CN114634961B

CN114634961B - 一种具有多种生物活性功能的牡蛎寡聚肽粉的制备方法

Info

Publication number: CN114634961B
Application number: CN202210327490.0A
Authority: CN
Inventors: 陆跃乐; 孙雪; 郑晓宇; 高倩妮
Original assignee: Hangzhou Jiajiale Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Jiajiale Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-30
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2042-03-30
Also published as: CN114634961A

Abstract

本发明提供了一种具有多种生物活性功能的牡蛎寡聚肽粉的制备方法，具体步骤为：(1)使用破壁机粉碎牡蛎肉；(2)使用加速溶剂提取系统进行牡蛎蛋白提取；(3)将氯化胆碱和甘油混合制备深度共晶溶剂；(4)加入牡蛎蛋白、中性蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理；(5)使用高压均化器处理；(6)将处理后的酶解液分别经过陶瓷膜、超滤膜、纳滤设备进行过滤，得到纳滤浓缩液；(7)使用喷雾干燥机进行喷雾干燥。本发明使用的加速溶剂提取系统大大提高了牡蛎蛋白的提取率，通过深度共晶溶剂辅助酶解牡蛎蛋白，可加速酶促反应进程，提高牡蛎肽得率，通过使用高压均质处理牡蛎蛋白酶解液，可进一步提高牡蛎寡聚肽得率。

Description

一种具有多种生物活性功能的牡蛎寡聚肽粉的制备方法

技术领域

本发明涉及食品开发技术领域，尤其是涉及一种具有多种生物活性功能的牡蛎寡聚肽粉的制备方法。

背景技术

近年来海洋生物活性肽研究取得了巨大的发展。目前为止，人们利用的生物活性肽主要来源于陆地植物或动物性多肽，如大豆多肽、玉米抗氧化肽、黑豆抗氧化肽、花生抗氧化肽、乳源性降血压肽、猪皮胶原蛋白肽。随着陆地资源不断地被消耗和枯竭，人们逐渐将眼光转向海洋。

海洋作为人类资源的宝库，蕴含着巨大的能源。海洋生物约占了全球生物的一半，尤其是蛋白质资源更为丰富，海洋中的鱼、虾、贝类为人类提供了重要的蛋白质和生物活性物质来源。目前为止，人们食用的动物蛋白有四分之一来自海洋，随着科技不断地发展，海洋资源更加广泛地被开发利用，这一比例将会越来越大。而且由于海洋高盐、高压、低温等极端环境也使海洋生物在进化过程中产生了众多结构新颖、功能特别的生物活性物质。海洋生物活性物质资源无论在数量上和质量上都远远多于和优于陆地，具有巨大的开发潜力。

牡蛎不仅是中国养殖产量最大的经济贝类，也是世界上最大的养殖贝类。牡蛎肉蛋白质干基含量高达60.78％，是制备生物活性肽良好的蛋白质来源。近年来，研究牡蛎的生物活性成为热点，牡蛎从作为生鲜水产品食材和传统型加工食品向海洋活性物质的提取转变已经取得了巨大的成果。

目前制备多肽的方法各种各样，其中包括化学合成法、基因工程法、从一些动植物组织中直接提取法以及酶解法等手段。蛋白质的提取方法又分为多种，主要是盐析法、有机溶剂萃取法、pH调节法和酶水解法，现在研究方案中经常会结合这其中的两种或多种进行蛋白质的提取实验。有机溶剂萃取法提取蛋白质可同时完成样品富集与净化，大大提高检测灵敏度，能够进行大批量的生产试验并且自动化处理，多次操作结果几乎无差异，最重要的特点是能够大大节省了溶剂量；不足之处在于使用的固态萃取的小柱成本较高，需要专业人员协助进行方法开发。

随着人工养殖技术的发展和普及，牡蛎的养殖产量大大增加，因此如何高值化开发和利用牡蛎资源成为关键。目前牡蛎主要作为新鲜水产品被直接食用，而生产加工成高值化的功能性食品比例还很小。利用现代食品加工技术和生物技术将牡蛎开发成具有多种生物活性功能的牡蛎肽具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种具有多种生物活性功能的牡蛎寡聚肽粉的制备方法。本发明制备的牡蛎寡聚肽粉分子量小，肽得率高，且具有多种生物活性功能，具有极高的营养及开发价值。

本发明为了实现上述目的采用的技术方案是：

一种具有多种生物活性功能的牡蛎寡聚肽粉的制备方法，包括以下步骤：

(1)牡蛎肉打浆：将新鲜牡蛎肉用去离子水清洗干净，使用破壁机将牡蛎肉打浆；

(2)加速溶剂提取系统提取牡蛎蛋白：将步骤(1)处理得到的牡蛎肉与硅藻土以质量比1:1-6混合，用作分散剂；

将该混合物装入含有纤维素过滤器的不锈钢萃取池中；乙醇预先在超声波浴中脱气20-40min，使用加速溶剂提取系统提取牡蛎蛋白。

(3)深度共晶溶剂的制备：将氯化胆碱与溶剂混合在热稳定塑料管中，将试管在温度可调的加热系统中于80-100℃孵育，每隔15-25分钟手摇一次，直到观察到均匀透明的液体；然后将样品冷却至室温；

(4)牡蛎蛋白酶解：将步骤(3)制备的深度共晶溶剂与去离子水配制为5-20wt％的深共晶水溶液，将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:5-15g/ml与该溶液混合，然后添加中性蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理；

(5)高压均质化处理：将步骤(4)酶解后的酶解液使用高压均化器处理；

(6)牡蛎寡聚肽的分离纯化：将步骤(5)得到的酶解液首先经过陶瓷膜进行初级过滤，然后把经过初级过滤的清液利用超滤膜进行超滤分级，最后把超滤分级得到的清液利用纳滤设备进行纳滤浓缩，得到的浓缩液即为牡蛎寡聚活性肽浓缩液；

(7)喷雾干燥制备牡蛎寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤(6)制备的牡蛎寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，经过喷雾干燥后可得牡蛎寡聚活性肽粉。

优选的，步骤(1)中所述的牡蛎肉的破壁时间为10-40min；破壁机型号为九阳高速破壁机L18-Y22A，功率1000W，转速35000转/分。

优选的，步骤(2)中加速溶剂提取系统采用赛默飞Dionex ASE 150，萃取条件为：0-100wt％乙醇、提取温度28-80℃、循环次数1-10、时间3-12分钟，pH值7-12、压力为1000-2000psi；冲洗率为30-80％。

优选的，步骤(3)中所述氯化胆碱与溶剂的摩尔比为1:1-6，所述溶剂为乙二醇、尿素、甘油、乙酰胺、葡萄糖、丙二酸中的一种。

优选的，步骤(4)中所述的中性蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶的用量分别为0.01-0.5％，所述百分比以牡蛎蛋白与深共晶水溶液的总质量为基准。

优选的，步骤(4)中所述的酶解反应条件为：pH为7，温度为40-65℃，酶解时间1-6h。

优选的，步骤(5)中所述的高压均化器采用中国上海东华机器有限公司的GYB60-6S；均化压力为20-80.0MPa，加工周期为5-20次。

优选的，步骤(6)中所述的陶瓷膜的孔径为小于0.2μm，超滤膜的可通过的分子量为不大于1000Da,，纳滤膜的可通过的分子量为不大于100Da，牡蛎寡聚活性肽浓缩液的固含物含量大于等于10％。

优选的，其特征在于，步骤(7)中所述的喷雾干燥条件为：干燥温度120-200℃，喷雾压力10-20MPa。

其中，步骤(2)中的纤维素过滤器是为了防止系统堵塞。

本发明有益的技术效果在于：

(1)本发明首先用加速溶剂提取系统提取牡蛎蛋白从而提高牡蛎蛋白的提取率。该加速液体提取系统有利于液体渗透到样品基质中，并增强传质和化合物的溶解度。加压液体提取能够减少所需的溶剂量，缩短提取时间，并提高牡蛎蛋白的提取率。

(2)本发明使用深共晶溶剂作为增溶剂辅助酶解牡蛎蛋白，促进了小分子牡蛎肽的转化。深共晶溶剂有更好的溶解蛋白质的能力，因为更有序的结构，当深共晶溶剂与蛋白质接触时，其被分解以增加熵，并增强蛋白质的溶解度。因此，在相同的酶解条件下，添加深共晶溶剂能够更好的酶解更多的牡蛎蛋白，提高牡蛎肽的提取率。且与传统的有机溶剂相比，深共晶溶剂具有生物相容性、无毒和生物可降解性，使用深共晶溶剂提取牡蛎肽可以有效地保持蛋白及肽的生物活性和稳定性。

(3)本发明使用的高压均质进一步破坏了蛋白质结构，降低了平均粒径，可以进一步断裂被酶解后不稳定的小分子蛋白和大分子肽链的肽键，进一步降低牡蛎肽的分子量，提高牡蛎寡聚肽的得率。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

(1)牡蛎肉打浆：将新鲜的牡蛎肉用清水反复冲洗干净，用去离子水清洗干净，使用破壁机粉碎10min将牡蛎肉打浆；破壁机型号为九阳高速破壁机L18-Y22A，功率1000W，转速35000转/分，下同。

(2)加速溶剂提取系统提取牡蛎蛋白：将步骤(1)处理的牡蛎肉硅藻土以比例1:1混合，用作分散剂，将该混合物装入含有纤维素过滤器的不锈钢萃取池中，以防止系统堵塞。乙醇预先在超声波浴中脱气30min。加速溶剂提取系统(赛默飞Dionex ASE 150)的萃取条件为：0％的乙醇溶剂、提取温度28℃、循环次数10、时间3分钟和pH值7、压力＝2000psi；冲洗率＝30％。

(3)深度共晶溶剂的制备：按照摩尔比1:1将氯化胆碱和乙二醇混合在热稳定塑料管中，将试管在温度可编程的加热块系统中于80℃孵育，每隔15min搅拌一次，直到观察到均匀透明的液体。之后，将样品冷却至室温。

(4)牡蛎蛋白酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:15g/ml与含5％步骤(3)制备的深度共晶溶剂的去离子水混合，然后添加中性蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理，酶解条件为：pH 7，温度为40℃，每种酶的添加量为0.5％，酶解时间1h。

(5)高压均质化处理：将步骤(4)酶解后的酶解液使用高压均化器(GYB60-6S，中国上海东华机器有限公司)处理，压力为80.0MPa，加工周期为5次。

(6)牡蛎寡聚肽的分离纯化：将步骤(5)得到的酶解液首先经过0.2μm的陶瓷膜进行初级过滤，然后把经过初级过滤的清液利用可通过分子量小于1000Da的超滤膜设备进行超滤分级，最后把超滤分级得到的清液利用分子量小于150Da的纳滤膜设备进行纳滤浓缩，得到的浓缩液即为牡蛎寡聚活性肽浓缩液，牡蛎寡聚活性肽浓缩液的固含物含量大于等于10％。

(7)喷雾干燥制备牡蛎寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤(6)制备的牡蛎寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，干燥温度200℃，喷雾压力10MPa，经过喷雾干燥后可得牡蛎寡聚活性肽粉。

实施例2：

(1)牡蛎肉打浆：将新鲜的牡蛎肉用清水反复冲洗干净，用去离子水清洗干净，使用破壁机粉碎15min将牡蛎肉打浆；

(2)加速溶剂提取系统提取牡蛎蛋白：将步骤(1)处理的牡蛎肉硅藻土以比例1:2混合，用作分散剂，将该混合物装入含有纤维素过滤器的不锈钢萃取池中，以防止系统堵塞。乙醇预先在超声波浴中脱气30min。加速溶剂提取系统(赛默飞Dionex ASE 150)的萃取条件为：20％的乙醇溶剂、提取温度35℃、循环次数8、时间5分钟和pH值8、压力＝1800psi；冲洗率＝40％。

(3)深度共晶溶剂的制备：按照摩尔比1:2将氯化胆碱和尿素混合在热稳定塑料管中，将试管在温度可编程的加热块系统中于90℃孵育，每隔20min搅拌一次，直到观察到均匀透明的液体。之后，将样品冷却至室温。

(4)牡蛎蛋白酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:12g/ml与含8％步骤(3)制备的深度共晶溶剂的去离子水混合，然后添加中性蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理，酶解条件为：pH 8，温度为45℃，每种酶的添加量为0.4％，酶解时间2h。

(5)高压均质化处理：将步骤(4)酶解后的酶解液使用高压均化器(GYB60-6S，中国上海东华机器有限公司)处理，压力为70.0MPa，加工周期为8次。

(7)喷雾干燥制备牡蛎寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤(6)制备的牡蛎寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，干燥温度185℃，喷雾压力12MPa，经过喷雾干燥后可得牡蛎寡聚活性肽粉。

实施例3：

(1)牡蛎肉打浆：将新鲜的牡蛎肉用清水反复冲洗干净，用去离子水清洗干净，使用破壁机粉碎20min将牡蛎肉打浆；

(2)加速溶剂提取系统提取牡蛎蛋白：将步骤(1)处理的牡蛎肉硅藻土以比例1:3混合，用作分散剂，将该混合物装入含有纤维素过滤器的不锈钢萃取池中，以防止系统堵塞。乙醇预先在超声波浴中脱气30min。加速溶剂提取系统(赛默飞Dionex ASE 150)的萃取条件为：40％的乙醇溶剂、提取温度45℃、循环次数6、时间7分钟和pH值9、压力＝1600psi；冲洗率＝50％。

(3)深度共晶溶剂的制备：按照摩尔比1:3将氯化胆碱和甘油混合在热稳定塑料管中，将试管在温度可编程的加热块系统中于100℃孵育，每隔25min搅拌一次，直到观察到均匀透明的液体。之后，将样品冷却至室温。

(4)牡蛎蛋白酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:10g/ml与含10％步骤(3)制备的深度共晶溶剂的去离子水混合，然后添加中性蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理，酶解条件为：pH 9，温度为50℃，每种酶的添加量为0.3％，酶解时间3h。

(5)高压均质化处理：将步骤(4)酶解后的酶解液使用高压均化器(GYB60-6S，中国上海东华机器有限公司)处理，压力为60.0MPa，加工周期为12次。

(7)喷雾干燥制备牡蛎寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤(6)制备的牡蛎寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，干燥温度170℃，喷雾压力15MPa，经过喷雾干燥后可得牡蛎寡聚活性肽粉。

实施例4：

(1)牡蛎肉打浆：将新鲜的牡蛎肉用清水反复冲洗干净，用去离子水清洗干净，使用破壁机粉碎25min将牡蛎肉打浆；

(2)加速溶剂提取系统提取牡蛎蛋白：将步骤(1)处理的牡蛎肉硅藻土以比例1:4混合，用作分散剂，将该混合物装入含有纤维素过滤器的不锈钢萃取池中，以防止系统堵塞。乙醇预先在超声波浴中脱气30min。加速溶剂提取系统(赛默飞Dionex ASE 150)的萃取条件为：60％的乙醇溶剂、提取温度55℃、循环次数4、时间9分钟和pH值10、压力＝1400psi；冲洗率＝60％。

(3)深度共晶溶剂的制备：按照摩尔比1:4将氯化胆碱和乙酰胺混合在热稳定塑料管中，将试管在温度可编程的加热块系统中于80℃孵育，每隔15min搅拌一次，直到观察到均匀透明的液体。之后，将样品冷却至室温。

(4)牡蛎蛋白酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:8g/ml与含12％步骤(3)制备的深度共晶溶剂的去离子水混合，然后添加中性蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理，酶解条件为：pH 10，温度为55℃，每种酶的添加量为0.2％，酶解时间4h。

(5)高压均质化处理：将步骤(4)酶解后的酶解液使用高压均化器(GYB60-6S，中国上海东华机器有限公司)处理，压力为50.0MPa，加工周期为15次。

(7)喷雾干燥制备牡蛎寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤(6)制备的牡蛎寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，干燥温度160℃，喷雾压力16MPa，经过喷雾干燥后可得牡蛎寡聚活性肽粉。

实施例5：

(1)牡蛎肉打浆：将新鲜的牡蛎肉用清水反复冲洗干净，用去离子水清洗干净，使用破壁机粉碎30min将牡蛎肉打浆；

(2)加速溶剂提取系统提取牡蛎蛋白：将步骤(1)处理的牡蛎肉硅藻土以比例1:5混合，用作分散剂，将该混合物装入含有纤维素过滤器的不锈钢萃取池中，以防止系统堵塞。乙醇预先在超声波浴中脱气30min。加速溶剂提取系统(赛默飞Dionex ASE 150)的萃取条件为：80％的乙醇溶剂、提取温度65℃、循环次数2、时间10分钟和pH值11、压力＝1200psi；冲洗率＝70％。

(3)深度共晶溶剂的制备：按照摩尔比1:5将氯化胆碱和葡萄糖混合在热稳定塑料管中，将试管在温度可编程的加热块系统中于90℃孵育，每隔20min搅拌一次，直到观察到均匀透明的液体。之后，将样品冷却至室温。

(4)牡蛎蛋白酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:6g/ml与含15％步骤(3)制备的深度共晶溶剂的去离子水混合，然后添加中性蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理，酶解条件为：pH 11，温度为60℃，每种酶的添加量为0.1％，酶解时间5h。

(5)高压均质化处理：将步骤(4)酶解后的酶解液使用高压均化器(GYB60-6S，中国上海东华机器有限公司)处理，压力为30.0MPa，加工周期为18次。

(7)喷雾干燥制备牡蛎寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤(6)制备的牡蛎寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，干燥温度140℃，喷雾压力18MPa，经过喷雾干燥后可得牡蛎寡聚活性肽粉。

实施例6：

(1)牡蛎肉打浆：将新鲜的牡蛎肉用清水反复冲洗干净，用去离子水清洗干净，使用破壁机粉碎40min将牡蛎肉打浆；

(2)加速溶剂提取系统提取牡蛎蛋白：将步骤(1)处理的牡蛎肉硅藻土以比例1:6混合，用作分散剂，将该混合物装入含有纤维素过滤器的不锈钢萃取池中，以防止系统堵塞。乙醇预先在超声波浴中脱气30min。加速溶剂提取系统(赛默飞Dionex ASE 150)的萃取条件为：100％的乙醇溶剂、提取温度80℃、循环次数1、时间12分钟和pH值12、压力＝1000psi；冲洗率＝80％。

(3)深度共晶溶剂的制备：按照摩尔比1:6将氯化胆碱和丙二酸混合在热稳定塑料管中，将试管在温度可编程的加热块系统中于100℃孵育，每隔25min搅拌一次，直到观察到均匀透明的液体。之后，将样品冷却至室温。

(4)牡蛎蛋白酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:5g/ml与含20％步骤(3)制备的深度共晶溶剂的去离子水混合，然后添加中性蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理，酶解条件为：pH 12，温度为65℃，每种酶的添加量为0.01％，酶解时间6h。

(5)高压均质化处理：将步骤(4)酶解后的酶解液使用高压均化器(GYB60-6S，中国上海东华机器有限公司)处理，压力为20.0MPa，加工周期为20次。

(7)喷雾干燥制备牡蛎寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤(6)制备的牡蛎寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，干燥温度120℃，喷雾压力20MPa，经过喷雾干燥后可得牡蛎寡聚活性肽粉。

测试例：

测定了实施例制备的牡蛎寡聚肽的寡聚肽含量、DPPH自由基消除率、ABTS自由基清除率、羟基自由基清除率、血管紧张素转换酶抑制率、促进小鼠性功能活性。

具体测定方法如下，测定结果如表1所示。

(1)牡蛎寡聚肽转化率

(2)DPPH自由基消除率：取1.00mL 1％的牡蛎寡聚活性肽水溶液，加入4.00mL的100μmol/L DPPH乙醇溶液混匀，避光放置30min，以原溶剂调零，在517nm处测定吸光度记为Ai；同法取1.00mL溶剂加入4.00mL DPPH溶液混匀，测定吸光度记为Ac；取1.00mL水解物加入4.00mL的溶剂混匀，测定吸光度记为Aj。DPPH自由基清除率计算公式为：

DPPH自由基清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％。

(3)ABTS自由基清除率：ABTS储备液配制：取1.72mg过硫酸钾和10mgABTS溶于2.6ml、pH＝7.4PBS缓冲液中，在室温下避光静置12～16h后，用pH＝7.4PBS缓冲液稀释，使其在酶标仪734nm下吸光度值为0.7±0.02，得ABTS工作液(现用现配)。实验分为空白组、对照组和样品组三组。

空白组Ab：每孔加入200μL PBS缓冲液；

对照组AC：每孔加20μL PBS和180μL ABTS工作液；

实验组AS：每孔加20μL样品溶液和180μL ABTS工作液，放置于振荡器振荡10s，室温条件下避光反应5min，用酶标仪测定其在734nm处的吸光度值。ABTS自由基清除率计算公式如下：

ABTS自由基清除率(％)＝(AC-AS)/(AC-Ab)×100％

(4)羟基自由基(.OH)清除率：采用D-脱氧核糖-Fe体系法。吸取0.1mL 1％的牡蛎寡聚活性肽水溶液，移入试管中，加0.1mL 1.04mmol/L EDTA溶液、0.1mL1 mmol/L FeCl3溶液、0.1mL2 mmol/L Vc溶液、0.1mL10 mmol/L H₂O₂溶液、0.1mL60 mmol/L DR溶液和0.4mLpH 7.5KH₂PO₄-NaOH缓冲溶液。37℃水浴1h，加1mL 25％HCl溶液终止反应，加1mL 1％硫代巴比妥酸(TBA)溶液，100℃水浴15min，冷却后有沉淀，加入1mL正丁醇萃取颜色，然后于532nm波长处测定吸光值。以空白作参比，按下式计算。

羟基自由基清除率(％)＝[(A₀－(A₁－A₂)/A₀]×100％

式中：A₀－不加样品的空白吸光度；

A₁－加入样品和2-脱氧-D-核糖的吸光度；

A₂－样品在体系中吸光度(不加DR)

(5)抑制血管紧张素转换酶能力：该方法基于以下物质的水解三肽马尿酰-组氨酰-亮氨酸在血管紧张素转换酶的作用下转化为马尿酸。使用微型高效液相色谱设备和Chromolith Performance RP-18e柱(100mm×4.6mm ID)监控反应。简言之，将2.5μL样品与10μL血管紧张素转换酶(水中0.05U/mL)、17.5μL含300mM NaCl的50mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸缓冲液(pH 8.3)和5μL含NaCl的50mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸缓冲液中的马尿酰-组氨酰-亮氨酸混合。混合物在37℃下孵育4.5小时，在20℃下用50μL乙腈终止。色谱条件为:洗脱梯度，10分钟内5–95％B；流动相，含0.05％水(v/v)三氟乙酸(流动相A)和含0.05％(v/v)三氟乙酸的乙腈(流动相B)；流速，20微升/分钟；柱温，25℃；注射体积，1μL；紫外检测，228纳米。血管紧张素转换酶的抑制以百分数表示。

(6)促进小鼠性功能活性：将小鼠睾丸间质细胞使用含有5％HS、2.5％FBS的DMEM/F12(1∶1)培养基，在37℃，5％CO₂及充分饱和湿度的培养箱中培养小鼠睾丸间质细胞。根据细胞的实际情况，2～3d换一次培养液，待细胞培养至培养皿的80％左右时，弃掉培养瓶中旧培养基，用磷酸缓冲液冲洗细胞2～3次，加入适量室温复温的0.05％胰酶消化液，按照1∶3传代培养。3次传代后取处于对数期、生长状态良好的细胞用于试验。以不含牡蛎寡聚肽粉培养的小鼠睾丸间质细胞培养上清测定的一氧化氮、睾酮、二氢睾酮、环磷酸鸟苷含量、SOD活性为对照组，计算含含10mg/mL牡蛎寡聚肽粉培养的小鼠睾丸间质细胞培养上清测定的一氧化氮、睾酮、二氢睾酮、环磷酸鸟苷含量、SOD活性的增长率。一氧化氮、睾酮、二氢睾酮、环磷酸鸟苷含量参照美国Enzo公司提供的试剂盒说明书对其进行定量；SOD活性参照美国Enzo公司提供的试剂盒说明书对其进行测定。

表1(单位：％)

由表1可以得出，实施例3最佳，制备的牡蛎肽的寡聚肽含量、DPPH自由基消除率、ABTS自由基清除率、羟基自由基清除率、血管紧张素转换酶抑制率、促进小鼠性功能活性的效果最优。

对比例：

在实施例3的基础上，设置对比例：

对比例1：加速溶剂提取系统改用磁力搅拌器，其他加工工艺与实施例3相同。

对比例2：酶解时省去深度共晶溶剂，其他加工工艺与实施例3相同。

对比例3：省去高压均质化处理，其他加工工艺与实施例3相同。

测定了对比例制备的牡蛎寡聚肽的寡聚肽含量、DPPH自由基消除率、ABTS自由基清除率、羟基自由基清除率、血管紧张素转换酶抑制率、促进小鼠性功能活性。

具体测定方法与测试例相同，测定结果如表2所示。

表2(单位：％)

由表2可以得出，省略本技术方案中某些制备工艺将使得到的产品性能显著下降。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims

1.一种具有多种生物活性功能的牡蛎寡聚肽粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）牡蛎肉打浆：将新鲜牡蛎肉用去离子水清洗干净，使用破壁机将牡蛎肉打浆；

（2）加速溶剂提取系统提取牡蛎蛋白：将步骤（1）处理得到的牡蛎肉与硅藻土以质量比1:1-6混合，得到混合物；

将该混合物装入含有纤维素过滤器的不锈钢萃取池中；乙醇预先在超声波浴中脱气20-40 min，使用加速溶剂提取系统提取牡蛎蛋白；

步骤（2）中加速溶剂提取系统采用赛默飞Dionex ASE 150，萃取条件为：0-100wt%乙醇、提取温度28-80℃、循环次数1-10、时间3-12分钟，pH值7-12、压力为1000-2000 psi；冲洗率为30-80%；

（3）深度共晶溶剂的制备：将氯化胆碱与溶剂混合在热稳定塑料管中，将试管在温度可调的加热系统中于80-100 ℃孵育，每隔15-25分钟手摇一次，直到观察到均匀透明的液体；然后将样品冷却至室温；

步骤（3）中所述氯化胆碱与溶剂的摩尔比为1:1-6，所述溶剂为乙二醇、尿素、甘油、乙酰胺、葡萄糖、丙二酸中的一种；

（4）牡蛎蛋白酶解：将步骤（3）制备的深度共晶溶剂与去离子水配制为5-20wt%的深共晶水溶液，将步骤（2）得到的牡蛎蛋白按照料液比1:5-15g/ml与该溶液混合，然后添加中性蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解处理；

（5）高压均质化处理：将步骤（4）酶解后的酶解液使用高压均化器处理；

（6）牡蛎寡聚肽的分离纯化：将步骤（5）得到的酶解液首先经过陶瓷膜进行初级过滤，然后把经过初级过滤的清液利用超滤膜进行超滤分级，最后把超滤分级得到的清液利用纳滤设备进行纳滤浓缩，得到的浓缩液即为牡蛎寡聚活性肽浓缩液；

步骤（6）中所述的陶瓷膜的孔径为小于0.2 μm，超滤膜的可通过的分子量为不大于1000 Da，纳滤膜的可通过的分子量为不大于100 Da，牡蛎寡聚活性肽浓缩液的固含物含量大于等于10%；

（7）喷雾干燥制备牡蛎寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤（6）制备的牡蛎寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，经过喷雾干燥后得到牡蛎寡聚活性肽粉。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的牡蛎肉的破壁时间为10-40 min；破壁机型号为九阳高速破壁机L18-Y22A，功率1000W，转速35000转/分。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述的中性蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶的用量分别为0.01-0.5%，百分比以牡蛎蛋白与深共晶水溶液的总质量为基准。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述的酶解反应条件为：pH为7，温度为40-65 ℃，酶解时间1-6 h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述的高压均化器采用中国上海东华机器有限公司的GYB60-6S；均化压力为20-80.0 MPa，加工周期为5-20次。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（7）中所述的喷雾干燥条件为：干燥温度120-200 ℃，喷雾压力10-20 MPa。