CN104372054A - 一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽及其制备方法，本发明的鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽的制备方法，包括有胶原蛋白酶解物的制备和金属螯合肽的分离制备步骤。本方法以二甲基亚砜替代水作为反应介质，然后在此无水体系中对交联琼脂糖进行活化，有效抑制了活化过程中的水解反应，该体系中环氧氯丙烷对交联琼脂糖凝胶的活化效率大幅度提高，环氧基活化密度范围为157-165μmol/mL，较目前报道的最高值提高50％，进而获得了高配基密度和对蛋白质具有高载量的固定化金属亲和层析介质。采用本方法制备的螯合肽对金属离子的结合能力强，稳定性好，螯合活性大于0.5mmol/g。

Description

一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽及其制备方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，具体一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽及其制备方法。

背景技术

螯合肽是指来源于食源性蛋白，具有一定的矿物质元素螯合能力或者在消化吸收过程中能发挥潜在的促矿物质元素吸收和提高矿物质元素生物利用度的一类多肽。矿物质钙、锌、铁和铜在人体内拥有各种各样的生物功能。饮食中矿物质元素缺乏可能导致各种各样的疾病进而影响身体机能。

营养学家建议在日常饮食中食用富含矿物质元素和有促矿物质吸收功能的食物。从健康和饮食偏好的角度考虑，食源营养补充剂更易被人们接受。食源性矿物质元素补充剂更是在近些年成为研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽及其制备方法，即一种从鳕鱼皮胶原蛋白肽中分离制备的，具有螯合钙、铁和铜能力的蛋白肽。

本发明的鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽的制备方法，包括如下的步骤：

1)胶原蛋白酶解物的制备：

在鳕鱼皮胶原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶进行水解，水解结束后使胰蛋白酶失活，离心得到上清液备用；

其中胶原蛋白水溶液的浓度为0.5％-5％(w/v)，胰蛋白酶在水溶液中的浓度为2％-5％(w/w)；

2)金属螯合肽的分离制备：

将步骤1)的上清液加入到固定化金属亲和层析柱中进行结合，然后用pH7.6的去离子水进行清洗，再用pH为3.0的盐酸溶液将结合在固定化金属亲和层析柱上的螯合肽洗脱下来；收集洗脱液，真空旋转蒸发去除盐酸后获得鳕鱼皮胶原蛋白螯合肽；

其中盐酸溶液的浓度为0.5-1.5mol/L；

固定化金属亲和层析柱的制备步骤如下：在以二甲基亚砜溶剂中将环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶Sepharose 6B与亚氨基二乙酸在50-80℃下交联5-10小时，制备亲和层析柱基质；再分别将3-5个柱体积的0.1-0.5mol/L的金属离子溶液与柱内基质充分结合2-5小时，再用去离子水洗去未结合的金属离子，固定化金属亲和层析柱。

其中金属离子溶液为CaCl₂、ZnSO₄、FeSO₄或CuSO₄溶液。

本方法以二甲基亚砜替代水作为反应介质，然后在此无水体系中对交联琼脂糖进行活化，有效抑制了活化过程中的水解反应，该体系中环氧氯丙烷对交联琼脂糖凝胶的活化效率大幅度提高，环氧基活化密度范围为157-165μmol/mL，较目前报道的最高值提高50％，进而获得了高配基密度和对蛋白质具有高载量的固定化金属亲和层析介质。采用本方法制备的螯合肽对金属离子的结合能力强，稳定性好，螯合活性大于0.5mmol/g。

附图说明

图1：胶原蛋白肽的固定化金属亲和层析纯化图。

具体实施方式

本发明通过胰酶水解鳕鱼皮胶原、固定化金属亲和层析分离获得了螯合肽。

实施例1

1)胶原蛋白酶解物的制备：

将鳕鱼皮胶原蛋白溶于蒸馏水中(1:50，w/v)，用NaOH调整pH至7.5，然后在37℃预热10分钟，向上述反应液中加入胰蛋白酶(1:25，w/w)水解15分钟，其中胰酶的酶活4×10⁵u/g，然后100℃沸水浴中灭酶10分钟，4000rpm离心10分钟，上清液冻干。

相同条件下，对比胰蛋白酶、碱性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶的水解效果，胰蛋白酶的水解效果最好，胰蛋白酶水解物的金属螯合活性分别为碱性蛋白酶Alcalase水解物的1.2倍、为木瓜蛋白酶水解物的1.5倍。

2)固定化金属亲和层析柱(IMAC)的制备

将琼脂糖凝胶Sepharose 6B用蒸馏水反复洗涤除去乙醇后，与60％(v/v)的二甲基亚砜水溶液(即无水体系)混合，搅拌清洗10min。称取处理后的琼脂糖凝胶，与定量二甲基亚砜、环氧氯丙烷、水、NaOH混合。混合液于45℃恒温振荡器中反应3h。将处理后的混合液用大量去离子水洗涤至无环氧基检出。环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶Sepharose 6B与亚氨基二乙酸(3:10，w/v)在60℃下交联8小时，制备亲和层析柱基质。然后分别将5个柱体积的0.2mol/L CaCl₂、ZnSO₄、FeSO₄和CuSO₄溶液与柱内基质充分结合2小时，再以5个柱体积的去离子水洗去未结合的金属离子，制成钙、锌、铁和铜固定化金属亲和层析柱。

相对于其他螯合肽分离纯化方法，固定化金属亲和层析法的优势主要体现在：洗脱条件温和(本方法pH为7.6)条件下；再生后配体恢复完全，琼脂糖凝胶Sepharose 6B可再生几百次而不改变其层析特性；螯合肽洗脱容易，采用较低pH(pH为3.0)便可将吸附螯合肽解吸下来。

3)固定化金属亲和层析柱对螯合肽的富集：取2mL胶原蛋白酶解物水溶液(pH 7.6，15mg/mL)，加入固定化金属亲和层析柱中。用pH 7.6的去离子水以1mL/min速度洗脱未与固定化的金属离子结合的多肽，紫外检测器检测214nm吸光值，充分洗脱直至无214nm吸收。结合在固定化的金属亲和层析柱上的肽用1mol/L的HCl(pH 3.0)洗脱下来，收集洗脱液，反复真空旋转蒸发去除HCl，得到胶原蛋白金属螯合肽。采用固定化金属亲和层析柱可以去除没有螯合活性的多肽，对钙、锌、铁和铜的螯合肽进行富集纯化。本方法共鉴定出11条矿物质螯合肽，即钙螯合肽WR、SGSTGH和GPAGPHGPPG，锌螯合肽NI/LGER、GPAGPR、AGPAGPR、VGLIGPR和NGPAGPR，铁螯合肽SCH、GPAGPHGPPG，和铜螯合肽SAC、GPAGPHGPPG和GPVGPHGPPGKDG。

4)铁螯合活性

胶原蛋白螯合肽(250μL，1mg/mL)溶解在缓冲液(0.05mol/L醋酸钠，pH 5.0)中后加到96孔板内在酶标仪(BioTek InstrumentsInc.，VT，USA)内37℃预热5分钟，加入20μL的0.25mmol/L FeSO430分钟后，加入15μL的2.5mmol/L的ferrozine来终止反应。10分钟后测定562nm处的吸光度值。以去离子水代替样品作为空白对照。酪蛋白磷酸肽用作正相对照。铁螯合率(％)＝(Abs_空白-Abs_样品)Abs_空白×100％。螯合肽的铁鏊合率为21.5±1.03％。

5)胶原蛋白螯合肽铜螯合活性

200μL胶原蛋白螯合肽(100μg/mL，0.05mol/L醋酸钠，pH 5.0)加到96孔板，在37℃预热5分钟，然后加入20μL的CuSO₄(1mg/mL)。30分钟后，加入10μL(2mmol/L)的PV终止反应，在632nm处测吸光度值。以去离子水代替样品作为空白对照。酪蛋白磷酸肽用作正相对照。铜螯合率(％)＝(Abs_空白-Abs_样品)/Abs_空白×100％。螯合肽的铜鏊合率为8.45±0.25％。

6)钙螯合活性

4mL胶原蛋白螯合肽(0.75mg/mL,20mmol/L磷酸钠缓冲液溶解,pH 7.5，)，加入2mL CaCl2(5mmol/L)，在37℃孵育30分钟。然后将混合液以4000rpm的速度离心20分钟，取上清液稀释至合适浓度后用原子吸收法测溶解钙的含量。设置不加多肽的空白对照组。螯合活性结果表示为每mg多肽能结合的Ca(μg)的量(μg Ca/mg peptide)。螯合的钙离子的量＝样品上清液中溶解钙的量-空白对照组上清液钙的量。钙螯合活性为0.32μg/mg。

7)钙螯合肽的鉴定

胶原蛋白源螯合肽首先用Chelex 100脱盐，然后过0.22μm滤膜过滤，然后冻干，用0.1％的甲酸(v/v)溶解成1mg/mL，取7μL采用液-质联用分析。液相色谱流动相A为0.1％的甲酸(v/v)，流动相B为0.1％的甲酸(v/v)溶于80％的乙腈配制。采用Acquity UPLC C18BEH色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，流速0.2mL/min。进样后使用流动相A将样品在色谱柱内保留5分钟，然后以0-40％流动相B线性洗脱55min。质谱采用电喷雾三重四极杆液质联用仪(Agilent G6410B,USA)进行测定，电喷雾干燥气温度300℃，流速6L/min，25psi的惰性气体压力，毛细管电压4000V。正电子模式条件下扫描范围50-400m/z，每次扫描1.03个周期。结果使用PEAKS Studio 6软件对Mascot数据库进行搜索，对多肽的氨基酸序列进行分析，确定金属螯合肽中多肽的种类和序列(表1)。

表1：鳕鱼皮胶原蛋白螯合肽的鉴定

Claims (7)

1.一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)胶原蛋白酶解物的制备：

在鳕鱼皮胶原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶进行水解，水解结束后使胰蛋白酶失活，离心得到上清液备用；

2)金属螯合肽的分离制备：

将步骤1)的上清液加入到固定化金属亲和层析柱中进行结合，然后用pH7.6的去离子水进行清洗，再用pH为3.0的盐酸溶液将结合在固定化金属亲和层析柱上的螯合肽洗脱下来；收集洗脱液，真空旋转蒸发去除盐酸后获得鳕鱼皮胶原蛋白螯合肽。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中胶原蛋白水溶液的浓度为0.5％-5％。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中胰蛋白酶在水溶液中的浓度为2％-5％。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中盐酸溶液的浓度为0.5-1.5mol/L。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中固定化金属亲和层析柱的制备步骤如下：在以二甲基亚砜溶剂中将环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶Sepharose 6B与亚氨基二乙酸在50-80℃下交联5-10小时，制备亲和层析柱基质；再分别将3-5个柱体积的0.1-0.5mol/L的金属离子溶液与柱内基质充分结合2-5小时，再用去离子水洗去未结合的金属离子完成制备。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的金属离子溶液为CaCl₂、ZnSO₄、FeSO₄或CuSO₄溶液。

7.一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽，其特征在于，所述的螯合肽是用权利要求1所述的方法制备的。