CN102127580A - 一种贻贝酶解ace抑制肽的提取技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术。所述的一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术，采用如下工艺步骤：1)取新鲜贻贝去壳，剖杀，捣碎形成肉糜；2)取步骤1）所得肉糜加1.5倍重的水，蒸煮10分钟；3)待步骤2）所得冷却后，加入CA碱性复合蛋白酶进行酶解；4)步骤3）酶解结束后再加入木瓜蛋白酶进行第二次酶解；5)步骤4）酶解结束后灭酶，然后过滤；6)取步骤5)所得滤液冷冻干燥得ACE抑制肽粉剂。本发明选用贻贝这一产量丰富、营养价值高的水产品为原料，通过生物酶解、冷冻干燥成型等制备ACE抑制肽，经试验证明，其具有显著的降血压效果，本发明工艺简单，可产业化制造，具有很高经济价值和社会效益。

Description

一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术

技术领域

本发明涉及一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术，可应用于水产品加工，生物与食品工程技术领域等。

背景技术

血压的常期升高，可引起脑、心、肾等靶器官的损害，它极易引起脑血栓、脑卒中、老年性痴呆症等多种疾病，直接威胁患者的生命安全，被视为中老年人的头号健康杀手。根据国内外大量随机对照的临床试验结果，收缩压降低10－14mmHg和舒张压降低5－6mmHg，脑卒中减少2/5,冠心病减少1/6，总的主要心血管事件减少1/3，所以降压治疗就显得尤为必要。

研究表明，在高血压人群中，约有95%的患者为原发性高血压，在这一病因中，肾素―血管紧张素这一升压酶系是其中最重要的一个因素，在该酶体系中，ACE（angiotensin―converting enzyme）,即血管紧张素转换酶的作用最为重要，不具有生理活性的Ang I(血管紧张素I)经过血管紧张素转换酶的作用，转换成具有收缩血管壁平滑肌作用的Ang Ⅱ(血管紧张素Ⅱ)，导致血压上升；另一方面，具有扩张血管平滑肌从而使血压下降的血管舒缓激肽又会在血管紧张素转换酶的作用下被分解而失去活性，从而加剧血压上升。

ACE抑制肽实质是一种对ACE酶活性具有抑制作用的生物活性肽。通过它的作用，可使ACE酶活性受到抑制，从而减少或阻碍有升高血压作用的血管紧张素Ⅱ的生成，并抑制具有降血压作用的血管舒缓激肽的分解，因此起到降血压的作用。另一方面，与化学合成的降血压药物相比，ACE抑制肽具有两大优点：

1．ACE抑制肽通常是由食用级酶在温和条件下处理食品原料蛋白获得，已经实验证实无任何毒副作用，这与化学合成降压药对人体肝、肾等有较大副作用且易引发咳嗽、浮肿、头晕等不适反应相比，有极高的安全性。

2．ACE抑制肽属生物活性肽，它只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者则无降压作用，这种降压作用的选择性是普通的化学合成降压药所不具备的。

由于ACE抑制肽的独特优势，加之其明显的降血压效果，近年来倍受国际研究界瞩目：1979年0shima等首次用细菌胶原酶降解明胶获得具有较强降压活性的肽段，从中分离出六条ACE抑制肽，并通过Sephadex G-25证实其活性部分大部分集中在分子量较小片断；Smachi等从酪蛋白的酶解物中分离出一种具有降血压活性的短肽，用其饲喂SHR（自发性高血压大鼠），发现其血压下降了约10mmHg，而对正常大鼠则无降血压作用。Maruyamas等以酪蛋白的某些片断为目标合成肽，发现其与酶解获得的ACE抑制肽有相同活性。Saito以清酒水解物和从水解物中分离出的Val－Tyr, His－Tyr, Arg－Phe等饲喂SHR，发现均可使其血压明显下降，但随着SHR的增长，Val－Tyr, His－Tyr, Arg－Phe等的降压效果逐渐消失，而清酒水解物的降压效果则变化不大。Kim等对不同蛋白酶水解牛皮胶制备ACE抑制肽研究表明，其因酶种不同而有不同的水解程度，降血压活性也不尽相同，并非水解程度最大时降压效果就最好。

此后学术界对ACE抑制肽的研究进入一个高潮，已报道有以牛奶、乳酪、大豆、鱼肉、蔬菜、小麦蛋白等食物为原料，经蛋白酶酶解产生了具有较好ACE抑制活性的ACE抑制肽。Eiji等水解了12种食物蛋白进一步研究发现，短肽类（含2-4个氨基酸残基）比稍长肽链(含10-12个氨基酸残基)有更好的ACE抑制活性。此外还发现，从鱼肉、虾、蟹等水产动物蛋白中制得的ACE抑制肽其降压活性优于其它食物性蛋白。

国外对于以水产蛋白为原料研究ACE抑制肽的成果主要还有：Matsui等用蛋白酶水解沙丁鱼制得ACE抑制肽，发现其ACE抑制活性为IC50=0.26mg Protein/ml(即使ACE活性抑制50%时所需ACE抑制肽浓度), 当用10%的乙醇洗提，其抑制活性可提高到Ic50=0.015mg Protein/ml；同时研究发现，这些ACE抑制肽主要以酸性氨基酸为主，含较少的疏水性氨基酸[21]。Astawan用胰蛋白酶、胃蛋白酶等水解鱼干，发现用胃蛋白酶水解的ACE抑制肽其ACE抑制活性较佳，用其饲喂SHR大鼠三个月，可使其血压下降10mmHg左右，而且还发现其ACE抑制活性片断的氨基酸序列主要为：Val－Ala－Trp－Lys－Leu, Trp－Ser－Lys－Val－Val－Leu, Ser－Lys－Val－Pro－Pro, 其IC50分别为31.97，156.28和74.22mg Protein/ml[22]。目前，日本已有用沙丁鱼制取的ACE抑制肽问世，患者每人每天试用6克，可使血压下降10毫米汞柱。

Cushman 等研究ACE抑制肽的降压机理，认为是ACE抑制肽能与ACE的活性部位结合，可对Ang I(血管紧张素I)与ACE作用产生竞争性抑制，影响了血管紧张素Ⅱ的产生，从而起到降血压作用。同时研究表明当ACE抑制肽肽链中含巯基时，会增加其与ACE的结合能力，使其降压活性提高。

Tzyli等认为，由于ACE抑制肽的降压活性与其肽链上特定的基团及氨基酸序列有关，而其经口服后，由于胃肠消化系统中所含的酶的分解作用，其结构会有所改变，从而影响其降血压活性。Mastsui等研究了胃肠消化酶对口服ACE抑制肽的降压活性的影响，认为部分原本不具降压活性的肽段在各种酶的作用下，释放出具有生理活性的基团，而同时部分原本具有生物活性的肽段则失去生理功能，认为需从两个方面综合考虑消化系统对ACE抑制肽的作用影响。

2003年Marczak 等研究用胰酶酶解菠菜得到四种具有较好ACE抑制活性的短肽：MRWRD，MRW，LRIPIA和IATKPAG。其ACE抑制活性的IC50分别为2.1，0.6，0.38和4.2um。以SHR大鼠做降压实验，分别以100mg/kg的剂量口服在2-4小时内其降压效果分别为15，0，20和13.5mmHg,这与其体外实验结果有很大差异。这些结果也验证了Matsui等的理论。

我国在ACE抑制肽领域的研究起步相对较晚，现有报道以大豆、蛇毒、老酒、茶叶为原料，对ACE抑制肽的制备工艺和活性基团等方面进行了一定研究；对于最适合用于ACE抑制肽制备的水产动物蛋白的开发研究，则鲜有报道。与此同时，作为世界第一水产大国，我国的水产加工水平相当落后，在此领域的基础研究也较为薄弱，加大在该领域的研究和投入已刻不容缓。

贻贝，又名海红、淡菜，近年来人工养殖取得重大成功，在我国东南沿海产量丰富。贻贝营养丰富，其蛋白质含量约为鲜肉重的9-10%，氨基酸种类齐全，且富含牛磺酸、钙、镁、硒等营养元素。据<<本草纲目>>记载，贻贝有益精血、滋阴补肾等功效。但因为其鲜品不易保存，因此常被加工成干品销售。由于产品单一，近年来市场销量受到一定限制，给有关方面造成较大的经济损失。

而国内目前对于贻贝的开发利用，还主要集中在调味品，水解氨基酸液等研究开发的阶段：庆宁等分析了贻贝的营养成份，发现其中蛋白质、氨基酸等含量较高，必需氨基酸占总氨基酸量的33%，且富含牛磺酸、钙、镁、硒等营养元素；章超桦等发现贻贝中谷氨酸、天门冬氨酸等呈味氨基酸含量丰富，因此海鲜味浓郁，研究将其用于调味料的开发；邓尚贵等研究了不同酶法水解贻贝氨基酸液的特点，并得到几种酶分步水解的最佳条件；刘志峰等研究了贻贝提取物抗高血脂作用发现：贻贝提取物可有效降低食饵性高血脂大鼠的血浆胆固醇和甘油三酯；但对于利用贻贝为原料开发ACE抑制肽的研究却仍属空白，这非常令人惋惜。

发明内容

本发明针对现有技术，提供一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术。

所述的一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术，其特征在于采用如下工艺步骤：

1)取新鲜贻贝去壳，剖杀，捣碎形成肉糜；

2)取步骤1）所得肉糜1000g，加1.5倍重的水，蒸煮10分钟；

3)待步骤2）所得冷却后，加入CA碱性复合蛋白酶进行酶解，对应酶解条件：

酶量 100Iu/ml

酶解时间 1h

PH 5.0

酶解温度 45°C；

4)步骤3）酶解结束后再加入木瓜蛋白酶进行第二次酶解，对应酶解条件：

酶量 25-50Iu/ml

酶解时间 2-4h

PH 7.0-8.5

酶解温度 55-60°C；

5)步骤4）酶解结束后灭酶，然后过滤；

6) 取步骤5)所得滤液冷冻干燥，得ACE抑制肽粉剂11.5g。

所述的一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术，其特征在于所述步骤4)对应的酶解条件为：

酶量 25Iu/ml

酶解时间 2h

PH 7.0

酶解温度 60°C。

所述的一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术，其特征在于所述步骤5)中的采用90°C高温灭酶。

所述的一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术，其特征在于所述步骤6)中滤液冷冻干燥的条件为：-25°C，-50Kp。

本发明选用贻贝这一产量丰富、营养价值高的水产品为原料，通过生物酶解、冷冻干燥成型等制备ACE抑制肽，经试验证明，其具有显著的降血压效果，本发明工艺简单，可产业化制造，具有很高经济价值和社会效益。

具体实施方式

以下对本发明作进一步说明：

本发明采用如下工艺步骤制取ACE抑制肽：1)取新鲜贻贝去壳，剖杀，捣碎形成肉糜；2)取步骤1）所得肉糜1000g，加1.5倍重的水，蒸煮10分钟；3)待步骤2）所得冷却后，加入CA碱性复合蛋白酶进行酶解，对应酶解条件：酶量 100Iu/ml，酶解时间 1h，PH 5.0，酶解温度 45°C；4)步骤3）酶解结束后再加入木瓜蛋白酶进行第二次酶解，对应酶解条件：酶量 25Iu/ml，酶解时间 2h，PH 7.0，酶解温度 60°C；5)步骤4）酶解结束后升温到90°C灭酶，然后过滤；6) 取步骤5)所得滤液于-25°C，-50Kp条件下冷冻干燥，得ACE抑制肽粉剂11.5g，检测其ACE抑制率为58.6%。

试验一 加入木瓜蛋白酶的酶解效果

制备7份5）中得到的样品，并编号1-7，分别按表1中的酶解条件加入木瓜蛋白酶，酶解结束后得到酶解液，按以下方法计算ACE抑制率：

1、将反应液（K3PO4 100mM,pH8.3; Nacl 300mM; HHL 5mM）量取0.25毫升，加入试管。

2、分别加入酶解液1毫升（对照组加蒸馏水）。

3、取0.15毫升ACE液（5mM）于反应液中，37℃水浴保温30分钟。

4、加入0.25毫升1N浓度的Hcl充分搅拌以终止反应。

5、加入1.5毫升醋酸乙酯，涡沦搅拌，以萃取反应生成的Hippuric Acid，收集上清液。

6、将上清液于100℃水浴加热约20分钟，以蒸发掉醋酸乙酯，然后加入3毫升蒸馏水，充分振荡。

7、将此溶液于228nm下用紫外分光光度计测定其吸光值。

8、将各酶解液反应值与空白样品对照，分析所得ACE抑制肽的ACE抑制活性。计算公式为：【A228─A228(对照)】\A228×100%。试验结果如表1所示。

经分析：木瓜蛋白酶的酶解效果，最高的ACE抑制率可达88.08%，对应的最佳实验条件为：酶量25 Iu/ml，酶解时间2h，pH 7.0，酶解温度 60℃，具有酶量小，酶解时间短的优点。

试验二ACE抑制肽的降压效果

1．用8只4月龄SHR大鼠为一组，观察其饲喂ACE抑制肽后的血压变化情况，并设置对照组，饲喂不加ACE抑制肽的食品。

2．饲喂方法：早灌喂ACE抑制肽样品一次，灌喂前称大鼠体重，然后分别按4.5克/千克体重的ACE抑制肽样品剂量进行灌喂，灌喂前和灌喂之后第2、4、6、8、10小时分别检测血压一次，记录各血压值。试验结果如表2，对照可知，本发明制得的ACE抑制肽降血压效果显著。

Claims (4)

1.一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术，其特征在于采用如下工艺步骤：

1)取新鲜贻贝去壳，剖杀，捣碎形成肉糜；

2)取步骤1）所得肉糜1000g，加1.5倍重的水，蒸煮10分钟；

3)待步骤2）所得冷却后，加入CA碱性复合蛋白酶进行酶解，对应酶解条件：

酶量 100Iu/ml

酶解时间 1h

PH 5.0

酶解温度 45°C；

4)步骤3）酶解结束后再加入木瓜蛋白酶进行第二次酶解，对应酶解条件：

酶量 25-50Iu/ml

酶解时间 2-4h

PH 7.0-8.5

酶解温度 55-60°C；

5)步骤4）酶解结束后灭酶，然后过滤；

6) 取步骤5)所得滤液冷冻干燥，得ACE抑制肽粉剂11.5g。

2.如权利要求1所述的一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术，其特征在于所述步骤4)对应的酶解条件为：

酶量 25Iu/ml

酶解时间 2h

PH 7.0

酶解温度 60°C。

3. 如权利要求1所述的一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术，其特征在于所述步骤5)中的采用90°C高温灭酶。

4. 如权利要求1所述的一种贻贝酶解ACE抑制肽的提取技术，其特征在于所述步骤6)中滤液冷冻干燥的条件为：-25°C，-50Kp。