CN104593462A - 一种蓝蛤蛋白源ace抑制肽的制备方法 - Google Patents

一种蓝蛤蛋白源ace抑制肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于水产品加工综合利用领域，具体涉及一种蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的制备方法。针对目前蓝蛤蛋白资源精深加工较少，造成资源浪费，本发明以蓝蛤肉为原料经原料预处理、双酶分步酶解制备、活性炭吸附和冷冻干燥，最终获得蓝蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，其对ACE活性的抑制率大于40％。本发明提供了一种ACE抑制肽开发的潜在的优质蛋白资源，同时解决了蓝蛤未被充分利用既造成的资源浪费以及给环境治理带来了巨大压力的难题。

Description

一种蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的制备方法
技术领域
本发明属于水产品加工综合利用领域，具体涉及一种蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的制备方法。
背景技术
食物蛋白源活性肽不仅能提供人体生长发育所需的营养，还具有调节血压、抗凝血、抗菌、免疫、抗氧化、降胆固醇、调节神经系统、降血脂、护肝等功能。血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽是一类具有抑制ACE活性的生物活性物质，自1965年首次发现ACE抑制肽以来，国内外研究人员已从不同来源的蛋白质中制备出各种具有血管紧张素转化酶抑制活性的肽类物质。蓝蛤是一种低值贝类，在黄、渤海沿海滩涂产量高，繁殖量大，由于其个体小、蛤肉少，目前对蓝蛤精深加工较少，仅有少量用作对虾活饵料，多数没有被充分利用，既造成资源浪费同时给环境治理带来了巨大压力。蓝蛤肉质鲜美，营养丰富，含有丰富的蛋白质资源，然而有关蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的研究报道较少，本发明以蓝蛤肉为原料开发ACE抑制肽。检索中国专利，未见相同相似记载。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的制备方法。
本发明所述的一种蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的制备方法，包括原料预处理、酶解制备和活性炭吸附，具体步骤如下：
(1)原料预处理
将蓝蛤肉洗净后沥干，经预冻3小时后，进行真空冷冻干燥，取出蓝蛤肉冻干物经粉碎机粉碎，获得的蓝蛤肉干粉并过200-400目筛，将过筛后的粉末保存用于酶解制备。
(2)酶解制备
取一定量过200-400目筛的蓝蛤肉干粉配制成浓度为5-10％的水溶液，置于恒温水浴锅中90℃热变性10分钟，冷却至酶解温度30～60℃，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调解pH至6～11，加入占蓝蛤肉蛋白质质量1％～6％的Protamex复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中不断搅拌，并不断加入0.1moL/L氢氧化钠溶液以维持pH值在6～11范围内(±0.05)，酶解过程中每隔30分钟取10毫升酶解液离心后进行ACE抑制活性的测定，酶解2～10小时后经100℃灭酶10分钟；冷却至温度50～70℃，用0.1moL/L盐酸溶液或氢氧化钠溶液调解pH至5～9，加入占蓝蛤肉蛋白质质量1％～5％的风味蛋白酶进行酶解，酶解过程中不断搅拌，酶解过程中每隔30分钟取10毫升酶解液离心后进行ACE抑制活性的测定，酶解1～5小时后经100℃灭酶10分钟，5000～9000×g离心10分钟，上清液为蓝蛤蛋白酶解液；
(3)活性炭吸附及冷冻干燥
在酶解液中加入占酶解液总质量1％～5％的活性炭，搅拌2～5小时后离心去除活性炭，经冷冻干燥得到蓝蛤蛋白源ACE抑制肽粉末。
本发明所采用的ACE抑制活性的测定，具体步骤为：
取30μL马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)底物液，加入10μL抑制剂混合均匀，在37℃±0.5℃恒温水浴中预热3-5分钟，然后加入20μL血管紧张素转化酶(ACE)液充分混合，37℃保温30分钟后，再加入60μL的1mol/LHCl终止反应，得到反应液。同时用10μL pH为8.3的硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组。该反应液用0.45μm滤膜过滤后直接用HPLC系统进行分析。色谱条件：柱温25℃，流速0.5mL/min，流动相乙腈/水(0.05％TFA)比例为25/75等度洗脱，检测波长228nm.
ACE抑制活性计算公式如下：
ACE抑制活性(％)＝100(M-N)/M
式中：M为空白对照组中马尿酸的峰面积。
N为添加抑制剂组中马尿酸的峰面积。
本发明的有益效果体现蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的制备采用分步酶解方式，由于两种酶的底物特异性不同，第一步酶解产物能与第二步加入的蛋白酶充分接触而被充分降解，因而最终获得的活性肽分子量更低，更易于人体直接吸收进而发挥其调节肾素-血管紧张素系统的作用；同时本发明将低值贝类蓝蛤进行精深加工，不仅改变了当前蓝蛤的低利用率的现状，而且减轻了海洋环境治理的负担。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步阐述，但不限于此。
实施例1：
(1)原料预处理
将蓝蛤肉洗净后沥干，经预冻3小时后，进行真空冷冻干燥，取出蓝蛤肉冻干物经粉碎击粉碎，获得的蓝蛤肉干粉并过200目筛，将过筛后的粉末保存用于酶解制备。
(2)酶解制备
取一定量过200目筛的蓝蛤肉干粉配制成浓度为5％的水溶液，置于恒温水浴锅中90℃热变性10分钟，冷却至酶解温度30℃，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调解pH至6，加入占蓝蛤肉蛋白质质量1％的Protamex复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中不断搅拌，并不断加入0.1moL/L氢氧化钠溶液以维持pH值在6(±0.05)，酶解过程中每隔30分钟取10毫升酶解液离心后进行ACE抑制活性的测定，酶解2小时后经100℃灭酶10分钟；冷却至温度50℃，用0.1moL/L盐酸溶液调解pH至5，加入占蓝蛤肉蛋白质质量1％的风味蛋白酶进行酶解，酶解过程中不断搅拌，酶解过程中每隔30分钟取10毫升酶解液离心后进行ACE抑制活性的测定，酶解2小时后经100℃灭酶10分钟，5000×g离心10分钟，上清液为蓝蛤蛋白酶解液；
(3)活性炭吸附及冷冻干燥
在酶解液中加入占其总质量1％的活性炭，搅拌2小时后离心去除活性炭，经冷冻干燥得到蓝蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，经ACE抑制活性的测定，其对ACE活性的抑制率＞40％。
实施例2：
(1)原料预处理
将蓝蛤肉洗净后沥干，经预冻3小时后，进行真空冷冻干燥，取出蓝蛤肉冻干物经粉碎击粉碎，获得的蓝蛤肉干粉并过300目筛，将过筛后的粉末保存用于酶解制备。
(2)酶解制备
取一定量过300目筛的蓝蛤肉干粉配制成浓度为8％的水溶液，置于恒温水浴锅中90℃热变性10分钟，冷却至酶解温度50℃，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调解pH至9，加入占蓝蛤肉蛋白质质量5％的Protamex复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中不断搅拌，并不断加入0.1moL/L氢氧化钠溶液以维持pH值在9(±0.05)，酶解过程中每隔30分钟取10毫升酶解液离心后进行ACE抑制活性的测定，酶解5小时后经100℃灭酶10分钟；冷却至温度60℃，用0.1moL/L盐酸溶液调解pH至7，加入占蓝蛤肉蛋白质质量4％的风味蛋白酶进行酶解，酶解过程中不断搅拌，酶解过程中每隔30分钟取10毫升酶解液离心后进行ACE抑制活性的测定，酶解5小时后经100℃灭酶10分钟，9000×g离心10分钟，上清液为蓝蛤蛋白酶解液；
(3)活性炭吸附及冷冻干燥
在酶解液中加入占其总质量5％的活性炭，搅拌5小时后离心去除活性炭，经冷冻干燥得到蓝蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，经ACE抑制活性的测定，其对ACE活性的抑制率＞50％。
实施例3：
(1)原料预处理
将蓝蛤肉洗净后沥干，经预冻3小时后，进行真空冷冻干燥，取出蓝蛤肉冻干物经粉碎击粉碎，获得的蓝蛤肉干粉并过400目筛，将过筛后的粉末保存用于酶解制备。
(2)酶解制备
取一定量过400目筛的蓝蛤肉干粉配制成浓度为10％的水溶液，置于恒温水浴锅中90℃热变性10分钟，冷却至酶解温度60℃，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调解pH至11，加入占蓝蛤肉蛋白质质量6％的Protamex复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中不断搅拌，并不断加入0.5moL/L氢氧化钠溶液以维持pH值在11(±0.05)，酶解过程中每隔30分钟取10毫升酶解液离心后进行ACE抑制活性的测定，酶解10小时后经100℃灭酶10分钟；冷却至温度70℃，用0.1moL/L盐酸溶液调解pH至9，加入占蓝蛤肉蛋白质质量5％的风味蛋白酶进行酶解，酶解过程中不断搅拌，酶解过程中每隔30分钟取10毫升酶解液离心后进行ACE抑制活性的测定，酶解10小时后经100℃灭酶10分钟，7000×g离心10分钟，上清液为蓝蛤蛋白酶解液：
(3)活性炭吸附及冷冻干燥
在酶解液中加入占其总质量3％的活性炭，搅拌3小时后离心去除活性炭，经冷冻干燥得到蓝蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，经ACE抑制活性的测定，其对ACE活性的抑制率＞45％。

Claims (1)

1.一种蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
原料预处理：
将蓝蛤肉洗净后沥干，经预冻3小时后，进行真空冷冻干燥，取出蓝蛤肉冻干物经粉碎机粉碎，获得的蓝蛤肉干粉过200-400目筛，将过筛后的粉末保存用于酶解制备；
酶解制备：
取一定量过200-400目筛的蓝蛤肉干粉配制成浓度为5-10％的水溶液，置于恒温水浴锅中90℃热变性10分钟，冷却至酶解温度30～60℃，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调解pH至6～11，加入占蓝蛤肉蛋白质质量1％～6％的Protamex复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中不断搅拌，并不断加入0.1moL/L氢氧化钠溶液以维持pH值在6～11范围内(±0.05)，酶解过程中每隔30分钟取10毫升酶解液离心后进行ACE抑制活性的测定，酶解2～10小时后经100℃灭酶10分钟；冷却至温度50～70℃，用0.1moL/L盐酸溶液或氢氧化钠溶液调解pH至5～9，加入占蓝蛤肉蛋白质质量1％～5％的风味蛋白酶进行酶解，酶解过程中不断搅拌，酶解过程中每隔30分钟取10毫升酶解液离心后进行ACE抑制活性的测定，酶解1～5小时后经100℃灭酶10min，5000～9000×g离心10min，上清液为蓝蛤蛋白酶解液；
活性炭吸附及冷冻干燥：
在酶解液中加入占其总质量1％～5％的活性炭，搅拌2～5小时后离心去除活性炭，经冷冻干燥得到蓝蛤蛋白源ACE抑制肽粉末。
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