CN104725474B

CN104725474B - 一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN104725474B
Application number: CN201510118248.2A
Authority: CN
Inventors: 吴倩倩; 王斌; 迟长凤; 邓尚贵; 孙坤来
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Hunan Tianjin Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2035-03-18
Also published as: CN104725474A

Abstract

本发明涉及一种利用风味蛋白酶和中性蛋白酶酶解金枪鱼肝脏蛋白制备钙螯合肽的方法，具体是以金枪鱼肝脏为原料，通过双酶酶解，超滤、大孔树脂柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到钙螯合肽Trp‑Asp‑Lys‑Glu‑Asn‑Gly‑Pro‑Asp，ESI/MS检测分子量为959.93 Da。钙螯合肽对钙螯合能力强，可同时补充多肽/氨基酸和钙，是一种理想的补钙物质。

Description

一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽及其制备方法和用途，属于功能多肽制备技术领域。

背景技术

钙是人体必需的元素，对血液凝结、神经传递、激素释放、乳汁分泌和肌肉收缩等方面均有影响。同时，钙也是人类骨、齿的主要无机成分，约占人体质量的1.4%，所以每天必须补钙以维护人体中钙的代谢平衡。但是，我国多数人群摄入乳制品的数量少，钙补充不足，特别是在老人和儿童中缺钙现象更是明显。因此，提高钙的摄入量及其在体内的吸收利用度对于钙的补充非常重要。在钙螯合肽中，钙元素嵌合在氨基酸或多肽中间，避免了钙离子与食物中的酸性物质（植物酸、草酸等）形成沉淀，同时也可以避免肠道碱性环境对于钙的影响，显著提高钙离子的溶解度和稳定性，提高其吸收利用率。因此，钙螯合肽生物利用率高、吸收快，是一种理想的钙补充剂。

金枪鱼是世界远洋渔业的重要鱼类，据国际粮农组织（FAO）渔业统计年鉴的数据，近5 年大洋金枪鱼世界年产量均在650 万吨以上。金枪鱼加工过程中，产生约占总重量8%的肝脏，未被有效利用。经检索，以金枪鱼肝脏蛋白制备钙螯合肽未见报道。基于此，本发明根据钙螯合肽和金枪鱼肝脏的利用现状，提供一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽，并提供这种钙螯合肽的制备方法。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽的制备方法。

本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列为Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp（WDKENGPD），ESI/MS检测分子量为959.93 Da。

本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）金枪鱼肝脏蛋白酶解液的制备：金枪鱼肝脏从冰冻金枪鱼鱼体中取出后，用高速组织捣碎机匀浆，并向匀浆中加入2~3 倍体积的磷酸盐缓冲液（pH 7.0、0.02 mol/L），加热至50～60℃，恒温搅拌25～30 min，然后按照肝脏湿重的0.5~1.0%向溶液中加入风味蛋白酶，酶解4~6 h，然后将温度升至55～65℃，按照肝脏湿重的0.8~1.2%向溶液中加入中性蛋白酶，酶解3~6 h后，9 000 r/min离心25～30 min，取上清液，即为金枪鱼肝脏蛋白酶解液。

2）金枪鱼肝脏钙螯合肽的的制备：将制备的金枪鱼肝脏蛋白酶解液采用5 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有15～20倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用5～8倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到金枪鱼肝脏钙螯合肽。

作为优选，所述步骤2）的凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：

凝胶柱层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为20~25 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据225 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Ca螯合活性的峰为凝胶层析酶解物；

RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对Ca的螯合活性得1个高Ca螯合活性多肽Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp（WDKENGPD）。

再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量20~25 μL；色谱柱为Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：30%乙腈；洗脱速度1.0~1.5 mL/min；紫外检测波长225 nm。

本发明基于多肽与金属离子螯合的理论基础，以及多肽-Ca螯合物的独特功效（可同时补充多肽/氨基酸和Ca），以金枪鱼肝脏为原材料，通过对风味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解条件控制，制备具有高Ca螯合活性的多肽。本发明即为补钙保健食品和药物开发提供了一种技术支持，同时也为金枪鱼内脏的高值化利用提供了一条新思路。

附图说明

图1是本发明的葡聚糖凝胶LH-20层析图。

图2是本发明的葡聚糖凝胶LH-20制备酶解物的RP-HPLC色谱图。

图3 是本发明的Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp（WDKENGPD）的质谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽的制备方法，制备工艺流程如下：金枪鱼肝脏"酶解"酶解物"超滤"大孔树脂纯化"凝胶过滤层析"RP-HPLC制备"钙螯合肽。

实施例：

1）金枪鱼肝脏蛋白酶解液的制备：金枪鱼肝脏从冰冻金枪鱼鱼体中取出后，用高速组织捣碎机匀浆，并向匀浆中加入3 倍体积的磷酸盐缓冲液（pH 7.0、0.02 mol/L），加热至55℃，恒温搅拌30 min，然后按照肝脏湿重的1.0%向溶液中加入风味蛋白酶，酶解5 h，然后将温度升至60℃，按照肝脏湿重的1.0%向溶液中加入中性蛋白酶，酶解6 h后，9 000 r/min离心25 min，取上清液，即为金枪鱼肝脏蛋白酶解液。

2）金枪鱼肝脏钙螯合肽的的制备：将制备的金枪鱼肝脏蛋白酶解液采用5 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有20倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到金枪鱼肝脏钙螯合肽。利用氨基酸序列分析仪和质谱测定其结构，具体过程为：

①凝胶柱层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据225 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Ca螯合活性的峰为凝胶层析酶解物（F3）（图1）；

②RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（条件：进样量20 μL；色谱柱为Kromasil C18（4.6 mm× 250 mm，5μm）；流动相：30%乙腈；洗脱速度：1.5 mL/min；紫外检测波长：225 nm），根据对Ca的螯合活性得1个高Ca螯合活性多肽（图2）。

③结构检测：Ca螯合肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp（WDKENGPD），ESI/MS检测分子量为959.93 Da（图3）。

金属螯合肽对钙离子螯合能力的测定采用邻-甲酚酞比色法。将1 mL的CaCl₂溶液（5 mmol/L）和2 mL的磷酸盐缓冲液（pH 8.0、0.2 mol/L）加入具塞试管中，再加入1 mL多肽溶液，置于恒温加热水浴摇床中37℃温育2h，取出后10000 r/min常温离心10 min。取1 mL上清液，加入邻-甲酚酞显色液5 mL，摇匀。放置10 min后于分光光度计570 nm处测定吸光值，将数值代入标准曲线中计算出可溶性钙结合量。

标准曲线的制作：分别取标准Ca工作液（10 μg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL试管中，分别加去离子水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，加入邻-甲酚酞显色液5 mL，摇匀，放置10 min 后于分光光度计570 nm处测定吸光值。以可溶性钙含量（μg/ mL）为横坐标，吸光值为纵坐标做图，得标准曲线公式为：y = 0.0837x-0.0383，R²= 0.9998。

测定结果表明：纯化得到的Ca螯合肽Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp（WDKENGPD）对钙离子的螯合能力为97.24 μg/mg多肽，与肝脏蛋白酶解产物（35.71 μg/mg多肽）相比其对Ca的螯合能力有了较大提高。

最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋学院

<120> 一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽及其制备方法和用途

<130> zjou-wb-201505

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Trp Asp Lys Glu Asn Gly Pro Asp

1 5

Claims

1.一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽，其特征在于该钙螯合肽的氨基酸序列为Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp，ESI/MS检测分子量为959.93Da。

2.一种权利要求1所述的一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）金枪鱼肝脏蛋白酶解液的制备：金枪鱼肝脏从冰冻金枪鱼鱼体中取出后，用高速组织捣碎机匀浆，并向匀浆中加入2~3倍体积的pH为7.0、浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，加热至50～60℃，恒温搅拌25～30min，然后按照肝脏湿重的0.5~1.0%向溶液中加入风味蛋白酶，酶解4~6h，然后将温度升至55～65℃，按照肝脏湿重的0.8~1.2%向溶液中加入中性蛋白酶，酶解3~6h后，9000r/min离心25～30min，取上清液，即为金枪鱼肝脏蛋白酶解液;

2）金枪鱼肝脏钙螯合肽的的制备：将制备的金枪鱼肝脏蛋白酶解液采用5kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有15～20倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用5～8倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得到金枪鱼肝脏钙螯合肽；

所述步骤2）的凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：凝胶柱层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为20~25mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Ca螯合活性的峰为凝胶层析酶解物；

RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（条件：进样量20~25μL；色谱柱为4.6mm×250mm，5μm的Kromasil C18；流动相：30%乙腈；洗脱速度1.0~1.5mL/min；紫外检测波长225nm），得到对钙离子的螯合能力为 97.24μg/mg的螯合肽Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp。

3.权利要求1所述的一种金枪鱼肝脏蛋白源钙螯合肽用于制备补钙药物和保健品中的用途。