JP5799842B2

JP5799842B2 - アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド、該ペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤、組成物及び食品、並びに、該ペプチドの製造方法

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Publication number: JP5799842B2
Application number: JP2012022513A
Authority: JP
Inventors: 戸松　誠; 誠戸松; 砂織高橋; 逸嶋影; 清繁山田
Original assignee: Akita Prefecture
Current assignee: Akita Prefecture
Priority date: 2012-02-03
Filing date: 2012-02-03
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2032-02-03
Also published as: JP2013159577A

Description

本発明は、近年増加傾向にある高血圧症の予防および／または治療に利用し得る、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する新規ペプチド、これらのペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤、組成物及び食品、並びに、該ペプチドの製造方法に関するものである。

アンジオテンシン変換酵素（Angiotensin Converting Enzyme、以下「ＡＣＥ」と略す）は、アンジオテンシンIのペプチド結合の一つを切断してアンジオテンシンIIを産生する。アンジオテンシンIIは強力な昇圧作用を有するペプチドホルモンであり、血管収縮やアルドステロン分泌促進などを通じて血圧上昇を引き起こす。したがって、ＡＣＥを阻害すればアンジオテンシンIIの産生を抑制することができ、高血圧症の治療が可能となる。これまでにＡＣＥ阻害物質としてカプトプリルなどの医薬品が実用化され、広く使用されているものの、これら医薬品の多くは作用が強力であるために空咳などの副作用に対する注意が必要となっている。

一方、ＡＣＥの基質であるアンジオテンシンIがペプチドであることから、天然物由来のペプチドによってＡＣＥを競合的に阻害し、副作用の無い高血圧治療剤を提供する研究が行われてきた。なかでも、大豆タンパク質に由来するペプチドに関しては数多くの報告がなされている（例えば、特許文献１〜５を参照)。

特開２０１０−２４８０９６号公報特開２０１０−１６３４００号公報特開２００６−２６５１３９号公報特開２００５−１３９１５８号公報特開２００２−０５３５９５号公報

上記先行文献に開示のペプチドは、その作用が穏やかであることから、安全性の高いことが期待される一方、有効量を摂取するためにはペプチド類を比較的大量に摂取しなければならないという問題があることが、本発明者らにより明らかとなった。

そこで、本発明は、少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が無く、高血圧者が日常生活の中で容易に経口摂取できる新規のＡＣＥ阻害ペプチド、及びこれらのペプチドを含むアンジオテンシン変換酵素阻害剤、組成物及び食品、並びにその製造法を提供することを課題とする。

本発明は、これまで知られていない新規な化学構造（アミノ酸配列）を有し、更には優れたＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを見いだしたことに基づき開発されたものである。

すなわち、本発明は、一態様において、下記（１）〜（８）のいずれかで表されるアミノ酸配列からなり、ＡＣＥ阻害活性を有する新規ペプチド、およびその塩に係わる。

（１）Phe-Phe-Tyr-Tyr、（２）Trp-His-Pro、（３）Phe-Val-Pro、（４）Leu-His-Pro-Gly-Asp-Ala-Glu-Arg、（５）Ile-Ala-Val、（６）Val-Asn-Pro、（７）Leu-Glu-Pro-Pro、（８）Trp-Asn-Pro-Arg。
また、本発明は、他の態様において、上記ペプチド又はその塩の少なくとも１種を含有するＡＣＥ阻害剤に係わる。
また、本発明は、他の態様において、少なくとも１種の上記ペプチドを構成するアミノ酸配列を含むタンパク質を加水分解して得られる組成物に係わる。

また、本発明は、他の態様において、上記ペプチド又はその塩の少なくとも１種を含有する食品に係わる。
これらＡＣＥ阻害剤、組成物及び食品は、高血圧の症状を緩和する効能を有する。

更に、本発明は、他の態様において、上記ペプチドの製造方法であって、豆乳を加水分解することを含む方法に係わる。この製造方法において用いられる豆乳は、例えば、乳酸菌により発酵処理したものであることが好ましい。また、加水分解は、例えば、酵素、希塩酸又はギ酸のいずれかを用いて行うことが好ましく、酵素としては、例えば、プロテアーゼを用いることが好ましい。

本発明により少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が無く、高血圧者が日常生活の中で容易に経口摂取できる新規のＡＣＥ阻害ペプチド、ならびにこれらのペプチドを含む組成物、およびその製造法が提供された。

実施例２において、高速液体クロマトグラフィーにてペプチドを分画した際のクロマトグラム（下段）、および各フラクションのＡＣＥ阻害活性（上段）を示す図。

以下、本発明について詳しく説明する。
本発明のペプチドは、（１）Phe-Phe-Tyr-Tyr、（２）Trp-His-Pro、（３）Phe-Val-Pro、（４）Leu-His-Pro-Gly-Asp-Ala-Glu-Arg、（５）Ile-Ala-Val、（６）Val-Asn-Pro、（７）Leu-Glu-Pro-Pro、及び（８）Trp-Asn-Pro-Argのアミノ酸配列からなるペプチドであり、優れたＡＣＥ阻害作用を有する。これらペプチドは、周知の化学合成法で製造することができる。例えば、液相法として、アミノ末端側のアミノ酸のアミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護し、カルボキシル基をｐ−ニトロフェニルエステル基で活性化し、カルボキシル末端側のアミノ酸とトリエチルアミン存在下で縮合させた後、接触還元やトリフルオロ酢酸により保護基を除去する方法が挙げられる。また、固相法として、例えば、ポリマー性の固相支持体にカルボキシル末端側のアミノ酸を結合し、アミノ基の保護とカルボキシル基の活性化を施したアミノ酸を順次ペプチド結合により結合した後、トリフルオロ酢酸やフッ化水素などを用いて固相支持体から切断し、アミノ酸側鎖の保護基を除去する方法が挙げられる。本発明のペプチドは、いずれの方法でも製造することができる。なお、ペプチド単体だけではなく、生理学的に許容されるイオンとの塩であっても、同様の効果が期待できる。塩として、例えば、ナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウムやカルシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、モノエタノールアミン等のアルカノールアミン塩等が挙げられる。

また、本発明のペプチドは、該アミノ酸配列を含むタンパク質を加水分解した組成物からカラムクロマトグラフィー等を用いて分離精製することにより製造することもできる。加水分解は公知の方法を用いて行うことができる。例えば、プロテアーゼ剤等の酵素を用いて加水分解してもよいし、あるいは、希塩酸又はギ酸などを用いた化学的分解法により加水分解してもよい。この場合、分離精製せずに該ペプチドを含有する組成物の形態で摂取しても目的の効果が得られる。前述の化学合成法と比べ、大量製造が容易であり、製造コストも少ないことから、より好ましい。

本発明のペプチドをタンパク質の加水分解により得る場合のタンパク質源としては、本発明の目的を達成できる限りいかなるものを用いても良いが、栽培量・価格・タンパク質含量・食経験・分解後の組成物の呈味等から、大豆を用いるのが良い。大豆の種類としては、黄大豆・赤大豆・黒大豆などが挙げられるが、特に黄大豆が好ましい。大豆の態様としては、丸大豆(全脂大豆)、脱脂大豆、精製大豆タンパク質などをそのまま、あるいは割砕、粉砕してから用いることもでき、なかでも、一般的な豆乳製造法で製造した豆乳をそのまま用いるのが、大豆たんぱく質から本発明のペプチドへの変換効率が高く、しかも容易であるため好ましい。さらには豆乳を乳酸菌等による発酵処理を施してから用いることもできる。豆乳を用いた場合に大豆たんぱく質から本発明のペプチドへの変換効率が高い理由としては、固体にプロテアーゼ等の酵素を作用させるよりも液体に作用させる方が、反応率が著しくよいためであると推測される。

本発明のペプチドをタンパク質の加水分解により得る場合に用い得るプロテアーゼとしては、本発明の目的を達成できる限りいかなるものを用いても良い。さらに好ましくは、プロテアーゼ活性・価格・食経験・安全性・分解後の組成物の呈味等の点から、食品製造用の中性プロテアーゼ製剤を用いるのが良い。中性プロテアーゼ製剤としては、特にプロチンＳＤ−ＮＹ１０大和化成（株）製）が好適である。

前記の加水分解反応の条件としては、豆乳にプロテアーゼ製剤を好ましくは終濃度０．０００１〜１質量％、より好ましくは０．００１〜０．１質量％混合し、好ましくは３０〜７０℃、より好ましくは４５〜５５℃で、好ましくは１〜２４時間、より好ましくは１２〜１６時間反応させる。

前記組成物から、本発明のペプチドを分離精製するための方法としては、一般に広く用いられている方法である限外濾過・透析・固相抽出・各種クロマトグラフィー等が挙げられる。特に、サンプルの処理量と精製効率の点から、固相抽出法と逆相クロマトグラフィーが有効である。

このようにして得られた本発明のペプチドは、ＡＣＥ阻害剤、すなわち血圧上昇抑制/降下剤として、経口又は非経口投与により用いることができる。常法に従い、経口投与の場合には、錠剤・顆粒剤・粉末剤・カプセル剤などの形態とすることができ、非経口投与の場合には、注射薬製剤・経皮剤・坐剤などとすることができる。

また、本発明のペプチドは、高血圧予防及び／又は治療を目的とした飲食品（例えば、健康食品・健康志向食品・機能性食品・特定保健用食品等)に用いることができる。本発明のペプチドを各種飲食品に添加して製造することもできるが、前述の通りペプチドを含有する組成物の形態で各種飲食品に添加することも容易である。さらには、組成物そのものを摂取することも容易である。このようにして得られる飲食品としては、例えば、大豆加工品・調味料・発酵乳・清涼飲料・飲料濃縮原液および調整用粉末・酒類・油脂含有食品・麺類・水産加工食品・畜肉加工食品・半固形状食品・ペースト状食品・固形状食品等が挙げられる。

以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によってなんら制限されるものではない。

［実施例１］
<化学合成法によるペプチドの製造>
表１に示す本発明のいずれのペプチドも、ペプチドシンセサイザー（CreoSalus Inc.製THURAMED PEPTIDE SYNTHESIZER）を用いて定常法により、純度９６％以上で得ることができた。これらの化学構造は、プロテインシークエンサー（島津製作所製PSQ-10）、およびＬＣ−ＭＳ（島津製作所製LCMS-2010EV）を用いて常法に従い確認した。

前記合成法により得られたペプチドのＡＣＥ阻害活性をTakahashiらの方法（Biomed. Res. (2011) 32, 407-411）に準じて行った。ＡＣＥ阻害率は、次式で表される。

ＡＣＥ阻害率（％）＝（１−Ｆｓ／Ｆｃ）×１００
なお、式中のＦｓはサンプルにＡＣＥ溶液を加えて３０分間反応させたときの蛍光強度増加値であり、Ｆｃはサンプルの代わりに水を用いたときの蛍光強度増加値である。また、この反応系に対し５０％の酵素活性阻害率を与えるサンプルの濃度をＩＣ_５０値とする。

本発明のペプチドのＡＣＥ阻害活性を表１に示す。なお、これまでに報告された主な食物由来のＡＣＥ阻害ペプチド、１１１種類のＩＣ_５０値は０．３２〜９４５．５μＭであった(Cuie Guang, Robert D, Phillips, (2009) J. Agric. Food Chem., 57, 5113-5120、Lieselot Vercruysse, John V. Camp. Guy Smagghe, (2005) J. Agric. Food Chem., 53, 8106-8155)。本発明のペプチドの多くは、既知のペプチドと比較して充分に強い活性を有しているため、産業上有用と考えられる。

［実施例２］
<プロテアーゼ製剤を用いるペプチドの製造>
豆乳（(株)ヤマダフーズ製「飲みやすい豆乳」）に対し、プロテアーゼ製剤（大和化成（株）製「プロチンＳＤ−ＮＹ１０」）を終濃度０．１質量％になるように添加して混合し、５０℃で１６時間反応させた。その後、酵素を失活させるため、７５℃で１．５時間加熱し、放冷後、固相抽出カラム（Waters製「Sep-Pak C18」）に供した。水で洗浄後、メタノールでペプチドを溶出させた後、エバポレーターで濃縮乾固させた。

上記固形物を溶液Ａ（10mM Tris-HClバッファー pH7.0）に溶解後、上段にカチオン交換樹脂（Waters製「Sep-Pak Accell CM」）、下段にアニオン交換樹脂Waters製「Sep-Pak Accell QMA」）を連結したものに上部から通液した素通り液を中性ペプチド画分とした。これをSep-Pak C18に供し、水で洗浄後、メタノールで溶出させた後、エバポレーターで濃縮乾固させた。

上記の粉末を超純水に溶解後、高速液体クロマトグラフィー(日立製作所製、L-6000)に接続した逆相カラム(Tosoh製、TSKgel Octadecyl-4PW 4.6×150mm)にロードした。溶離液Ａは超純水、溶離液Ｂはアセトニトリルとし、グラジエント条件は、（Ｂ：０％、５分間）→（Ｂ：０％から７０％までリニアグラジエント、２５分間）→（Ｂ:７０％、５分間）とした。流速は１ｍｌ／ｍｉｎとし、フラクションサイズ０．１５ｍｌで分画した。そのクロマトグラムを図１に示す。強いＡＣＥ阻害活性を示した１０フラクションについて、それぞれプロテインシークエンサー(島津製作所製PSQ-10)で構造解析したところ、８フラクションから新規アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド（１）Phe-Phe-Tyr-Tyr、（２）Trp-His-Pro、（３）Phe-Val-Pro、（４）Leu-His-Pro-Gly-Asp-Ala-Glu-Arg、（５）Ile-Ala-Val、（６）Val-Asn-Pro、（７）Leu-Glu-Pro-Pro、（８）Trp-Asn-Pro-Argを単離した。

［実施例３］
<プロテアーゼ製剤を用いるペプチド組成物の製造>
実施例２と同じようにして豆乳にプロテアーゼ製剤を終濃度０〜１質量％になるように添加して混合し、５０℃で１６時間反応させた。その後、酵素を失活させるため、７５℃で１．５時間加熱し、放冷した。得られたペプチド組成物について、実施例１と同様の方法によりＡＣＥ阻害活性を測定した（表２）。比較のために、市販の特定保健用食品２品についても測定した。豆乳にプロテアーゼ製剤を０．０１質量％以上添加して調製した組成物は、特定保健用食品よりも強いＡＣＥ阻害活性を示すことが分かった。

さらに、得られた組成物は特に強い苦味はなく、官能的には通常の豆乳とほぼ同じであった。

本発明で得られる新規アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドは、少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が無く、高血圧者が日常生活の中で容易に経口摂取できる。また、該ペプチドを含み、風味に優れ、安全性が高く、食品としての摂取が容易な組成物の製造法を提供したことにより、高血圧者の生活の質の向上に大きく貢献することが可能となる。

Claims

下記（１）、（２）、（４）及び（６）〜（８）のいずれかで表されるアミノ酸配列からなり、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチドおよびその塩。
（１）Phe-Phe-Tyr-Tyr、（２）Trp-His-Pro、（４）Leu-His-Pro-Gly-Asp-Ala-Glu-Arg、（６）Val-Asn-Pro、（７）Leu-Glu-Pro-Pro、（８）Trp-Asn-Pro-Arg。
下記（１）〜（４）及び（６）〜（８）のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩の少なくとも１種を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
（１）Phe-Phe-Tyr-Tyr、（２）Trp-His-Pro、（３）Phe-Val-Pro、（４）Leu-His-Pro-Gly-Asp-Ala-Glu-Arg、（６）Val-Asn-Pro、（７）Leu-Glu-Pro-Pro、（８）Trp-Asn-Pro-Arg。
豆乳又は乳酸菌で発酵処理した豆乳を加水分解すること、及び
請求項１に記載の（１）、（２）、（４）及び（６）〜（８）のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを単離すること
を含む、請求項１に記載のペプチドの製造方法。