys Lys Asp Val Ala Ala Tyr Pro Asp Ala 115 120

【００４８】配列番号：４ 配列の長さ：１２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Gly Pro Trp Met Cys Tyr Pro Gly Gln Ala Phe Gln Val Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Gly Cys Arg Pro Leu Leu Lys Leu Gln Cys Asn Gly Ser Gln 20 25 30 Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asp Ile 35 40 45 Ser Glu Trp Pro Arg Cys Gly Ala Leu Tyr Ser Met Leu Asp Ser Met 50 55 60 Tyr Lys Glu His Gly Val Ser Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Ala Phe 65 70 75 80 Pro Ser Cys Arg Arg Glu Val Val Lys Leu Thr Ala Ala Ser Ile Thr 85 90 95 Ala Val Cys Arg Leu Pro Ile Val Val Asp Ala Ser Gly Asp Gly Ala 100 105 110 Tyr Val Cys Lys Asp Val Ala Ala Tyr Pro Asp Ala 115 120

【００４９】配列番号：５ 配列の長さ：１２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ser Gly Pro Trp Ser Trp Cys Asn Pro Ala Thr Gly Tyr Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Leu Thr Gly Cys Arg Ala Met Val Lys Leu Gln Cys Val Gly Ser 20 25 30 Gln Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asp 35 40 45 Ile Asn Asn Glu Trp Cys Arg Cys Gly Asp Leu Ser Ser Met Leu Arg 50 55 60 Ala Val Tyr Gln Glu Leu Gly Val Arg Glu Gly Lys Glu Val Leu Pro 65 70 75 80 Gly Cys Arg Lys Glu Val Met Lys Leu Thr Ala Ala Ser Val Pro Glu 85 90 95 Val Cys Lys Val Pro Ile Pro Asn Pro Ser Gly Asp Arg Ala Gly Val 100 105 110 Cys Tyr Gly Asp Trp Cys Ala Tyr Pro Asp Val 115 120

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例において、複数のアミラーゼ阻
害物質を含有する粗精製物（混合物）を高速液体クロマ
トグラフィーにかけて得られた画分のピークを示す図で
ある。

【手続補正書】

【提出日】平成８年９月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１５】 すなわち、例えば、下記の〜のいず
れかの方法で、複数のアミラーゼ阻害物質からなる混合
物を調製し、その混合物を高速液体クロマトグラフィー
にかけて、例えば０．１％トリフルオロ酢酸水溶液をＡ
液とし、８０％アセトニトリルと０．１％トリフルオロ
酢酸の水溶液をＢとして、時間／濃度勾配を有する高圧
リニアグラジエント溶出を行って、それぞれのアミラー
ゼ阻害物質（蛋白質）をそのリテンションタイムの違い
によって分画し、蛋白質（Ａ）に相当する画分を回収す
ることによって、蛋白質（Ａ）を得ることができる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２９】

【表１】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３７】

【表２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ２３Ｌ 1/307 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＤＮ Ｃ０７Ｋ 14/415 ＺＮＡ ＡＤＰ (72)発明者 村山 隆二 兵庫県宍粟郡山崎町三谷40番地１

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表されるサブユニット２個
   からなる蛋白質であることを特徴とするアミラーゼ阻害
   物質。
2. 【請求項２】 請求項１のアミラーゼ阻害物質を有効成
   分として含むことを特徴とするアミラーゼ阻害剤。
3. 【請求項３】 請求項１のアミラーゼ阻害物質を有効成
   分として含むことを特徴とする血糖値上昇抑制剤または
   インシュリン分泌調節剤
4. 【請求項４】 請求項１のアミラーゼ阻害物質を有効成
   分として含むことを特徴とする食欲抑制剤。
5. 【請求項５】 請求項１のアミラーゼ阻害物質の含有量
   が２０重量％以上であるか、または請求項１のアミラー
   ゼ阻害物質と、配列番号２で表されるサブユニット２個
   からなる蛋白質および配列番号３で表されるサブユニッ
   ト２個からなる蛋白質の少なくとも１種との合計含有量
   が２０重量％以上である、請求項２〜４のいずれか１項
   の剤。
6. 【請求項６】 請求項１のアミラーゼ阻害物質を添加し
   たことを特徴とする食品。