CN110627896B - 一种钙螯合肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种钙螯合肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种钙螯合肽及其制备方法和应用。所述钙螯合肽的氨基酸序列：FDHIVY。本发明提供的钙螯合肽安全无毒，与传统补钙剂相比具有更好的理化活性，其钙螯合能力达35.73mg/g；可在提高钙在人体中的吸收和生物利用率的同时，也可补充胶原蛋白肽，且可促进Caco‑2小肠上皮细胞中钙吸收和转运，用作药物开发以及生物补钙剂的原料。本发明提供的制备方法成功得到该钙螯合肽，可充分利用鱼产品资源，操作简单，为罗非鱼骨的高值化利用提供了新途径。

Description

一种钙螯合肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于功能性保健食品制备技术领域，具体涉及一种钙螯合肽及其制备方法和应用。
背景技术
钙元素是骨矿物质的主要成分，人体主要通过摄入食物来获取钙，经研究发现，由钙摄入不足引起的钙代谢失衡，是人类各年龄段人群所发生的多种疾病的诱因。目前，钙营养不足已经成为世界性的营养现象，成人的日常推荐钙摄入量一般为800mg/d，然而由于我国饮食结构问题，人民膳食钙的摄入量较为低下，远远达不到日常推荐摄入量的要求。
钙离子能够与肽形成具有环状结构的络合物，其稳定性较高，并能够使钙离子以螯合物形式被吸收利用，提高其生物利用率，同时也有利于钙离子的释放，是作为生物补钙剂的良好选择。我国海产资源丰富，如罗非鱼的产量和出口量均居世界前列，且由于产业结构的原因其加工利用率较为低下，加工过程中所产生的下脚料则是制备钙螯合肽的良好原料来源。钙螯合肽是利用无机钙离子与多肽在一定条件下反应制备所得，目前已有多种制备方法(高胜利等，1999)，如水体系合成法、干粉体系合成法、电解合成法(刘建睿等，1999)，其中又以水体系合成法应用最广泛，其优点有操作简便、设备简单、螯合率高、所得产物具有良好的水溶性，比较适用于广泛的工业化生产(梁汉萦，2007)。而对金属螯合肽的分离纯化方法有超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱等，通过各级分离纯化可以制备出最强活性的钙螯合肽单体。目前已有越来越多的工作者进行相关的从海产品下脚料中如鳕鱼、罗非鱼的骨和皮中提取胶原蛋白进行持钙活性的研究，并已取得了良好进展。
因此，从海产品下脚料中研究出具有高钙螯合活性的钙螯合肽具有重要的研究意义和经济价值。
发明内容
本发明的目的在于克服人体对钙元素的摄入量不足的缺陷或不足，提供一种钙螯合肽。本发明提供的钙螯合肽具有较好的钙螯合活性，其钙螯合能力达35.73mg/g，且可促进Caco-2细胞单层中钙转运，可用于制备补钙制剂或功能性饮料，满足人体对钙元素摄入量的需求。
本发明的另一目的在于提供上述钙螯合肽的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述钙螯合肽在制备补钙制剂或功能性饮料中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种钙螯合肽，所述钙螯合肽的氨基酸序列为：FDHIVY(Phe-Asp-His-Ile-Val-Tyr)。
本发明提供的钙螯合肽安全无毒，与传统补钙剂相比具有更好的理化活性，其钙螯合能力达35.73mg/g，且可促进Caco-2细胞单层中钙转运，可提高钙在人体中的吸收和生物利用率，用作药物开发以及生物补钙剂的原料。
优选地，所述钙螯合肽的分子量为793.3888Da。
上述钙螯合肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：将罗非鱼骨架进行酶解脱肉，碱洗脱脂，脱钙处理和酸处理后得到罗非鱼骨胶原蛋白；
S2：将S1所得罗非鱼骨胶原蛋白酶解后，灭酶，离心取上清液冻干；
S3：利用制备型反相高效液相色谱进行多级逐级分离纯化后，利用分析型高效液相分离即得到所述钙螯合肽。
本发明为以钙螯合活性为评价指标，采用制备型反相高效液相色谱和分析型高效液相色谱对罗非鱼骨胶原蛋白酶解产物进行分离纯化，即得到罗非鱼骨胶原蛋白源的钙螯合肽。
本发明提供的制备方法成功得到该钙螯合肽，可充分利用鱼产品资源，操作简单，为罗非鱼骨的高值化利用提供了新途径。
优选地，S1在酶解脱肉前还包括将罗非鱼骨架解冻，去除杂质，清洗干净，，及鱼骨架去头的步骤。
优选地，S1中所述酶解脱肉的过程为：将罗非鱼骨架切段，用中性蛋白酶酶解后，去除罗非鱼骨架上的碎肉。
更为优选地，S1中将罗非鱼骨架切成4～7cm的段状；所述中性蛋白酶酶解的时间为1～3h，温度为45～60℃，pH为7～8。
更为优选地，所述中性蛋白酶的质量浓度为5g/mL；中性蛋白酶和罗非鱼骨架的质量比为1:200；酶解的时间为2h，温度为55℃，pH为7.5。
酶解结束后洗去杂质。
优选地，S1中所述碱洗脱脂的过程为：利用无机碱性溶液清洗脱脂，然后清洗至中性。
更为优选地，所述无机碱性溶液为氢氧化钠溶液。
具体地，S1中所述碱洗脱脂的过程为：将鱼骨放入0.1mol/L NaOH溶液(w/v1:10)搅拌24h，清洗至中性。
优选地，S1中所述脱钙处理的过程为：将碱洗脱脂后罗非鱼骨置于EDTA-2Na溶液中，冷冻，搅拌，清洗至中性。
更为优选地，所述EDTA-2Na溶液的pH为7.2，所述罗非鱼骨和EDTA-2Na溶液的质量体积比为1:10。
具体地，脱钙处理的过程为：将鱼骨放入10％EDTA-2Na(pH7.2，w/v1:10)中，并置于4℃冷库中，期间进行搅拌处理5day，随后将鱼骨清洗至中性后待用。
优选地，S1中所述酸处理的过程为：脱钙后的鱼骨用酸性溶液处理后水洗至中性，即得到罗非鱼骨胶原蛋白。
更为优选地，所述酸性溶液为4％的盐酸溶液；所述酸处理的时间为18h。
优选地，S2中选用木瓜蛋白酶进行酶解；所述木瓜蛋白酶在酶解体系的质量分数为0.3～1％；所述酶解的时间为3～6h；所述酶解的温度为40～60℃；所述酶解的pH为6～7，。
更为优选地，所述木瓜蛋白酶在酶解体系的质量分数为1％；所述酶解的时间为5h；所述酶解的温度为60℃；所述酶解的pH为7.0，木瓜蛋白酶和罗非鱼骨胶原蛋白的酶底比1％。
优选地，S3中所述制备型高效液相色谱包括二级逐级分离纯化。
更为优选地，制备型高效液相色谱第一级分离的条件为：进样量为4000μL；色谱柱为C18色谱柱；流动相A为含有0.1％的TFA的水溶液，流动相B为含0.1％TFA的乙腈溶液；洗脱速度为10.0mL/min；紫外检测波长为双检测波长：214nm、280nm；洗脱条件为：0～10min：流动相B：6％～10％，10～60min：流动相B：28％，60～65min：流动相B：28％～90％，65～75min：流动相B：90％，75～80min，流动相B：90％～6％，80～90min：流动相B：6％。
更为优选地，制备型高效液相色谱第二级分离的条件为：进样量为1000μL；色谱柱为C18色谱柱；流动相A为含有0.1％的TFA的水溶液，流动相B为含0.1％TFA的乙腈溶液；洗脱速度为10.0mL/min；紫外检测波长为双检测波长：214nm、280nm；洗脱条件为：0～40min：流动相B：5％～25％，40～45min：流动相B：25％～90％，40～45min：流动相B：25％～90％，45～50min：流动相B：90％，50～55min，流动相B：90％～5％，55～65min：流动相B：5％。
优选地，S3中所述分析型高效液相分离的条件为：进样量为20μL；色谱柱为C18色谱柱；流动相A为含有0.1％的TFA的水溶液，流动相B为含0.1％TFA的乙腈溶液；洗脱速度为1.0mL/min；紫外检测波长为双检测波长：214nm、280nm；洗脱条件为：0～40min：流动相B：5％～25％，40～45min：流动相B：25％～90％，45～50min：流动相B：90％，50～55min：流动相B：5％。
上述钙螯合肽在制备补钙制剂或功能性饮料中的应用也在本发明的保护范围内。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的钙螯合肽在实验浓度下安全无毒，与传统补钙剂相比具有更好的理化活性，其钙螯合能力达35.73mg/g，且可促进Caco-2细胞单层中钙转运；可在提高钙在人体中的吸收和生物利用率的同时，也可补充胶原蛋白肽，用作药物开发以及生物补钙剂的原料。本发明提供的制备方法成功得到该钙螯合肽，可充分利用鱼产品资源，操作简单，为罗非鱼骨的高值化利用提供了新途径。
附图说明
图1为各酶解时间的钙螯合活性测定；
图2为制备型高效液相色谱第一次分离纯化的分离色谱图；
图3为第一次分离各峰段钙螯合活性；
图4为第二次分离制备的分离色谱图；
图5为C2组分第二次分离的7个组分螯合活性；
图6为分析型高效液相色谱单体制备的色谱；
图7为钙螯合肽的氨基酸序列；
图8为不同浓度的FDHIVY对细胞活力的影响；
图9为Caco-2细胞单层模型；
图10为FDHIVY对Caco-2细胞单层中钙转运的影响，其中a、b、c代表在给定时间点组间的显著差异(P<0.05)。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种钙螯合肽，其氨基酸序列为：FDHIVY(793.3888Da)。
该钙螯合肽可通过如下制备方法制备得到：
(一)罗非鱼骨胶原蛋白的提取
(1)罗非鱼骨架原材料的清洗
将鱼骨架解冻后，去除杂质并使用自来水清洗干净，后将鱼骨架去头。
(2)罗非鱼骨架的脱肉处理
将鱼骨架切成5cm左右，取1kg原料，加入5g中性蛋白酶和1000mL水，对鱼骨架进行酶解2h(55℃，pH 7.5)，以去除附于骨上的碎肉。酶解结束后洗去杂质。
(3)罗非鱼骨的碱洗脱脂
将鱼骨放入0.1mol/LNaOH溶液(w/v1:10)搅拌24h，清洗至中性。
(4)罗非鱼骨的脱钙处理
将鱼骨放入10％EDTA-2Na(pH7.2，w/v1:10)中，并置于4℃冷库中，期间进行搅拌处理5day，随后将鱼骨清洗至中性后待用。
(5)罗非鱼骨的酸处理
将脱钙后的鱼骨用质量分数4％的盐酸处理时间18h后水洗至中性，即得到罗非鱼骨胶原蛋白。
(二)骨胶原肽的选酶以及时间因素优化
(1)选酶
分别利用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶，在各自标注的最适pH、最适温度、酶底比1％、底物浓度6％下酶解3h，选取酶解效果最好、罗非鱼骨胶原钙螯合肽活性最高的酶进行时间因素优化。
不同酶的罗非鱼骨胶原钙螯合肽活性结果如下表1。
表1各酶的钙螯合活性测定
Figure BDA0002189173740000061
从表1分析可知，在罗非鱼骨胶原底物浓度为6％、各酶的酶底比为1.0％、酶解pH为7.0、酶解温度为60℃的条件下，经过木瓜蛋白酶酶解后的罗非鱼骨胶原钙螯合能力高于中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶，为10.960mg/g，所以选用木瓜蛋白酶作为工具酶。
(2)时间因素优化
利用木瓜蛋白酶分别在1h、2h、3h、4h、5h、6h时间条件下酶解提取出的鱼骨胶原蛋白，酶解条件为pH值7.0、温度60℃、酶底比1％、底物浓度6％。酶解后立刻在沸水中水浴10min灭酶，样品室温下放置30min冷却，随后在离心机中以4000r/min离心20min，所得上清液经冷冻干燥制得不同时间条件下的罗非鱼骨胶原肽冻干粉。
经钙螯合活性测定后，可选出所给定条件中钙螯合活性最优的酶解时间。实验结果如图1。
由图1分析可知：在罗非鱼骨胶原底物浓度为6％、木瓜蛋白酶底比为1.0％、酶解pH为7.0、酶解温度为60℃的条件下，随着酶解时间的延长，罗非鱼骨胶原钙螯合肽的活性也开始逐渐增强，在酶解4h时的酶解物与钙螯合的活性增强的趋势趋向于平缓，在酶解5h时达到了最高峰，在6h时钙螯合活性稍微开始下降。这可能是钙螯合反应中木瓜蛋白酶达到了饱和的缘故，所以酶解产物与钙螯合的活性不再增强。
所以，根据实验，在5h时获得的酶解产物与钙螯合的活性最高，罗非鱼骨胶原钙螯合肽的钙螯合浓度为0.01μg/mL，钙螯合能力为12.075mg/g。
各酶解时间分子量分布实验结果如表2所示。
表2各酶解时间分子量的结果
Figure BDA0002189173740000071
从表2分析可知，无论是酶解时间多长的时间，肽段的分子量主要分布在180-500Da的范围。在分子量为180-500Da以及500-1000Da的范围里，随着酶解时间的延长，从1h开始，分子的比例逐渐增多，在4h时到达了顶峰，在5h时稍有下降，在6h时保持与酶解5h时的相同的分子比例。这可能是由于酶解反应达到了饱和的缘故，所以在分子量为180-500Da以及500-1000Da的范围里面分子比例不再增加。此外，随着酶解时间从1h延长到5h，分子量>5000Da、分子量范围在3000-5000Da、分子量范围在2000-3000Da的分子的比例逐渐降低，6h时比例保持与5h相同，这是由于较大分子量的肽链逐渐酶解，分解为小分子量的肽链，而当酶解反应达到了饱和以后，较大分子量的比例则不再减少。
(三)罗非鱼骨钙螯合肽分离纯化
(1)制备型高效液相色谱仪器第一次分离
将上一步中得到钙螯合能力较好的组分冻干后，加一级水至其浓度为1.24g/20mL，用0.45μm微滤水膜过滤后，可进入高效液相进行分离，然后将分离所得的物质进行钙螯合活性测定，选出强螯合活性的部分。高效液相色谱制备条件为：
Figure BDA0002189173740000072
Figure BDA0002189173740000081
色谱图结果如图2。将酶解5h后所得的最高活性的罗非鱼骨胶原钙螯合肽，在制备型高效液相色谱钢柱中进行第一次分离，分离出C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8八个峰段。C1峰段为11～12.5min，C2峰段为12.5～16min，C3峰段为17～20min，C4峰段为21～22min，C5峰段为22～30min，C6峰段为20～38min，C7峰段为38～48min，C8峰段为48～60min。将以上制备所得的八个组分进行收集，旋转蒸发并冷冻干燥(得冻干粉)后，利用邻-甲酚酞比色法进行钙螯合活性测定，所得测定结果如图3所示。
具体地，邻-甲酚酞比色法进行钙螯合活性测定的具体过程为：
1.罗非鱼骨胶原钙螯合肽处理
往冻干粉样品中添加氯化钙溶液、磷酸盐缓冲液，终浓度分别为：待测样品浓度500mg/L，5mmol的氯化钙溶液和20mmol的磷酸钠缓冲液，pH7.8。混合液在37℃水浴120min，持续振荡。后混合液经4000r/min离心20min，取上清液待用。不添加样品组作为空白对照组。
2.罗非鱼骨胶原钙螯合肽活性检测，利用邻-甲酚酞比色法进行测定。
2.1邻-甲酚酞比色法试剂配制
2.1.1贮备乙醇胺-硼酸盐缓冲液：
称取3.6g硼酸于100mL容量瓶中，加蒸馏水10mL，乙醇胺10mL，摇晃至硼酸完全溶解，用乙醇胺定容至100mL。
2.1.2贮备邻-甲酚酞溶液：
称取80.0mg邻-甲酚酞络合剂于100mL于棕色容量瓶中，加25mL蒸馏水和0.5mL1mol氢氧化钾溶液，摇晃至完全溶解。用75mL蒸馏水定容，加0.5mL冰乙酸，摇匀。
2.1.3贮备8-羟基喹啉溶液：
称取5.0g的8-羟基喹啉于100mL棕色容量瓶中，用95％乙醇溶解，定容。
2.1.4贮备钙标准液(1000μg/mL)：
称取碳酸钙(分析纯)约2g于坩埚中，105℃烘4h，取出放入干燥器中冷却至室温，称取0.1g于100mL容量瓶中，加以0.5N HCl 5mL，蒸馏水定容，摇匀。
2.1.5 0.5N HCl：
取浓HCl(分析纯)43mL于1L容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀。
2.1.6标准钙工作液(100μg/mL)：
吸取10mL贮备钙标准液于100mL容量瓶中，用一级水定容。
2.1.7工作显色液：
吸取6mL贮备乙醇胺-硼酸盐缓冲液，1.8mL的8-羟基喹啉贮备液，6mL邻-甲酚酞溶液于100mL容量瓶中，用一级水定容到100mL。
2.1.8 0.2mol/L磷酸缓冲液配制：
取0.2mol/L磷酸氢二钠91.5mL(17.907g样品溶解定容至250mL)与0.2mol/L磷酸二氢钠8.5mL(取0.78g样品溶解定容至25mL)混合
2.2.活性测定
本实验利用邻-甲酚酞比色法进行对钙活性的测定。
分别取标准钙工作液(10μg/mL)0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于10mL试管中，分别加一级水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0mL，再加工作显色液5mL，摇匀，于570nm处0～15min内比色，作为标准线。样品测定时以0.2～1.0mL样液按上述方法进行，取样不足1mL时用一级水补到1mL。骨胶原钙螯合率和螯合能力计算公式如下：
Figure BDA0002189173740000091
得出标准曲线为y＝ax+b
Figure BDA0002189173740000092
Figure BDA0002189173740000101
由图3分析可得，C2具有较高的钙螯合能力，这说明C2组分中所含的肽段钙活性较高，其是在出峰时间为12.5～16min分离出来，乙腈浓度约为28％～32％，因而接取C2峰段的样品进行冷冻贮藏，以备进一步的第二次分离纯化。根据实验结果，C2峰段的样品的钙螯合能力为26.929mg/g。
(2)制备型高效液相色谱仪器第二次分离
将制备型高效液相色谱仪器第一次分离中得到的钙螯合能力更好的组分冷冻贮藏后，进行第二次的高效液相分离，并将收集所得的物质进行钙螯合活性测定，分离出活性最强的组分。高效液相色谱分析条件为：
Figure BDA0002189173740000102
色谱图如图4。由图可知，将第一次制备分离时所接取的C2组分在制备型高效液相色谱上进行第二次分离，分离出C2-1、C2-2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6及C2-7七个峰，七个峰的出峰时间分别为14～15min、16.5～17.2min、19.9～21min、22～23min、23.5～24.5min、25～27.5min、31.5～33min。将第二次制备液相所得的七个组分接取，进行旋转蒸发并冷冻干燥(得冻干粉)后，利用邻-甲酚酞比色法进行钙活性测定，所得测定结果如图5所示。
由图5分析可得，C2-7具有较高的钙螯合率，说明在C2-7组分中的链段具有较高的钙活性，其出峰时间为31.5～33min、分离出来时的乙腈浓度约为20％。C2-7峰的钙浓度为0.036μg/mL，钙螯合能力为43.018mg/g。接取C2-7峰并进行冷冻贮藏，以备在分析型高效液相色谱仪器上进一步纯化。
(3)分析型高效液相分离纯化活性组分
从钢柱中分离出最佳钙螯合活性组分后，利用分析型高效液相进行鉴定及纯化。分析型高效液相分析条件为：
Figure BDA0002189173740000111
色谱图如图6所示。从图6分析可知，在分析型高效液相色谱上制备出一个峰，对此单峰进行收集和冷冻贮藏，准备其进一步的活性测定和结构分析。其出峰时间为10.4～10.8min，乙腈浓度约为20％～20.5％。
(4)罗非鱼骨胶原钙螯合肽活性综合结果分析
由各阶段实验，所得数据如表3所示。
表3罗非鱼骨胶原钙螯合肽活性综合结果
Figure BDA0002189173740000112
从表3分析可知，通过四个阶段的实验，罗非鱼骨胶原钙螯合肽的钙螯合能力经过选取工具酶、时间因素优化以及两次制备型高效液相色谱的分离纯化以后逐渐增强，且每次增强的幅度越来越大。这是由于酶解条件优化以及分离纯化使活性组分得到增强的结果。
(5)罗非鱼骨胶原钙螯合肽序列鉴定
用HPLC-MS/MS法对C2-7样品中的罗非鱼骨胶原钙螯合肽的氨基酸序列进行测定，其氨基酸序列为FDHIVY(793.3888Da)，如图7。
实施例2
本实施例对钙螯合肽的钙螯合能力及其对Caco-2细胞单层钙转运的影响进行了研究，具体过程如下。
(1)肽合成
从Synpeptide Co.，Ltd(南京，中国)获得纯度高于95％的合成肽(FDHIVY)，并通过LC/ESI-MS测定它们的分子量，其分子量为793.3888Da。
如表4为钙螯合肽的同源蛋白质。
表4钙螯合肽的同源组织及蛋白
Figure BDA0002189173740000121
通过使用邻甲酚酞比色法测定合成肽的钙螯合活性。如图8，FDHIVY的钙螯合活性为35.73mg/g，表明序列较短的肽FDHIVY具有较多的钙螯合位点。
有趣的是，发现一些对钙具有高亲和力的肽序列与FDHIVY相似，例如来自乳清蛋白的FD，来自小麦胚芽蛋白FVDVT和来自Schizochytrium sp的FY。
有许多因素会影响生物活性肽的钙螯合活性。肽的组成和序列在钙螯合活性中起重要作用.除酪蛋白磷酸肽的“Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu”外，最可能的钙螯合位点是Asp(D)和Glu(Q)的羧基.此外，肽中的碱性氨基酸如His(H)和Lys(K)的存在对钙的螯合有很大帮助。有许多关于含有His钙螯合肽中存在的报道，例如从虾副产物中分离的Thr-Cys-His，Trp-Glu-Trp来自罗非鱼肌肉的-Leu-His-Tyr-Trp和来自蛋白肽的Asp-His-Thr-Lys-Glu.从太平洋鳕鱼骨中分离出的许多钙螯合肽在序列末端含有Lys。此外，还报道了Lys残基与Glu相互作用形成盐桥(Glu-Lys)以中和过量电荷以稳定蛋白质结构。
结果表明，Asp、Glu、His、Lys可能是导致肽螯合钙能力的氨基酸。
(2)细胞培养
Caco-2细胞购自American Type Culture Collection(Rockville,MD,USA)。实验采用40～44代的Caco-2细胞。细胞在完全培养基中培养(EMEM中添加10％胎牛血清，1％非必需氨基酸，1％双抗)。
当细胞长到在90％汇合时，用胰蛋白酶-EDTA处理分离Caco-2细胞，并在具有聚酯膜(直径24mm)的6孔transwell培养板(3450，Corning Inc，USA)上以3×105细胞/mL的密度接种。每隔一天更换顶端和基底外侧的培养基，培养21天。通过使用电阻装置(Millicell-ERS，Millipore Corp)测量跨上皮电阻(TEER)来确认Caco-2细胞单层的完整性，并且使用TEER高于300Ω/cm2的单层进行转运分析。
(3)细胞的毒性试验
不同浓度FDHIVY的细胞毒性试验通过MTT法进行监测。将Caco-2细胞以5×104个细胞/孔的密度种植在96孔板(Costar，Corning，NY)中，并放在5％CO2培养箱中于37℃温育24小时。随后，用具有不同浓度(25～1000μg/mL)的肽(FDHIVY)的100μL培养基处理细胞，并孵育24小时。孵育后，通过100μL的0.5mg/mL MTT溶液杀死细胞2小时。然后，用100μL二甲基亚砜代替MTT溶液。将96孔板置于振荡器上15分钟。最后，使用分光光度计(Enspire XenonLight Module，Perkin-Elmer，Beaconsfield，U.K。)在570nm的波长下测量光吸收值。与对照组相比，吸光度降低10％以上的样品浓度被认为是有细胞毒性的。
如图8所示，在浓度范围为25至500μg/mL时，FDHIVY对细胞活力没有负面影响。
(4)钙在Caco-2细胞单层中的转运研究
将分化的Caco-2细胞单层用预热的HBSS轻轻洗涤两次，并转移到含有2mL HBSS的新6孔板中，并在顶侧加入2mL HBSS。将Caco-2细胞单层放在37℃，5％CO2的培养箱中温育30分钟。随后，将2mL含有150μg/mL肽(FDHIVY)和150μg/mL钙的HBSS加入到顶侧。(如图9所示)而对照组仅添加2mL含钙150μg/mL的HBSS。在不同的时间间隔(30，60，120和180分钟)，从基底外侧收集1mL HBSS以确定钙含量，并立即将1mL HBSS加入基底外侧以保持体积不变。用原子吸收光谱法测量钙含量。
图10显示了FDHIVY对Caco-2细胞单层中钙转运的影响。在180分钟内，钙的吸收呈时间依赖性增加。在FDHIVY存在下，与对照组相比，30min时钙的转运量增加了202％。随着转运时间的增加。
由上述可知，本发明提供的钙螯合肽安全无毒，与传统补钙剂相比具有更好的理化活性，其钙螯合能力达35.73mg/g，且可促进Caco-2细胞单层中钙转运；可在提高钙在人体中的吸收和生物利用率的同时，也可补充胶原蛋白肽，用作药物开发以及生物补钙剂的原料。
最后应当指出的是，以上实施例仅是本发明的具有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明内容直接导出或联想到所有变形，均应认为是本发明的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种钙螯合肽及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 1
<400> 1
Phe Asp His Ile Val Tyr
1 5

Claims (3)

1.一种钙螯合肽，其特征在于，所述钙螯合肽的氨基酸序列为：FDHIVY。
2.根据权利要求1所述钙螯合肽，其特征在于，所述钙螯合肽的分子量为793.3888 Da。
3.权利要求1~2任一所述钙螯合肽在制备补钙制剂或功能性饮料中的应用。
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