CN103880920A - 一种金属螯合肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用复合蛋白酶及风味蛋白酶酶解乳清蛋白制备金属（Ca、Fe、Zn）螯合肽，以乳清蛋白为原料，通过复合蛋白酶及风味蛋白酶酶解，再经过分离纯化得到纯化的特异性金属（Ca、Fe、Zn）螯合肽，氨基酸序列为：fd。本发明制备的金属螯合肽可用于生产新型的金属补充剂—肽螯合钙、肽螯合铁、肽螯合锌，其具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和金属离子，必将成为钙、铁、锌补充剂的首选。本发明为乳清蛋白的应用提供了一条新思路。

Description

一种金属螯合肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种金属（Ca、Fe、Zn）螯合肽，更具体地涉及了一种利用复合蛋白酶和风味蛋白酶酶解乳清蛋白制备的金属螯合肽，属于生物技术领域。 

背景技术

随着乳源活性肽研究与产品开发的兴起，发现乳清蛋白中含有具有免疫调节、降血压、降血糖、降胆固醇、抗氧化、抗菌和抗病毒等生物活性的潜在肽段。乳清蛋白源生物活性肽具有极高的营养价值、食用安全性及生理保健功能，在促进机体的生长、发育和疾病防治等方面都起着重要的作用，可作为功能性食品或食品添加剂乃至药品应用到人们日常生活中。

目前，钙质缺乏是全球性的营养问题，我国人民由于以植物性膳食为主，缺钙的现象更加严重，因此补钙成为我国膳食营养研究中的重要课题。传统的无机钙盐，如碳酸钙、磷酸钙、氯化钙等，对维生素有一定破坏作用，生物学效价较低；有机钙盐，如柠檬酸钙、乳酸钙、葡萄糖钙等，虽然钙吸收率有所提高，但其溶解度大易溶失，且价格高。研究表明，多肽螯合钙由于其独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和钙，而成为补钙首选。

微量元素铁对人类健康特别是对婴幼儿和儿童的生长发育有重要作用。虽然大分子蛋白质也可以与铁离子结合，但这些大分子蛋白质本身也存在相对分子质量较大而很难通过肠黏膜的问题。而研究发现，氨基酸、多肽螯合铁可以大大提高铁离子的吸收率。

尽管自然界中锌源十分丰富，但锌在人体内的吸收代谢受种种因素的限制，锌缺乏已成为我国及许多发展中国家的公共卫生问题。研究发现氨基酸和小肽具有促进锌吸收的作用，而且氨基酸或肽的金属复合体如 Fe、Zn的生物学利用率比无机盐高且无毒副作用。因此，研究开发这种生物态锌———蛋白酶解物螯合锌，具有十分重要的意义。

因此，如何获得具有金属螯合活性的肽，就成为制备新型金属元素补充剂迫切的研究方向。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用复合蛋白酶及风味蛋白酶酶解乳清蛋白制备的金属螯合肽，使金属（Ca、Fe、Zn）螯合活性得以高效地实现。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种金属螯合肽，是由2个氨基酸所构成的二肽，所述肽的氨基酸序列为：fd。

所述的金属为Ca、Fe或Zn。

一种金属螯合肽的制备方法，以乳清蛋白为原料，采用复合蛋白酶及风味蛋白酶复配对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到金属螯合肽。

所述酶解条件为：底物浓度5%，酶解pH为7.0、温度49℃、酶解时间为7小时、酶-底物重量配比为1:25。

所述酶为复合蛋白酶和风味蛋白酶，两种酶的重量复配比为复合蛋白酶：风味蛋白酶= 2:1。

所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用TOYOPEARL DEAE-650M阴离子交换色谱进行分离，洗脱液为浓度梯度为含有0-0.5 M NaCl的0.02 mol/L pH 9.0的磷酸缓冲液，流速为0.5 mL/min，洗脱峰在214 nm下进行测量；收集具有最高金属螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3 mL/min，洗脱峰在214 nm下进行测定；收集具有最高金属螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用体积比0-30%乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4 mL/min，收集具有最高金属螯合活性的洗脱峰，再利用分析型RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，洗脱液为体积比0-10%乙腈溶液，流速为1 mL/min，收集洗脱峰，再采用LC/MS液质联用质谱仪分析得出洗脱峰处为所述金属螯合肽。

本发明立足于多肽具备与金属离子螯合的作用位点，能够与其形成稳定的化合物，且多肽-金属螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、可同时补充氨基酸和金属的理论基础，以来自于乳清的乳清蛋白为原材料，通过复合蛋白酶及风味蛋白酶的切割条件控制，切割制备具有高金属（Ca、Fe、Zn）螯合活性的肽，而使金属螯合活性得以高效地实现。本发明为乳清蛋白的应用提供了一条新思路。

附图说明

图1  纯化乳清蛋白源金属螯合肽的 LC/MS微阵列图。

具体实施方式

实施例1

本技术所采用的乳清蛋白（WPC 80），购买于HILMAR公司(美国·德克萨斯)，酶购自诺维信生物技术有限公司（中国·天津）。采用单因素实验，分别对四个酶解因素进行考察，分别为底物浓度（1%，3%，5%和7%）、酶解温度（40，50，55和60 ℃）、酶的复配比（复合蛋白酶：风味蛋白酶=1:1,1:2,1:3和2:1 w/w），酶-底物配比（1:100,1:50,1:25和1:20 w/w）以及酶解时间（1, 3, 5, 7, 9 小时）。称取一定质量乳清蛋白溶解于蒸馏水中，然后用2mol/L NaOH将其pH调节至7.0。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着再按不同的酶-底物配比加入相应量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再10000rpm离心10分钟。上清液收集后，分别对金属（Ca、Fe、Zn）螯合活性进行测定，以确定最佳酶解条件。得到具有最大金属螯合活性的酶解液的酶解条件是：底物浓度5%,酶解pH为7.0、温度49℃、酶解时间为7小时、酶-底物配比为1:25（w/w）；所述酶为复合蛋白酶和风味蛋白酶，两种酶的复配比为复合蛋白酶：风味蛋白酶= 2:1（w/w）。

称取5.0克乳清蛋白溶解于100ml 蒸馏水中，然后用2mol/L NaOH将其pH调节至7.0。先将该溶液水浴加热到49℃，接着再按照酶-底物配比为1:25的比例加入相应量的酶，复合蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为2:1，酶解时间为7小时。接着在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再10000rpm离心10分钟，收集上清液备用。

将上清液用TOYOPEARL DEAE-650M阴离子交换色谱（长50 cm，外径1.6cm）进行分离，洗脱液为浓度梯度0-0.5M的NaCl的0.02 mol/L pH 9.0的磷酸缓冲液，流速为0.5 mL/min，收集各峰样品并测定金属（Ca、Fe、Zn）螯合活性。

对TOYOPEARL DEAE-650M阴离子交换色谱分离的具有最高金属（Ca、Fe、Zn）螯合活性的洗脱峰再进行下一步的分离，用Sepadex G-25凝胶过滤色谱（长100 cm，外径2.0 cm）收集具有最高金属（Ca、Fe、Zn）螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，洗脱液自含100%（v/v）的水开始，至30%乙腈和70%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，洗脱时间为50 min，流速为4 mL/min，收集具有最高金属（Ca、Fe、Zn）螯合活性的峰即保留时间为20.681 min的洗脱峰,再利用分析型RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，洗脱液为0-10%（v/v）乙腈溶液，流速为1 mL/min，收集各峰进行金属（Ca、Fe、Zn）螯合活力测定，得到保留时间为21.627 min的洗脱峰具有最高金属（Ca、Fe、Zn）螯合活性，再采用LC/MS液质联用质谱仪分析得出保留时间为5.84 min处的峰为所述金属螯合肽。冷冻干燥得到本发明的金属（Ca、Fe、Zn）螯合肽。

采用邻-甲酚酞比色法，测定金属螯合肽对钙离子的螯合作用。将1 mL 5 mmol/L的CaCl₂和2 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 8.0）加入具塞试管中，再加入1 mL清蛋白肽溶液，置于恒温加热水浴摇床中37℃ 温育2h，取出后10000 r/min常温离心10 min。取1 mL上清液，加入邻-甲酚酞显色液5 mL，摇匀。放置10 min后于分光光度计570 nm处测定吸光值，将数值代入标准曲线中计算出可溶性钙结合量。

标准曲线的制作：分别取标准Ca工作液（10 ug/ mL）0，0.2，0.4，0.6，0.8， 1.0 mL于10 mL试管中，分别加去离子水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL，加入邻-甲酚酞显色液5 mL，摇匀，放置10 min后于分光光度计570 nm处测定吸光值。以可溶性钙含量（ug/ mL）为横坐标，吸光值为纵坐标做图，得标准曲线公式为：y = 0.0974x - 0.0402，R² = 0.9996。

本发明的制备金属螯合肽的铁螯合活性测定方法，采用邻菲罗啉比色法，测定金属螯合肽对铁离子的螯合作用。将0.05 g样品置于l00 mL烧杯中，加入2 mL浓盐酸，待样品完全溶解后，用蒸馏水定容至l00 mL容量瓶中。准确吸取5 mL样品液于50 mL容量瓶中，，加入l mol/L的HCl溶液1 mL，10%的盐酸羟胺l mL，0.12%邻菲罗啉1 mL，然后加入10%醋酸钠5 mL，用水稀释至刻度，摇匀。以不加铁的试剂空白溶液作参比液，在510 nm波长处测定吸光度，将数值代入标准曲线中计算出铁结合量。

标准曲线的制作：吸取10 ug/mL铁的标准溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加入l mol/L的HCl溶液1 mL，10%的盐酸羟胺l mL，0.12%邻菲罗啉1 mL，然后加入10%醋酸钠5 mL，用水稀释至刻度，摇匀。以不加铁的试剂空白溶液作参比液，在510 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，得标准曲线公式为：y = 0.1717x+0.003，R² = 0.9994。

本发明的制备金属螯合肽的锌螯合活性测定方法，采用EDTA滴定法，测定金属螯合肽对锌离子的螯合作用。称量螯合物100 mg于100 mL小烧杯中，加水50 mL，加入6 mol/L盐酸数滴。摇匀后于水浴上加热使之完全溶解，冷却后定容至l00 mL，从中吸取l0 mL于三角瓶，平3份，加入NH₃-NH₄CI缓冲液(pH l0)l0 mL，铬黑T指示剂适量，然后用0.0l mol/L Na₂EDTA液滴至蓝色；纪录消耗EDTA的毫升数，计算螯合物含锌量。

应用TOYOPEARL DEAE-650M阴离子交换色谱、Sephadex G-25分子筛、RP-HPLC反相高效液相色谱等分离纯化手段，实现显著活性的乳清蛋白金属螯合肽的高效分离纯化。

利用ESI质谱仪(WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS, Waters Co., U.S.A)测定特异性金属螯合肽的氨基酸全序列。

纯化得到的特异性金属螯合肽具有很高的金属（Ca、Fe、Zn）螯合活性，由表1可以看出，与酶解液相比，WPH-4的金属螯合力有了很大提高。

表1  纯化的特异性金属螯合肽的金属螯合力

对纯化的特异性金属螯合肽利用ESI质谱仪((WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS, Waters Co., U.S.A)测定特异性金属螯合肽的氨基酸序列。所述金属螯合肽的氨基酸序列为：fd。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

    SEQUENCE LISTING

 

<110>  福州大学

 

<120>  一种金属螯合肽的制备方法

 

<130>  1

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  2

<212>  PRT

<213>  金属螯合肽

 

<400>  1

 

Phe Asp

1      

 

 

 

Claims (6)

1.一种金属螯合肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为：fd。

2.根据权利要求1所述的一种金属螯合肽，其特征在于：所述的金属为Ca、Fe或Zn。

3.一种如权利要求1所述的一种金属螯合肽的制备方法，其特征在于：以乳清蛋白为原料，采用复合蛋白酶及风味蛋白酶复配对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到金属螯合肽。

4.根据权利要求3所述的一种金属螯合肽的制备方法，其特征在于：所述酶解条件为：底物浓度5%，酶解pH为7.0、温度49℃、酶解时间为7小时、酶-底物重量配比为1:25。

5.根据权利要求3所述的一种金属螯合肽的制备方法，其特征在于：所述酶为复合蛋白酶和风味蛋白酶，两种酶的重量复配比为复合蛋白酶：风味蛋白酶= 2:1。

6.根据权利要求3所述的一种金属螯合肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用TOYOPEARL DEAE-650M阴离子交换色谱进行分离，洗脱液为浓度梯度为含有0-0.5 M NaCl的0.02 mol/L pH 9.0的磷酸缓冲液，流速为0.5 mL/min，洗脱峰在214 nm下进行测量；收集具有最高金属螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3 mL/min，洗脱峰在214 nm下进行测定；收集具有最高金属螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用体积比0-30%乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4 mL/min，收集具有最高金属螯合活性的洗脱峰，再利用分析型RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，洗脱液为体积比0-10%乙腈溶液，流速为1 mL/min，收集洗脱峰，再采用LC/MS液质联用质谱仪分析得出洗脱峰处为所述金属螯合肽。

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