CN102617716A - 一种新型白果蛋白的制备和表征方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种新型白果蛋白的制备和表征方法，将新鲜白果经脱脂和减压沸腾提取，沉淀、膜分离和DEAE纤维素树脂及葡聚糖凝胶(Sephadex)G纯化蛋白质，首次分离富集蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带，分子量分别为21.4KDa、17.9KDa、15.8KDa。蛋白belt1由分子量分别为m/z1408.65、1663.94、1823.86、2064.99和2208.08五条肽段组成的球蛋白11S-globulin。蛋白belt2为新蛋白，由分子量m/z：2131和m/z：2338肽段组成，m/z：2131肽段的精确序列为I/L S A I/L T A DI/L G N W Q/K D S P G I/L R，m/z：2338肽段的精确序列为A A Q/K V D S S S D V Y A S D N I/L P G G N R。蛋白belt3为分子量分别为1605、1913、2053、2242和2355五条肽段组成。本发明制备富集的白果蛋白质含量高于90％，由16种氨基酸组成，其中丙氨酸(Ala)、赖氨酸(Lys)和缬氨酸(Val)大于4.0％，天冬氨酸(Asp)大于6.5％，丝氨酸(Ser)大于10.5％，组氨酸(His)大于40.5％。

Description

一种新型白果蛋白的制备和表征方法

一、技术领域

本发明涉及一种新型白果蛋白的制备方法，尤其是白果蛋白的提取分离和结构表征技术。

二、背景技术

蛋白质是两性物质，在不同的pH值环境下可解离为正离子和负离子，而且具有各自的等电点。而使蛋白质稳定的基本因素是它分子表面的水化层与同性电荷的作用，若破坏这些因素即可促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这就是蛋白质盐析、等电点沉淀和有机溶剂分离沉淀法的基本原理。

蛋白质按其溶解度分类可分为：(1)清蛋白，溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液，为饱和硫酸铵所沉淀；(2)球蛋白，溶于稀盐溶液，为半饱和硫酸铵所沉淀；(3)谷蛋白，不溶于水、醇及中性盐溶液，但易溶于稀酸或稀碱；(4)醇溶谷蛋白，不溶于水及无水乙醇，但溶于70～80％乙醇中；(5)组蛋白，溶于水及稀酸，但为稀氨水所沉淀，分子呈碱性；(6)鱼精蛋白，溶于水及稀酸，不溶于氨水；(7)硬蛋白，这类蛋白一般是动物体内做为结缔及保护功能的蛋白质，不溶于水、盐、稀酸或稀碱。

蛋白质按其结构和构象的不同可分为两大类，即纤维状蛋白质和球状蛋白质两大类。然后用适当的溶剂进行提取。如清蛋白可选择用水和盐溶液，球蛋白用盐溶液，组蛋白和谷蛋白等不溶于水或盐的可选择用稀酸或稀碱溶液。在提取的过程中，考虑到蛋白质受温度的影响会变性，一般选择常温搅拌提取、低温减压提取、超声波和微波辅助提取等。当获得蛋白质混合物提取液后，想要将所要的蛋白质与其它杂质初步分离开来，一般采用盐析等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。同时可采用离子交换层析、凝胶过滤、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，膜过滤分级的方法。

银杏树(Ginkgo Biloba L.)是落叶乔木中雌雄异株的裸子植物，原产于中国，素有“活化石”，“植物界的熊猫”之称。白果在我国食用、药用历史已有3000年之久。近十几年来，对银杏白果蛋白的研究取得了一定的进展。Uwe等在1989年从白果中分离出一种类似豆球蛋白的物质。牛卫宁等报道了从白果中提取得到的蛋白具有抗菌作用。黄文等应用不同的提取方法，分离出白果清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和碱溶蛋白等，发现白果中的蛋白质主要以清蛋白和球蛋白为主，其中白果清蛋白具有抗氧化和延缓衰老等作用。邓乾春等分离出一种新蛋白GAPIIa并对其进行氨基酸残基分析，指出氨基酸组成为脂肪族氨基酸残基占33.21％(共90个)，芳香族氨基酸残基占7.38％(共20个)，羟基氨基酸残基与含硫氨基酸残基占26.57％(共72个)，酸性氨基酸残基及其酰胺占23.61％(共64个)，碱性氨基酸残基占6.27％(共17个)。经证实GAP具有较明显的抗生物氧化活性。黄文等采用Halliwell方法对白果中不同蛋白清除羟基自由基(·OH)的能力进行了测定，相应的抑制率为清蛋白(50.84％)、球蛋白(24.09％)、醇溶蛋白(45.78％)、碱溶蛋白(41.33％)。邓乾春等探讨白果清蛋白(GAP)对正常小鼠的免疫调节作用。

由于白果蛋白具有很好的药食价值，随着我国银杏种植业规模的扩大，白果产量日益增加，需要开发具有高新技术含量的白果蛋白深加工产品。本发明专利重点研究白果蛋白质提取和分离方法，制备一种新型白果蛋白，为银杏产业的发展提供技术。

三、发明内容

技术问题：

蛋白质在提取分离过程中受外界因系影响会变性，本发明的技术难点在于提取白果蛋白的过程中保持蛋白的结构不变，制备高纯度的蛋白质，分离鉴定新型结构蛋白质。

技术方案：

本发明公开了一种新型白果蛋白的制备和表征方法，新鲜白果经脱脂和减压沸腾提取，分离富集蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带。

为了实现本技术方案，本发明具体步骤如下：

第一步：新鲜白果在-10℃至-50℃下冷冻干燥，除去外壳和内衣，将果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6％、粒度在10目-50目的白果粗粉。

第二步：用非极性溶剂与白果粗粉按质量比例4-30∶1(g/g)加入到脱脂釜萃取0.5～10小时，萃取温度-10℃至80℃，过滤，滤渣在室温通风下干燥，制备脱脂白果粉。

第三步：将脱脂白果粉加入到0.1-0.50mol/L NaCl盐溶液减压沸腾提取5～30min，提取溶剂pH8-9，提取温度20℃-75℃，脱脂白果粉与提取剂质量体积比例为1∶3-1∶30(g/ml)，提取次数2-6次，合并提取液。

第四步：将盐溶液提取液采用40％-80％硫酸铵溶液两次沉淀，沉淀时间3-24h，pH 5-7，滤液经过不同孔径膜切割分离分子量10 000 Da～30 000 Da的蛋白质溶液，-10℃至-50℃下冷冻干燥制备高纯度白果蛋白粉。

第五步：用DEAE-Cellulose树脂对白果蛋白粉进行纯化。白果蛋白粉与去离子水质量体积比例为1∶3-1∶50(g/ml)，用缓冲液pH 7.0-9.5的0.1-1.5mol/L NaCl溶液洗脱树脂，洗脱下来的蛋白质样品经过电泳分析，得到蛋白质样品由分子量为21.4KDa、17.9KDa和15.8KDa谱带组成。

第六步：将DEAE-Cellulose树脂洗脱液经过葡聚糖凝胶G纯化，分离得到蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带。

第七步：采用电泳技术及MALDI-TOF-TOF质谱技术对纯化的蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带进行一级结构表征，分离鉴定新型白果蛋白。

第八步：采用17种氨基酸标准品做外标对照，建立HPLC氨基酸的分析方法，分析新型白果蛋白中氨基酸的组成和相对含量。

本发明采用电泳技术及MALDI-TOF-TOF质谱技术对纯化的蛋白质进行一级结构的分析。MALDI-TOF-MS质谱分析仪(Applied Biosystems)缓冲溶液采用1/15mol/L NaHPO₄，1/15mol/L KH₂PO₄，以不同的比例配制不同pH值的样品缓冲液。pH＝3.5，pH＝4，pH＝4.5，pH＝5，pH＝5.5，pH＝6，pH＝6.5，pH＝7.0，pH＝7.5，pH＝8.0，pH＝8.5，pH＝9.0的样品缓冲液。分析条件：UV激光，355nm下200Hz的重复率，20KV电压，质量分辨率为1 500Da，采用胰蛋白酶消化肌红蛋白做为仪器内部校正。MS检测限为100ppm，MS/MS检测限为0.6Da；在此条件下获得的样品质谱峰使用4700Explore^TM Software(Applied Biosystems)在默认模式下进行分析，数据结果由GPS Explore(V3.6)提供的MASCOT(2.1)搜索引擎进行分析比对，参数设置如下：NCBI(美国国立生物信息中心)数据库；蛋白分子质量范围700～3 200 Da；胰蛋白酶消化；蛋白匹配度(protein scores)大于59或MS/MS的离子匹配度(ion score)大于30为显著(P＜0.05)。

本发明电泳marker标准曲线以14.4KD marker条带为基线，量取每个条带到基线的距离，并以此为横坐标X，分子量为纵坐标Y，绘制标准曲线方程：Y＝4.8312X+14.4，R²＝0.8746。本发明分离富集蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带。其特征在于蛋白belt1由分子量分别为m/z1408.65、1663.94、1823.86、2064.99和2208.08五条肽段组成的球蛋白11S-globulin，通过NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到蛋白质gi/949869(legumin)，分子量为51418，等电点(pI)8.69。蛋白belt2为新蛋白，由分子量m/z：2131和m/z：2338肽段组成，m/z：2131肽段的精确序列为I/L S A I/L T A D I/L G N W Q/KD S P G I/L R，m/z：2338肽段的精确序列为A A Q/K V D S S S D V Y A S D N I/L P G G N R。蛋白belt3为分子量分别为1605、1913、2053、2242和2355五5个肽段组成，通过NCBI通过NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到的蛋白是belt1蛋白和belt2蛋白混合物。

本发明蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带的一级结构解析如图1-7.

belt1蛋白的质谱

利用MALDI-TOF-TOF质谱对条带1蛋白进行肽段测序，如图1，共获得近50条肽段，选取离子强度较大的5个肽段1409、1664、1824、2065和2208进行MS/MS分析，通过BLAST(蛋白质序列对比工具)将获得的这5条肽段序列提交NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到蛋白质gi/949869(legumin)，11S-globulin，匹配度121，分子量为51.418KDa，等电点(pI)8.69。MASCOT显示此种蛋白质全序列如表1所示，下划线部分是匹配到的序列组，占全序列的38％。

表1belt1的蛋白全序列

belt2蛋白的质谱

belt2经胰蛋白酶酶解，MALDI-TOF-TOF分析后得到该酶的肽指纹图谱，如图3，由于在MALDI条件下C端为Arg的肽离子化效率明显高于C端的Lys肽，因而经过磺化反应后，如图4，选择2条离子化效率相对较高的Arg肽(肽段m/z：2131和肽段m/z：2338)进行MS/MS分析，如图5，清晰的展出一系列离子，通过手工计算相邻系列离子的质量差可知，肽段m/z：2131的的精确序列为I/L S A I/L T A D I/L G N WQ/K D S P G I/L R，肽段m/z：2338的精确序列为A A Q/K V D S S S D V Y A S D N I/L P G G N R。

belt3蛋白的质谱

belt3蛋白经过MALDI-TOF-TOF分析，如图5，获得一系列肽段，选取离子强度较大的5个肽段1605、1913、2053、2242和2355进一步进行MS/MS分析，通过BLAST(蛋白质序列对比工具)将获得的这5条肽段序列提交NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到的蛋白与belt1蛋白相同，只是匹配度稍低，为89，并且从质谱图中得到部分峰与belt2蛋白相同，也就是说，belt3可能不是单一组分纯蛋白质，而是一个混合蛋白条带，包含belt1的一个大片段和belt2的部分片段，可能是因为蛋白的断裂或者蛋白相互作用导致的。

本发明采用电泳图谱分析，得到蛋白质样品由分子量不同的三个谱带组成。其中蛋白带belt1分子量为21.4KDa，是蛋白质gi/949869的一个主要的肽段。belt2分子量为17.9KDa，belt3分子量为15.8KDa。如图6-7。

本发明制备的新型白果蛋白，富含16种氨基酸，其中丙氨酸Ala、赖氨酸(Lys)和缬氨酸Val大于4.0％，天冬氨酸Asp大于6.5％丝氨酸(Ser)大于10.5％，组氨酸(His)大于40.5％。本发明HPLC氨基酸分析条件：邻苯二甲醛柱前衍生，固定相C18(Φ4.6×50mm，5μm)，流动相A：醋酸钠溶液(内含3‰四氢呋喃)；流动相B：水∶甲醇∶乙腈＝200∶450∶350，进行线性梯度洗脱。如表2：

表2盐溶蛋白的氨基酸组成

纯化样品与原粉相比，氨基酸种类没有差异，除没有蛋氨酸，均含有16种氨基酸，但是样品加工不同，其中氨基酸组成相对比例发生了明显变化。从表2看出，经纯化后的蛋白质，赖氨酸(Lys)从1.25％提高至4.53％，丝氨酸(Ser)从1.83％提高至10.55％，组氨酸(His)从10.34％提高至44.24％，说明原料经过NaCl溶液提取和DEAE纤维素层析纯化，不仅明显提高总蛋白的含量，并且改变了蛋白质中氨基酸的相对组成，能明显的富集赖氨酸、丝氨酸和组氨酸。

蛋白质与水的结合能力取决于蛋白质组成中的极性基团所处的位置。如清蛋白和球蛋白易溶于水，是由于球状蛋白的非极性基团较少，大都被包裹在内部，极性基团广泛分布在球状蛋白表面，因此依靠极性基团与水分子或盐离子之间的键合力而紧密的结合在一起，提高了球蛋白在水中的溶解能力。相反的，醇溶性的谷蛋白不溶于水，是由于其组成上脯氨酸和酰胺较多，造成非极性侧链比极性侧链多，使得与水之间的作用力较弱。在此盐溶蛋白中，有明显增长趋势的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)和赖氨酸(Lys)都是极性氨基酸，而呈明显下降趋势的谷氨酸(Glu)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(Ilu)及脯氨酸(Pro)都是非极性氨基酸，造成蛋白结构表面的极性基团增大，这就解释了盐溶蛋白与白果粗蛋白氨基酸组成上的不同。

为了保证白果蛋白的结构，本发明采用新鲜白果在-10℃至-50℃下冷冻干燥，干燥4-30小时。由于新鲜白果水份在50-85％，因此，优选10-20小时。除去外壳和内衣，将果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6％、粒度在10目-50目的白果粗粉。白果粗粉中含有3-10％油脂，容易引起蚝败变质，因此将白果粉中的油脂分离可延长白果粉的保存期。

本专利用非极性溶剂与白果粗粉按质量比例4-30∶1(g/g)，优选8-12(g/g)，加入到脱脂釜萃取0.5～10小时，萃取温度-10℃至80℃，优选-10℃至20℃，过滤，滤渣在室温通风下干燥，制备脱脂白果粉。非极性溶剂可选择正己烷、石油醚、6号溶剂油、丙酮等溶剂中一种或几种任意比例的混合溶剂，优选石油醚(60℃-90℃)、6号溶剂油和正己烷。

为了降低提取温度，本发明首次采用减压沸腾提取白果蛋白，将脱脂白果粉加入到0.1-0.50mol/L Nal盐溶液，优选0.1-0.20mol/L，减压沸腾提取5～30min，提取溶剂pH8-9，提取温度20℃-75℃，优选5～10min，pH8-8.5，温度20℃-55℃，脱脂白果粉与提取剂质量体积比例为1∶3-1∶30(g/ml)，提取次数2-6次，优选比例为1∶8-1∶20(g/ml)，提取次数2-3次，合并提取液。

本发明采用60％～80％的硫酸铵溶液沉淀蛋，优选60％～70％，盐析两次，沉淀时间3-24h，pH 5-7，优选时间8-16h，pH 6。对于时间对盐析的影响由图9显而易见，随着盐析时间的增加，蛋白质的沉淀量呈上升的趋势，在时间大于12h后，上升的趋势开始变的不明显，因此在盐析蛋白质时，静置时间一般选择大于12h为宜。pH值对盐析的影响很显著(图10)，在pH为6时使得沉淀达到最高值，pH大于7时沉淀量明显下降，因此，选择最佳盐析pH值为6。

本专利采用不同孔径膜切割分离分子量10 000 Da～30 000 Da的蛋白质，采用DEAE纤维素树脂和葡聚糖凝胶(Sephadex)G纯化蛋白质，优选DEAE-52、Sephadex G-50和Sephadex G-75葡聚糖凝胶G-75，缓冲液pH 7.5，pH＝8的0.4mol/L NaCl溶液洗脱，纯化的样品蛋白质含量90％，氨基酸组成丰富，最大吸收峰为215nm。通过与沉淀得到的蛋白电泳图谱比较，可以看出经过离子交换色谱柱的蛋白质样品基本无背景，蛋白条带清晰，基本出现3到4种分子量不同的蛋白质。其中26KDa左右的条带模糊不清，颜色浅淡，说明此带蛋白含量较低，而在14.4～20.0KDa附近的3条蛋白带清晰，密度较高且无拖尾等现象，通过marker回归方程，结合belt1、belt12、belt13在凝胶中所处的位置估算可得到3个蛋白的分子量为21.4KDa、17.9KDa、15.8KDa。

有益效果：

1.本发明通过对新鲜白果进行冷冻干燥和脱脂预处理，采用低温减压沸腾提取蛋白质，代替传统的太阳爆晒、高温沸煮，不仅提取时间缩短2-3倍，而且温度低于50℃，保持了白果蛋白质的活性组分未变性。

2.采用低温减压沸腾提取、膜分离和DEAE纤维素树脂和葡聚糖凝胶(Sephadex)G纯化蛋白质，得到3个蛋白的分子量为21.4KDa、17.9KDa、15.8KDa，含量高于90％。

纯化样品与原粉相比，组氨酸(His)从10.34％提高至44.24％。

3.首次分离富集蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带。其特征在于蛋白belt1由分子量分别为m/z1408.65、1663.94、1823.86、2064.99和2208.08五条肽段组成的球蛋白11S-globulin。蛋白belt2为新蛋白，由分子量m/z：2131和m/z：2338肽段组成，m/z：2131肽段的精确序列为I/L S A I/L T AD I/L G N W Q/K D S P G I/L R，m/z：2338肽段的精确序列为A A Q/K V D S S S D V Y A S D N I/L PG G N R。蛋白belt3为分子量分别为1605、1913、2053、2242和2355五5个肽段组成。

四、附图说明

图1蛋白belt1的MALDI-TOF-MS图谱

图2蛋白belt1的肽段(A-E)MS/MS图谱

图3belt2蛋白酶解肽段的质谱图(A)和酶解肽段磺化后的质谱图(B)

图4belt2肽段序列MS/MS图谱分析(A-B)

图5belt3的MALDI-TOF-MS图谱

图6DEAE纯化样品的电泳图谱

图7DEAE纯化样品的分子量估算

图8提取单因素(A-D)对蛋白提取率的影响

图9时间对盐析的影响

图10pH对盐析的影响

图11白果蛋白质不同沉淀方式的电泳比较

图12膜分离蛋白质分子量范围分布

图13膜分离时间与透过液蛋白质含量的关系

图14pH对树脂吸附的影响图

图15离子强度对树脂解吸附的影响

图16树脂解吸附曲线

图17Sephadex G-50凝胶洗脱

图18Sephadex G-75凝胶洗脱

五、具体实施方式

以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。

实施例1

一种新型白果蛋白的制备和表征方法，以下步骤组成：

第一步：新鲜白果在-i0℃至-50℃下冷冻干燥，除去外壳和内衣，将果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6％、粒度在10目-50目的白果粗粉。

第二步：用非极性溶剂与白果粗粉按质量比例4-30∶1(g/g)加入到脱脂釜萃取0.5～10小时，萃取温度-i0℃至80℃，过滤，滤渣在室温通风下干燥，制备脱脂白果粉。

第三步：将脱脂白果粉加入到0.1-0.50mol/L NaCl盐溶液减压沸腾提取5～30min，提取溶剂pH8-9，提取温度20℃-75℃，脱脂白果粉与提取剂质量体积比例为1∶3-1∶30(g/ml)，提取次数2-6次，合并提取液。

第四步：将盐溶液提取液采用40％-80％硫酸铵溶液两次沉淀，沉淀时间3-24h，pH 5-7，滤液经过不同孔径膜切割分离分子量10 000 Da～30 000 Da的蛋白质溶液，-10℃至-50℃下冷冻干燥制备高纯度白果蛋白粉。

第五步：用DEAE-Cellulose树脂对白果蛋白粉进行纯化。白果蛋白粉与去离子水质量体积比例为1∶3-1∶50(g/ml)，用缓冲液pH 7.0-9.5的0.1-1.5mol/L NaCl溶液洗脱树脂，洗脱下来的蛋白质样品经过电泳分析，得到蛋白质样品由分子量为21.4KDa、17.9KDa和15.8KDa谱带组成。

第六步：将DEAE-Cellulose树脂洗脱液经过葡聚糖凝胶G纯化，分离得到蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带。

第七步：采用电泳技术及MALDI-TOF-TOF质谱技术对纯化的蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带进行一级结构表征，分离鉴定新型白果蛋白。

第八步：采用17种氨基酸标准品做外标对照，建立HPLC氨基酸的分析方法，分析新型白果蛋白中氨基酸的组成和相对含量。

样品经电泳分析得到3个蛋白带，分子量分别为21.4KDa、17.9KDa、15.8KDa。采用电泳技术及MALDI-TOF-TOF质谱技术对纯化的蛋白质进行一级结构的分析。MALDI-TOF-MS质谱分析仪(AppliedBiosystems)缓冲溶液采用1/15mol/L NaHPO₄，1/15mol/L KH₂PO₄，以不同的比例配制不同pH值的样品缓冲液。pH＝3.5，pH＝4，pH＝4.5，pH＝5，pH＝5.5，pH＝6，pH＝6.5，pH＝7.0，pH＝7.5，pH＝8.0，pH＝8.5，pH＝9.0的样品缓冲液。分析条件：UV激光，355nm下200Hz的重复率，20KV电压，质量分辨率为1500Da，采用胰蛋白酶消化肌红蛋白做为仪器内部校正。MS检测限为100ppm，MS/MS检测限为0.6Da；在此条件下获得的样品质谱峰使用4700 Explore^TM Software(Applied Biosystems)在默认模式下进行分析，数据结果由GPS Explore(V3.6)提供的MASCOT(2.1)搜索引擎进行分析比对，参数设置如下：NCBI(美国国立生物信息中心)数据库；蛋白分子质量范围700～3200Da；胰蛋白酶消化；蛋白匹配度(protein scores)大于59或MS/MS的离子匹配度(ion score)大于30为显著(P＜0.05)。

本发明电泳marker标准曲线以14.4KD marker条带为基线，量取每个条带到基线的距离，并以此为横坐标X，分子量为纵坐标Y，绘制标准曲线方程：Y＝4.8312X+14.4，R²＝0.8746。

蛋白belt1由分子量分别为m/z1408.65、1663.94、1823.86、2064.99和2208.08五条肽段组成的球蛋白11S-globulin，通过NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到蛋白质gi/949869(legumin)，分子量为51418，等电点(pI)8.69。蛋白belt2为新蛋白，由分子量m/z：2131和m/z：2338肽段组成，m/z：2131肽段的精确序列为I/L S A I/L T A D I/L G N W Q/K D S P G I/L R，m/z：2338肽段的精确序列为A A Q/KV D S S S D V Y A S D N I/L P G G N R。蛋白belt3为分子量分别为1605、1913、2053、2242和2355五5个肽段组成，通过NCBI通过NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到的蛋白是belt1蛋白和belt2蛋白混合物。

采用低温减压沸腾提取、膜分离和DEAE纤维素树脂和葡聚糖凝胶(Sephadex)G纯化蛋白质，得到3个蛋白的分子量为21.4KDa、17.9KDa、15.8KDa，含量高于90％。纯化样品与原粉相比，本实施例制备的新型白果蛋白，富含16种氨基酸，其中丙氨酸Ala、赖氨酸(Lys)和缬氨酸Val大于4.0％，天冬氨酸Asp大于6.5％丝氨酸(Ser)大于10.5％，组氨酸(His)大于40.5％。本发明HPLC氨基酸分析条件：邻苯二甲醛柱前衍生，固定相C18(Φ4.6×50mm，5μm)，流动相A：醋酸钠溶液(内含3‰四氢呋喃)；流动相B：水∶甲醇∶乙腈＝200∶450∶350，进行线性梯度洗脱。

本实施例优选石油醚(60℃-90℃)、6号溶剂油和正己烷作为脱脂溶剂，脱脂溶剂与与白果粗粉按质量比例4-30∶1(g/g)，优选8-12(g/g)，加入到脱脂釜萃取0.5～10小时，萃取温度-10℃至80℃，优选-10℃至20℃。

本实施例优选0.1-0.20mol/L NaCl盐溶液，减压沸腾提取5～30min，提取溶剂pH8-9，提取温度20℃-75℃，优选5～10min，pH8-8.5，温度20℃-55℃，脱脂白果粉与提取剂质量体积比例为1∶3-1∶30(g/ml)，提取次数2-6次，优选比例为1∶8-1∶20(g/ml)，提取次数2-3次，合并提取液。

本实施例优选60％～70％硫酸铵溶液盐析两次，沉淀时间3-24h，pH 5-7，优选时间8-16h，pH 6。优选DEAE-52、Sephadex G-50和Sephadex G-75葡聚糖凝胶G-75，缓冲液pH 7.5，pH＝8的0.4mol/L NaCl溶液洗脱，纯化的样品蛋白质含量90％，氨基酸组成丰富，最大吸收峰为215nm。通过marker回归方程，结合belt1、belt12、belt13在凝胶中所处的位置估算可得到3个蛋白的分子量为21.4KDa、17.9KDa、15.8KDa。

实施例2蛋白质一级结构分析

1.蛋白质样品条带的酶解

由实施例1经过纯化后的样品主要由三种蛋白质组成，假设电泳分析得到的蛋白质条带为单一蛋白质，切下目的蛋白belt1、belt2和belt3，分别置于Eppendorf管中，用60μL 50mM碳酸氢铵和50％乙腈洗涤脱色2次，60μL乙腈干燥2次。然后将干燥后的凝胶放置冰浴的消化液(12.5ng/μL胰蛋白酶和20mM碳酸氢铵)中培养20min，再转移至37℃培养箱中过夜消化。最后用60μL含有5％甲酸的50％乙腈提取溶液2次提取，离心取上清。上清液在N₂保护下干燥。干燥后的物质采用0.8μL基质溶液(5mg/mL

α-氰基-4-羟基-苯乙烯酸溶于0.1％TFA，50％ACN)溶解，供质谱测定。

2.蛋白质一级结构分析

将酶解后的样品用于MALDI-TOF-MS分析(Applied Biosystems)，分析条件：UV激光，355nm下200Hz的重复率，20KV电压，质量分辨率为1500Da，采用胰蛋白酶消化肌红蛋白做为仪器内部校正。MS检测限为100ppm，MS/MS检测限为0.6Da；在此条件下获得的样品质谱峰使用4700Explore^TM Software(Applied Biosystems)在默认模式下进行分析，数据结果由GPS Explore(V3.6)提供的MASCOT(2.1)搜索引擎进行分析比对，参数设置如下：NCBI(美国国立生物信息中心)数据库；蛋白分子质量范围700～3200Da；胰蛋白酶消化；蛋白匹配度(protein scores)大于59或MS/MS的离子匹配度(ion score)大于30为显著(P＜0.05)。

对于蛋白基因组序列测序不全，无法在蛋白质序列数据库匹配到模式物种的蛋白质，可以认为此蛋白是序列未知的新蛋白，此时采用磺基异硫氰酸苯酯化学辅助法对新蛋白进行从头测序。酶解肽段和磺化肽段同样采用MALDI-TOF-TOF飞行时间质谱仪进行源后裂解(PSD)分析，质谱配备波长为355nm、200Hz频率的Nd:YAG激光器，在进行串联(MS/MS)分析过程中，关闭碰撞诱导解吸(CD)，MALDI源产生的离子在8KV加速电压下通过6.7KV的格栅电压进入自由场漂移区的飞行管。MS/MS数据进行手工分析得到肽段的序列。

3.利用MALDI-TOF-TOF质谱对条带1蛋白进行肽段测序，belt1蛋白的质谱共获得近50条肽段，选取离子强度较大的5个肽段1409、1664、1824、2065和2208进行MS/MS分析，通过BLAST(蛋白质序列对比工具)将获得的这5条肽段序列提交NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到蛋白质gi/949869(legumin)，11S-globulin，匹配度121，分子量为51.418KDa，等电点(pI)8.69。MASCOT显示此种蛋白质全序列如表1所示。下划线部分是匹配到的序列组，占全序列的38％。

belt2蛋白的质谱

belt2经胰蛋白酶酶解，MALDI-TOF-TOF分析后得到该酶的肽指纹图谱，如图3，由于在MALDI条件下C端为Arg的肽离子化效率明显高于C端的Lys肽，因而经过磺化反应后，如图4，选择2条离子化效率相对较高的Arg肽(肽段m/z：2131和肽段m/z：2338)进行MS/MS分析，如图5，清晰的展出一系列离子，通过手工计算相邻系列离子的质量差可知，肽段m/z：2131的的精确序列为I/L S A I/L T A D I/L G N WQ/K D S P G I/L R，肽段m/z：2338的精确序列为A A Q/K V D S S S D V Y A S D N I/L P G G N R。belt3蛋白的质谱

belt3蛋白经过MALDI-TOF-TOF分析，如图6，获得一系列肽段，选取离子强度较大的5个肽段1605、1913、2053、2242和2355进一步进行MS/MS分析，通过BLAST(蛋白质序列对比工具)将获得的这5条肽段序列提交NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到的蛋白与belt1蛋白相同，只是匹配度稍低，为89，并且从质谱图中得到部分峰与belt2蛋白相同，也就是说，belt3可能不是单一组分纯蛋白质，而是一个混合蛋白条带，包含belt1的一个大片段和belt2的部分片段，可能是因为蛋白的断裂或者蛋白相互作用导致的。

实施例3白果蛋白质的低温减压提取

1.新鲜白果在-25℃下冷冻干燥8小时，除去外壳和内衣，用高速破碎机(4000r/mim)将果仁粉碎，粒度在10目-50目的白果粗粉，测水份重量百分比5.4％。

2.用石油醚(60-90℃)与白果粗粉按质量比例14∶1(g/g)加入到脱脂釜萃取1.5小时，萃取温度40℃，过滤，滤渣在室温通风下干燥，制备脱脂白果粉。

3.蛋白质在不同溶剂中按其溶解度可分为水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白、碱溶性蛋白和难溶性蛋白。本试验选择不同极性的溶剂依次提取泰兴白果，分析白果不同蛋白组分的分布，其结果如表3。

表3白果中不同提取部位蛋白质的相对含量

通过采用不同溶剂对不同部位的蛋白质进行提取实验，可得出水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白和难溶蛋白相对含量分别为22.6％、18.3％、1.8％、30.9％和26.4％，其中水溶性和盐溶性蛋白占40％，因此采用盐水溶液提取的蛋白质不但含量较高，条件相对也比较温和。

4.清蛋白是一种水溶性蛋白，可被硫酸铵分级沉淀，广泛存在于生物体内。大部分活性蛋白都属于盐溶或水溶性蛋白。

本实施例先考查溶剂pH值、提取时间、料液比(g/mL)和提取次数对蛋白质提取的影响。

溶剂pH值：分别调节提取溶剂的pH值为pH＝2、pH＝3、pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝6.5、pH＝7、pH＝7.5、pH＝8、pH＝8.5、pH＝9、pH＝11，选择料液比(g/mL)1∶5，提取1次，提取时间30min。

提取时间：分别选择5min，10min，15min，20min，25min，30min，40min，50min和60min，料液比(g/mL)1∶5，NaCl溶液pH＝8，提取1次。

料液比(g/mL)的影响：料液比(g/mL)分别选择1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9和1∶10，NaCl溶液pH＝8，提取30min，提取次数1次。

提取次数：选择提取次数1至5次，每次提取时间20-30min，NaCl溶液pH＝8，料液比(g/mL)1∶5。

5.通过单因素试验后，将脱脂白果粉加入到0.15mol/L NaCl盐溶液减压沸腾提取20min，提取溶剂pH8，提取温度45℃，脱脂白果粉与提取剂质量体积比例为1∶15(g/ml)，提取次数2次，合并提取液，蛋白质的提取率95％。

实施例4白果蛋白质的沉淀分离

1.取3个10mL离心管，分别称取蛋白质初提物0.5g，将试管标号1、2、3。1号试管中加入10％三氯乙酸溶液，2号试管中加入1.5mL水和4.5mL丙酮，3号试管中加入50％(NH₄)₂SO₄盐溶液，3支试管振荡，摇匀，放置冰箱静置过夜。离心除去上清液，观察沉淀量，并用盐溶液重新溶解沉淀，观察沉淀的复溶性，复溶后的蛋白质采用15％的凝胶进行电泳实验，观察蛋白条带。

2.盐浓度对盐析的影响

取8个20mL离心管，分别称取蛋白质初提物1g，加入10mL蒸馏水溶解，并分别加入硫酸铵1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g，充分摇匀，使硫酸铵溶于水中，保鲜膜封口后放入冰箱静置过夜，观察悬浮絮状物的量。结果如表4。絮状物的量随着盐浓度的增加而增加，浓度在60％～80％之间时沉淀量没有明显的增加，因此一次沉淀可选择硫酸铵浓度为60％，两次沉淀可选择硫酸铵浓度为60％和70％，能够尽可能的将蛋白质沉淀下来。

表4盐浓度对盐析的影响

注：①*数目表示沉淀物的多少the symble‘*’showed the amount of precipitate.

3.时间对盐析的影响

取5个20mL离心管，称取蛋白质初提物0.5g，加入10mL蒸馏水溶解，再加入5g(NH₄)₂SO₄充分摇匀，放入冰箱，分别静置5h，8h，12h，18h，24h后离心，收集沉淀，称重。

本实施例盐析时间对盐析的影响如图9，随着盐析时间的增加，蛋白质的沉淀量呈上升的趋势，在时间大于12h后，上升的趋势开始变的不明显，因此在盐析蛋白质时，静置时间一般选择大于12h为宜。

4.pH对盐析的影响

取5个20mL离心管，称取蛋白质初提物1g，加入10mL已配置好的不同pH(pH＝5，pH＝6，pH＝7，pH＝8，pH＝9)的缓冲溶液，再加入0.5g(NH₄)₂SO₄充分摇匀，放入冰箱静置过夜，收集沉淀，称重。

本实施例pH值对盐析的影响很显著(图10)，在pH为6时使得沉淀达到最高值，pH大于7时沉淀量明显下降，因此，选择最佳盐析pH值为6。

因此，本实施例采用60％和70％的硫酸铵两次沉淀蛋白质，选择沉淀时间为12h，沉淀pH为6，沉淀分离白果蛋白质，取得好的结果。

5.本实施例采用三种沉淀方式的比较，如表5。

表5三种沉淀方式的比较

经过3种沉淀方法的对比，发现硫酸铵沉淀法沉淀的蛋白质复溶性较好，活性保持的较好。并且通过电泳实验可以看出(图11)，硫酸铵沉淀得到的蛋白质浓度较高。

实施例5白果蛋白质的膜分离

1.选用3 000 MW，5 000 MW，10 000 MW，30 000 MW，50 000 MW，100 000 MW，0.2μm规格的聚砜膜，采用膜技术进行蛋白质分子量的切割，收集透过液1～透过液7及样8，采用凯式定氮法测定每个样品的蛋白质含量，考察盐析得到的蛋白质的分子量分布状况。(注：样品进入聚砜膜前，要先经过0.45μm的微孔滤膜除去杂质以及一些固体不溶颗粒，防止堵塞、污染聚砜膜)。

2.以500mL的盐提蛋白质溶液为原料，采用10 000MW的聚砜膜，在200rpm转速下进行膜分离，每隔2h于透过液出口取样5mL进行蛋白质含量测定，并同时用蒸馏水将贮液瓶加至500mL，摇匀。

3.膜分离蛋白质分子量分布

本实施例采用膜分离氯化钠盐提取白果蛋白溶液，蛋白质分子量范围与含量关系的区域面积图如图12。结果表明盐提溶液中的蛋白质主要分布在5 000 Da～50 000 Da范围内，其中5 000 Da～30 000 Da的蛋白质含量最高，在膜孔径大小超过0.2μm时，就很少有蛋白质存在。因此，采用0.45或0.2μm的膜进行过滤，有助于除去大分子物质的杂质，达到一定的纯化效果，并且可以进行膜切割，得到蛋白质含量较高的分子量范围。

4膜分离时间的确定

选择10 000MW的膜包，进行膜过滤，考察时间对膜分离的影响，确定500mL料液，200rpm转速下的最佳膜处理时间。如图13所示，随着时间的增加，透过液中蛋白质的含量呈下降的趋势，在前4个小时，下降的比较缓慢，6～14h期间透过液中蛋白质的含量急剧下降，之后又趋于平稳，且这个最低值在凯式定氮法的误差范围内，说明样液中能够透过膜的分子在14h内可以完全通过膜包。因此确定膜分离时的操作条件为：保证500mL料液，200rpm转速下，膜处理时间为12～14h。

5.膜法除盐

采用盐析法沉淀得到的蛋白质粗提物，含有大量的硫酸铵，过量硫酸铵试剂的存在不但会影响蛋白质的溶解性，也不利于进一步的分离纯化。因此本实施例利用膜组件截留大分子的特点，采用3 000MW的聚砜膜进行膜分离，达到除盐的目的。

实施例6DEAE-Cellulose树脂纯化分离

1.装柱预处理：称取30g DEAE-Cellulose树脂，0.5mol/L NaOH浸泡搅拌30min后，用去离子水冲洗至pH＝9，用0.5mol/L HCl浸泡搅拌30min后，用去离子水冲洗至pH＝6～7，用0.5mol/L NaOH浸泡30min使纤维素树脂转为OH-型，装柱后用5％NaCl洗脱使体系转为Cl型。

2.再生：0.5mol/L NaOH浸泡搅拌30min后，用去离子水冲洗至pH＝9，用0.5mol/LHCl浸泡搅拌30min后，用去离子水冲洗至pH＝6～7，用0.5mol/L NaOH浸泡30min使纤维素树脂转为OH-型，装柱后用5％NaCl洗脱使体系转为Cl型。

3.静态解吸附影响因素的确定

(1)样品缓冲液pH值对树脂吸附的影响

取12个10mL离心管，分别称取DEAE-Cellulose树脂各0.2g，加入0.5mL样液，并量取不同pH值的样品缓冲液4.5mL分别加入12个离心管，摇匀，放置摇床常温振荡2h后，离心取上清并测定其吸光值。

(2)洗脱液pH值对树脂解吸附的影响

取12个10mL离心管，分别称取DEAE-Cellulose树脂各0.2g，加入0.5mL样液，并量取pH值为7.5的样品缓冲液4.5mL分别加入12个离心管，摇匀，放置摇床常温振荡2h后离心，除去上层缓冲液，再分别向12个离心管中加入不同pH值的0.14mol/L的NaCl溶液，摇匀，放置摇床常温振荡2h，离心取上清并测定其吸光值。

(3)离子强度对纤维素树脂解吸附的影响

取10个10mL离心管，分别称取DEAE-Cellulose树脂各0.2g，加入0.5mL样液，并量取pH值为7.5的样品缓冲液4.5mL分别加入12个离心管，摇匀，放置摇床常温振荡2h后离心，除去上层缓冲液，再分别向10个离心管中加入0mol/L、0.05mol/L，0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、1mol/L NaCl溶液，摇匀，放置摇床常温振荡2h，离心取上清并测定其吸光值。

(4)饱和吸附量的测定

取5个10mL离心管，分别称取DEAE-Cellulose树脂0.2g，并分别加入0.5mL、1mL、1.5mL样液，每个试管中加入4mL pH＝7.5的样品缓冲液，摇匀，放置摇床常温振荡4h，离心取上清并测定其吸光值。根据280nm下，蛋白质的紫外吸收浓度公式：Y＝0.5993X+0.0132计算蛋白质含量。

4.动态解吸附曲线

根据静态吸附的条件，装填以DEAE-52为基质的纤维素树脂柱，柱规格：300×30mm，高15cm。上样10mL，样品中蛋白质含量为30mg。采用3倍体积的pH为7.5的磷酸缓冲液淋洗至基线，用pH 5.5的0.4mol/L NaCl溶液洗脱，流速为4mL/s，以5mL为一个单位进行收集，在紫外280nm下进行吸收光检测，并绘制洗脱曲线。

5.电泳法检测蛋白质条带

经过纯化的蛋白质样品采用电泳实验，检测蛋白质条带。

6.DEAE-Cellulose树脂静态吸附的条件实验

图14为样品在吸附过程中，缓冲体系不同的pH值对蛋白质吸附量的影响。在pH值为7.5的管中，离心上清液的吸光值最低，说明此体系下的树脂对样品蛋白质的吸附量达到最大。由图15可以看出，随着离子强度的增加，树脂的解吸附作用也呈增长的趋势，但是在0.4mol/L盐溶液浓度之后，增长趋势出现波动，因此采用0.4mol/L的NaCl溶液进行洗脱。从表16可以看出，洗脱液酸碱度对树脂的解吸附影响并不显著。但在洗脱液呈酸性的条件下，解吸附作用并无发生，在碱性条件下有一定的解吸附作用发生，但是变化规律不明显，说明pH值对解吸附的作用不显著。在进行蛋白质纤维素树脂洗脱时，建议在较温和的弱碱性条件下进行。

7.树脂动态解吸附及电泳分析

从图16洗脱曲线可以看出，洗脱峰明显，在洗脱溶液达到40mL左右时，就开始有蛋白质被洗脱下来，在洗脱溶液达到70mL左右时，蛋白质基本被洗脱下来，说明DEAE-Cellulose树脂对于此种盐溶性蛋白质具有很好的解吸附性，纯化效果显著，同时提高了回收率。

由电泳图谱图6-7可以看出，通过与沉淀得到的蛋白电泳图谱比较，可以看出经过离子交换色谱柱的蛋白质样品基本无背景，蛋白条带清晰，基本出现3到4种分子量不同的蛋白质。其中26KDa左右的条带模糊不清，颜色浅淡，说明此带蛋白含量较低，而在14.4～20.0KDa附近的3条蛋白带清晰，密度较高且无拖尾等现象，因此本实施例对这3个条带的蛋白进行进一步的分析研究。

结合图6和图7进行标准曲线的绘制，得到标准曲线方程Y＝6.9932X+14.4，R²＝0.8419，具有一定的线性相关性。通过marker回归方程，结合belt1、belt12、belt13在凝胶中所处的位置估算可得到3个蛋白的分子量大致为21.4KDa、17.9KDa、15.8KDa。

实施例7凝胶层析纯化

1.预处理：取5g葡聚糖凝胶(Sephadex)干粉，浸泡于50mL蒸馏水中充分溶胀(室温，12h)，然后反复倾斜除去表面的悬浮微粒，再于沸水浴中2～3h去除颗粒内部空气，蒸馏水浸泡过夜备用。

2.葡聚糖凝胶介质的选择

本实施例的蛋白质样品经过电泳分析主要由3种蛋白质组成，其分子量在10KDa～30KDa之间，因此选用Sephadex G-50和Sephadex G-75凝胶介质进行洗脱分离，旨在分离3种蛋白质。

分别装填以Sephadex G-50和Sephadex G-75葡聚糖凝胶为基质的层析柱，柱规格：200×20mm，高15cm。采用5.2.2节收集的蛋白质洗脱液上样50mL，蒸馏水洗脱，调节流速为1mL/min，以5mL为一个单位进行收集，在紫外280nm下进行吸收光检测，并绘制洗脱曲线。

3.纯化样品的测定

经过DEAE-纤维素树脂得到的洗脱液经过3000MW的聚砜膜，除去小分子杂质，得到的样品冷冻干燥即为纯化样品。固含的测定：取10mg纯化样品，加蒸馏水溶解于50mL容量瓶中混匀，直至沉淀完全溶解，加蒸馏水至刻度，摇匀。量取1mL溶解液于10mL容量瓶中，加入4mL考马斯亮蓝试剂G250，加蒸馏水至刻度，摇匀，参照考马斯亮蓝法在595nm处测其吸光值。另取一个10mL容量瓶加入4mL考马斯亮蓝试剂G250，加蒸馏水至刻度，摇匀，做空白试剂。样品固含：测定样品的吸光值为0.363，采用考马斯亮蓝法的标准曲线方程，计算蛋白质含量为0.0183mg/mL，还原稀释倍数后，得出10mg纯化样品中含有蛋白质6.28mg，固含为62.8％。

4.本实施例Sephadex G-50和Sephadex G-75凝胶G-75的凝胶动态洗脱曲线如图17-18。本实施例分离的3种目的蛋白的分子量十分接近，分别为21.4KDa、17.9KDa、15.8KDa。

5.样品氨基酸组成分析

样品经过酸水解，以17种氨基酸为标准对照，采用HPLC系统分析，样品中氨基酸组成如表2。纯化样品与原粉相比，氨基酸种类没有差异，除没有蛋氨酸，均含有16种氨基酸，但是样品加工不同，其中氨基酸组成相对比例发生了明显变化。从表2可以看出，经纯化后的蛋白质，赖氨酸(Lys)从1.25％提高至4.53％，丝氨酸(Ser)从1.83％提高至10.55％，组氨酸(His)从10.34％提高至44.24％，说明原料经过NaCl溶液提取和DEAE纤维素层析纯化，不仅明显提高总蛋白的含量，并且改变了蛋白质中氨基酸的相对组成，能明显的富集赖氨酸、丝氨酸和组氨酸。

Claims (13)

1.一种新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于新鲜白果经脱脂和减压沸腾提取，分离富集蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带。

2.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于蛋白belt1由分子量分别为m/z 1408.65、1663.94、1823.86、2064.99和2208.08五条肽段组成的球蛋白11S-globulin，通过NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到蛋白质gi/949869(legumin)，分子量为51418，等电点(pI)8.69。

3.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于蛋白belt2为新蛋白，由分子量m/z：2131和m/z：2338肽段组成，m/z：2131肽段的精确序列为I/L S A I/L T A DI/LG N W Q/K D S P GI/L R，m/z：2338肽段的精确序列为A A Q/K V D S S S D V Y A S D NI/L P G G N R。

4.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于蛋白belt3为分子量分别为1605、1913、2053、2242和2355五5个肽段组成，通过NCBI数据库进行同源性蛋白质分析，匹配到的蛋白是belt1蛋白和belt2蛋白混合物。

5.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于新型白果蛋白富含16种氨基酸，其中丙氨酸(Ala)、赖氨酸(Lys)和缬氨酸(Val)大于4.0％，天冬氨酸(Asp)大于6.5％，丝氨酸(Ser)大于10.5％，组氨酸(His)大于40.5％。

6.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于新鲜白果在-10℃至-50℃下冷冻干燥，除去外壳和内衣，将果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6％、粒度在10目-50目的白果粗粉。再用非极性溶剂与白果粗粉按质量比例4-30∶1(g/g)加入到脱脂釜萃取0.5～10小时，萃取温度-10℃至80℃，过滤，滤渣在室温通风下干燥，制备脱脂白果粉。

7.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于减压沸腾提取是将脱脂白果粉加入到0.1-0.50mol/L NaCl盐溶液减压沸腾提取5～30min，提取溶剂pH8-9，提取温度20℃-75℃，脱脂白果粉与提取剂质量体积比例为1∶3-1∶30(g/ml)，提取次数2-6次，合并提取液。

8.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于分离纯化是将盐溶液提取液经过40％-80％硫酸铵溶液两次沉淀，沉淀时间3-24h，pH 5-7，滤液经过不同孔径膜切割分离分子量10 000Da～30 000Da的蛋白质溶液，-10℃至-50℃下冷冻干燥制备高纯度白果蛋白粉。

9.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于分离纯化是采用DEAE-Cellulose树脂对白果蛋白粉进行纯化。白果蛋白粉与去离子水质量体积比例为1∶3-1∶50(g/ml)，用缓冲液pH 7.0-9.5的0.1-1.5mol/L NaCl溶液洗脱树脂，洗脱下来的蛋白质样品经过电泳分析，得到蛋白质样品由分子量为21.4KDa、17.9KDa和15.8KDa谱带组成。

10.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备和表征方法，其特征在于分离纯化是将DEAE-Cellulose树脂洗脱液经过葡聚糖凝胶G纯化，分离得到蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带。

11.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备方法，其特征在于新型白果蛋白采用电泳技术及MALDI-TOF-TOF质谱技术对纯化的蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三个蛋白带进行一级结构表征。

12.根据权利要求1所述新型白果蛋白的制备方法，其特征在于新型白果蛋白富含16种氨基酸，其中丙氨酸Ala、赖氨酸(Lys)和缬氨酸Val大于4.0％，天冬氨酸Asp大于6.5％，丝氨酸(Ser)大于10.5％，组氨酸(His)大于40.5％。

13.根据权利要求5所述非极性溶剂，其物征为正己烷、石油醚、6号溶剂油、丙酮等溶剂中一种或几种任意比例的混合溶剂。

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