CN112625088A - 一种贻贝ace抑制肽的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种贻贝ACE抑制肽的制备方法及应用；该方法包括：以贻贝蒸煮液为原料，经模拟酶切活性肽，酶解分离纯化，多肽鉴定，活性研究，最终确定活性高的ACE抑制肽。本发明以紫贻贝为原料，成本低；本发明采用酶解法提取活性多肽，通过体外试验进行筛选，质谱进行鉴定多肽的氨基酸序列，并对其活性机制进行探讨，最后在食品体系中进行应用，本发明方法相比于化学合成、直接提取和基因工程等方法，具有成本低，安全性能高，无毒副作用等优点。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术应用领域；尤其涉及一种贻贝ACE抑制肽的制备方法及应用。
背景技术
贻贝属于软体动物门，瓣鳃纲，异柱目，贻贝族，贻贝科，俗称“海红”、“淡菜”等，其肉质鲜美，营养丰富，素有“海中鸡蛋”的美称，粗蛋白含量较高且氨基酸种类较齐全，在我国山东、浙江、辽宁和福建等沿海省份养殖海域广阔。我国贻贝生产数量达80多万吨。贻贝干品蛋白含量在60%左右，经济价值很高，也有一定的药用价值。贻贝大都以干制品等形式存在，但其蒸煮液并没有得到充分的利用，造成了资源浪费。
目前的研究中，关于贻贝蛋白的组成、含量等没有确切的报道，贻贝蛋白中各种组分的氨基酸序列报道不充分。这对于贻贝活性肽的深入研究，具有一定的限制。这种限制主要表现在以下方面：
贻贝中含有不同种类的蛋白质，是通过生物酶解法获得生物活性肽的良好蛋白质来源。然而由于体系的复杂程度较大，对于进行定向酶切技术的应用具有一定的限制。因此，通过选取具体的蛋白体系进行研究，进一步明确和简化了研究的对象，一定程度上减少体系的复杂程度，对于后期实验操作有所帮助。
高血压是因为动脉血压持续过高而引起中风，冠心病，血管瘤，动脉粥样硬化等一类疾病，被认定为生命“第一杀手”。血管紧张素转化酶（Angiotensin convert enzyme，ACE）在生物体内具有调节血压的功能，是一种含Zn2+辅基的二肽羧肽酶，在肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统中可催化无活性的血管紧张素Ⅰ转化为具有收缩血管作用的血管紧张素Ⅱ，促使血压升高，因此可以通过抑制ACE的活性，预防和治疗高血压等相关疾病。目前，市面上常见的降血压药物，如卡托普利，依那普利，阿拉普利等，均具有ACE抑制作用，虽然药效明显，但由于其为化学合成药物，存在一定的副作用，如过敏反应，皮肤皮疹，咳嗽等，因此研究者不断探索其具有ACE抑制活性的天然成分，作为合成药物的替代品。
血管紧张素转化酶抑制剂（Angiotensin convert enzyme peptides，ACE抑制肽）是一类具有ACE抑制活性的多肽物质，大多由2-12个氨基酸组成，极个别由更多个氨基酸组成。目前已经从植物（谷类、豆类、水果等），陆生动物（牛、猪等）和海洋动物（牡蛎、扇贝、文蛤等）中得到活性肽。其中海洋生物因特殊的生活环境，导致其蛋白质结构组成及氨基酸序列异于陆地生物，因此许多研究学者对海洋生物中的贝类蛋白进行开发，以获得高效安全的ACE抑制肽。制备ACE抑制肽最常用的方法是酶解法，相比于化学合成、直接提取和基因工程等方法，具有成本低，安全性能高，无毒副作用等优点。
结合近年来海洋生物应用于食品或保健食品领域的研究和应用日渐增多的背景，如作为牡蛎肽，海参肽等，有条件也有研究依据进一步开发贻贝作为食品或保健食品方面资源。因为产品加工单一，贻贝中蛋白质资源浪费较为严重，所以贻贝资源的综合利用已经成为制约我国贻贝产业发展的重要方面，因此，探寻贻贝的开发及应用技术具有极其重要的商业意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种贻贝ACE抑制肽的制备方法及应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明以紫贻贝为原料，采用酶解法提取活性多肽，通过体外试验进行筛选，质谱进行鉴定多肽的氨基酸序列，并对其活性机制进行探讨，最后在食品体系中进行应用。
本发明所涉及的一种贻贝ACE抑制肽的制备方法，具体按照下述步骤进行：
步骤1，准备实验原料：
清洗鲜活紫贻贝，蒸煮后得到贻贝蒸煮液，喷雾干燥可得到贻贝粉。
步骤2，选取优质蛋白：以肌动蛋白作为研究对象蛋白进行虚拟酶解制备活性多肽。
步骤3，虚拟酶解制备贻贝粗肽：
从 NCBI 蛋白质数据库（http://www.ncbi.nlm.nim.gov）中获得贻贝肌动蛋白氨基酸序列（AAD48064.1和BAF34907.1）借助PeptideCutter在线虚拟酶切工具（https://web.expasy.org/peptide_cutter/），对贻贝肌动蛋白进行酶切，得到不同种类的多肽序列。将酶切后产生的肽序列与BIOPEP和AHTPDB数据库中已知的ACE抑制肽进行比较，筛选获得未经过报道的活性肽，最后使用在线工具PeptideRanker（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/） 对肽的生物活性进行预测；
评定标准：评分高于0.5分被标记为具有生物活性，用于下一步研究。
步骤4，贻贝蛋白酶解
采用胰蛋白酶和胃蛋白酶分别在不同的酶解条件下（温度、时间、pH、料液比、酶活）制备得到不同的贻贝酶解多肽溶液。
具体酶解条件如下：胰蛋白酶，温度：40～50℃、酶解时间：30 min～90 min、pH：6.5～8.5、料液比：1:5（g/mL）～1:20（g/mL）、酶活：2000～5000 U；胃蛋白酶，温度：35～40℃、酶解时间：30 min～90 min、pH：1.5～5.0、料液比：1:5（g/mL）～1:20（g/mL）、酶活：2000～5000 U；采用单因素法，控制单一条件，探讨该条件对酶解多肽的影响。比如探讨料液比对酶解多肽的影响时，将不同料液比的贻贝蛋白水溶液用适当的氢氧化钠溶液或者盐酸溶液调节pH值，放置恒温水浴锅中，先加入一定酶活的胰蛋白酶进行酶解，酶解完成后，改变酶解条件，适宜条件下胃蛋白酶继续酶解，得到不同料液比条件下的酶解多肽溶液，最终获得10类酶解条件下的酶解多肽溶液。
所有条件下的酶解多肽溶液沸水浴5-15 min，冷却至室温，进行离心，转速为5000-8000 rpm/min，时间为5-15 min，取上清液，通过质谱测定目标多肽序列，最终确定最佳酶解条件，并测定酶解液分子量分布。
步骤5，分离纯化活性肽
制得的粗肽溶液用1kDa的超滤膜超滤，除去大分子蛋白，获得小分子量范围的多肽混合溶液，用反向液相色谱进行分离纯化得到较纯的ACE抑制肽，真空冷冻干燥，最大限度保留活性，测定ACE抑制肽体外活性。
步骤6，SHR高血压大鼠模型活性验证
选取SHR大鼠为模型，通过测定大鼠血压生理变化，从而对ACE抑制活性肽进行体内活性评价。
步骤7，ACE抑制肽结构特征和理论性质
肽 GIL和AGR分别与已经报道的活性肽YYAPFDGIL、GILRP和RNEQMGAGRLGRLRK、IAGRP、VSGAGRY具有相同的结构基团，可能具有一定的相关性。已研究表明N端疏水性和疏水性氨基酸的比例对活性有影响，肽GIL疏水性氨基酸占比2/3，比例很高，肽AGR疏水性氨基酸占比1/3，N端Ala为疏水性氨基酸，同时C端Arg为带正电荷氨基酸残基，能够提高ACE抑制活性。
步骤8，食品应用
征集患有高血压志愿者100名，分为两组，一组正常吃药控制，另一组正常吃药结合活性肽粉，经过一段时间测定志愿者的血压稳定情况，结果表明试验组明显比对照组血压更加稳定。
本发明所涉及的贻贝ACE抑制肽的制备方法，以贻贝蒸煮液为原料，模拟酶切活性肽，酶解分离纯化，多肽鉴定，活性研究，最终确定活性高的ACE抑制肽，应用于食品领域。
本发明所涉及的贻贝ACE抑制肽为三肽，其氨基酸序列为：GIL（Gly-Ile-Leu）和AGR(Ala-Gly-Arg)；本发明所涉及的贻贝ACE抑制肽 GIL和AGR分子量分别为301.4Da和302.3Da；本发明所涉及的贻贝ACE抑制肽 GIL和AGR的IC 50值分别为25.61±2.10 μmol/L和20.45±2.15 μmol/L。
本发明具有以下优点：
（1）本发明以紫贻贝为原料，成本低；
（2）本发明采用酶解法提取活性多肽，通过体外试验进行筛选，质谱进行鉴定多肽的氨基酸序列，并对其活性机制进行探讨，最后在食品体系中进行应用，本发明方法相比于化学合成、直接提取和基因工程等方法，具有成本低，安全性能高，无毒副作用等优点。
附图说明
图1是贻贝蒸煮液蛋白质分布图；
图2是最佳酶解条件下分子量分布特点图；
图3是本发明制备原理图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例
本实施例涉及一种贻贝ACE抑制肽的制备方法，如图3所示：按照下述步骤进行：
步骤1，准备实验原料：
清洗鲜活紫贻贝，蒸煮后得到贻贝蒸煮液，喷雾干燥可得到贻贝粉。
步骤2，选取优质蛋白：贻贝蒸煮液SDS-PAGE
由图1所示，贻贝蒸煮液中43 kDa肌动蛋白较为丰富，所以以肌动蛋白作为研究对象蛋白进行虚拟酶解制备活性多肽。
步骤3，虚拟酶解制备贻贝粗肽：
从 NCBI 蛋白质数据库（http://www.ncbi.nlm.nim.gov）中获得贻贝肌动蛋白氨基酸序列（AAD48064.1和BAF34907.1）借助PeptideCutter在线虚拟酶切工具（https://web.expasy.org/peptide_cutter/），对贻贝肌动蛋白进行酶切，得到不同种类的多肽序列。将酶切后产生的肽序列与BIOPEP和AHTPDB数据库中已知的ACE抑制肽进行比较，筛选获得未经过报道的活性肽，最后使用在线工具PeptideRanker（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/） 对肽的生物活性进行预测；
评定标准：平分高于0.5分被标记为具有生物活性，用于下一步研究。
获得的预测活性多肽分别为：FR、FQPSF、SGGTTMF、YSVWIGG、GIL、LR 、AGR，其中FR、FQPSF、LR是已经报道过的ACE抑制活性肽，其他四个为未报道的多肽。
步骤4，贻贝蛋白酶解
上述所有条件下的酶解多肽溶液沸水浴5-15 min，冷却至室温，进行离心，转速为5000-8000 rpm/min，时间为5-15 min，取上清液，通过质谱测定目标多肽序列，最终确定最佳酶解条件，并测定酶解液分子量分布。
由图2所示，最佳酶解条件下90%以上都集中在200Da-1000Da分子量水平，酶解较为充分，符合活性肽分子量分布特点，同时质谱也鉴定到了生物活性肽：FR、FQPSF、SGGTTMF、YSVWIGG、GIL、LR 、AGR等，预测符合预期结果。
步骤5，分离纯化活性肽
制得的粗肽溶液用1kDa的超滤膜超滤，除去大分子蛋白，获得小分子量范围的多肽混合溶液，用反向液相色谱进行分离纯化得到较纯的ACE抑制肽，真空冷冻干燥，最大限度保留活性，测定ACE抑制肽体外活性。
结果表明：活性肽GIL和AGR具有较高的ACE抑制活性，其IC50值分别为25.61±2.10μmol/L和20.45±1.22 μmol/L，具有较高的ACE抑制活性，同时分离纯化的活性肽 GIL和AGR的纯度均在80%以上。
步骤6，SHR高血压大鼠模型活性验证
选取SHR大鼠为模型，通过测定大鼠血压生理变化，从而对ACE抑制活性肽进行体内活性评价。
结果表明6小时后血压值就开始改善，长期灌胃条件下肽GIL和AGR能够明显改善血压值30%-40%，与对照基本相当。
步骤7，ACE抑制肽结构特征和理论性质
肽 GIL和AGR分别与已经报道的活性肽YYAPFDGIL、GILRP和RNEQMGAGRLGRLRK、IAGRP、VSGAGRY具有相同的结构基团，可能具有一定的相关性。已研究表明N端疏水性和疏水性氨基酸的比例对活性有影响，肽GIL疏水性氨基酸占比2/3，比例很高，肽AGR疏水性氨基酸占比1/3，N端Ala为疏水性氨基酸，同时C端Arg为带正电荷氨基酸残基，能够提高ACE抑制活性。研究表明，分子量较小的三肽更容易穿过细胞膜并穿过肠道屏障进入血液并发挥ACE抑制作用，肽 GIL和AGR均为三肽，容易吸收发挥作用。
本实施例涉及的贻贝ACE抑制肽为三肽，其氨基酸序列为：GIL（Gly-Ile-Leu）和AGR(Ala-Gly-Arg)；本发明所涉及的贻贝ACE抑制肽 GIL和AGR分子量分别为301.4Da和302.3Da；本发明所涉及的贻贝ACE抑制肽 GIL和AGR的IC50值分别为25.61±2.10 μmol/L和20.45±2.15 μmol/L。
步骤8，食品应用
征集患有高血压志愿者100名，分为两组，一组正常吃药控制，另一组正常吃药结合活性肽粉，经过一段时间测定志愿者的血压稳定情况，结果表明试验组明显比对照组血压更加稳定。
本发明所涉及的贻贝ACE抑制肽的制备方法，以贻贝蒸煮液为原料，模拟酶切活性肽，酶解分离纯化，多肽鉴定，活性研究，最终确定活性高的ACE抑制肽，应用于食品领域。
本实施例涉及相关测定的方法具体如下：
（1）蛋白质含量的测定
采用凯氏定氮法，称取充分混匀的样品0.2-2 g，精确至0.001 g移入干燥的100ml、250 ml或者500 ml定氮瓶中，加入0.4 g硫酸铜，6 g硫酸钾及20 ml硫酸，放入消化炉中进行消化，当消化炉温度达到420℃之后，继续消化1 h，此时消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却后加入50 ml水，于自动凯氏定氮仪上实现自动加液，蒸馏、滴定和记录滴定数据的过程。
（2）贻贝蒸煮液蛋白质分布
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）测定蛋白质分子质量分布。
（3）多肽溶液分子量分布测定
参考标准《GB/T22729-2008 海洋低聚肽》中凝胶过滤色谱法。采用的分离柱为TSKGel G2000SWXL 300 mm*7.8 mm，流动相为乙腈:水：三氟乙酸=45:55:0.1（体积比），流速为0.5 mL/min，检测波长为220 nm。采用标准品分别为细胞色素C(M，12500)，抑肽酶(M，6500)，杆菌酶(M，1450)，乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(M，451)，乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(M，189)。
（4）酶解多肽体外活性测定
取50 μL 5 mmol/L马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)与20 μL的样品混合，于37℃恒温水浴5 min，加入20 μL 0.1U/mL ACE溶液，充分混合，37℃恒温水浴60 min后，反应分解产生马尿酸，加入20 μL 2 mol/L HCL溶液终止反应，离心取上清液，加入进样瓶中，波长228nm处进行检测。样品用pH 8.3含0.3 mol/L NaCl的硼酸盐缓冲溶液配制成6种不同的质量浓度，测定活性半抑制率浓度（即IC50），空白为硼酸缓冲溶液，绘制浓度-抑制率浓度，得到回收方程，通过曲线方程计算抑制率为50%时所对应的浓度值，即IC50值。
ACE抑制率（%）=(空白组马尿酸峰面积-样品组马尿酸峰面积)/空白组马尿酸峰面积×100
（5）分离纯化多肽
流动相为0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸乙腈，柱子为C18柱，流速为0.3mL/min，通过梯度洗脱方式在反向HPLC模式下进行分离，接收的多肽分离溶液用真空冷冻干燥技术得到纯化的冻干粉。
（6）多肽动物实验活性研究
所有试验大鼠均采用经口灌胃方式，每天定时定量，活性肽及对照物（卡托普利）采用0.9%生理盐水配制成不同的浓度溶液，将编好号的SHR大鼠尾端插入加压感应器中，自动测量血压值，分别观察灌胃后不同时间（2、4、6、8、10、12、24h）和不同天数（1、2、3、4、5、6、7、14、21）的血压值，统计分析。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明以紫贻贝为原料，成本低；本发明采用酶解法提取活性多肽，通过体外试验进行筛选，质谱进行鉴定多肽的氨基酸序列，并对其活性机制进行探讨，最后在食品体系中进行应用，本发明方法相比于化学合成、直接提取和基因工程等方法，具有成本低，安全性能高，无毒副作用等优点。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。
Claims (2)
1.一种贻贝ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，该方法包括：以贻贝蒸煮液为原料，经模拟酶切活性肽，酶解分离纯化，多肽鉴定，活性研究，最终确定活性高的ACE抑制肽。
2.如权利要求1所述的贻贝ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1，准备实验原料：清洗鲜活紫贻贝，蒸煮后得到贻贝蒸煮液，喷雾干燥可得到贻贝粉；
步骤2，选取优质蛋白：以肌动蛋白作为研究对象进行虚拟酶解制备活性多肽；
步骤3，虚拟酶解制备贻贝粗肽：对贻贝肌动蛋白进行酶切，得到不同种类的多肽序列；
步骤4，贻贝蛋白酶解：采用胰蛋白酶和胃蛋白酶分别在不同的酶解条件下制备得到不同的贻贝酶解多肽溶液；将酶解多肽溶液沸水浴5-15 min，冷却至室温，进行离心，转速为5000-8000 rpm/min，时间为5-15 min，取上清液，通过质谱测定目标多肽序列，最终确定最佳酶解条件，并测定酶解液分子量分布；
步骤5，分离纯化活性肽：
制得的粗肽溶液用1kDa的超滤膜超滤，除去大分子蛋白，获得小分子量范围的多肽混合溶液，用反向液相色谱进行分离纯化得到较纯的ACE抑制肽，真空冷冻干燥，最大限度保留活性，测定ACE抑制肽体外活性；
步骤6，SHR高血压大鼠模型活性验证：
选取SHR大鼠为模型，通过测定大鼠血压生理变化，从而对ACE抑制活性肽进行体内活性测定；
步骤7，ACE抑制肽结构特征和理论性质的测定。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210409 |