CN108277248A - 一种超声波提取沙棘活性多肽的方法 - Google Patents

一种超声波提取沙棘活性多肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，具体制备步骤为：将沙棘籽中加入吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖，初粉碎后超微粉碎得沙棘超微粉；向沙棘超微粉中加入蒸馏水、纤维素酶、植酸酶与单宁酶，水解，灭酶，离心，留取沉淀物质，干燥；向沙棘粉中加入蒸馏水、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和左旋维生素C，超声波辅助提取，灭酶，冷却后的酶解液超滤得沙棘活性多肽粗液；将沙棘活性多肽粗液加入到色谱柱中，用双蒸水洗脱，洗脱液加入到大孔树脂柱，依次用双蒸水和乙醇溶液洗脱，洗脱液干燥得沙棘活性多肽。有益效果为：本发明提取方法简单可行，预处理时间短，沙棘活性蛋白纯度高、提取率高，得到的沙棘活性多肽具有抗菌性和保水性。

Description

一种超声波提取沙棘活性多肽的方法
技术领域
本发明涉及多糖技术领域，尤其是涉及一种超声波提取沙棘活性多肽的方法。
背景技术
沙棘（Sea Buckthorn）又名醋柳，胡颓子科沙棘属，是一种落叶性灌木。国内分布于华北、西北、西南等地。沙棘为药食同源植物。沙棘的根、茎、叶、花、果，特别是沙棘果实含有丰富的营养物质和生物活性物质，可以广泛应用于食品、医药、轻工、航天、农牧鱼业等国民经济的许多领域。沙棘果实入药具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效。现代医学研究，沙棘可降低胆固醇，缓解心绞痛发作，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用。沙棘籽渣为沙棘油加工生产后的废弃物，通常只有少量用作饲料，大部分都是作为垃圾废弃掉。而经过提取沙棘油的沙棘籽渣中的蛋白含量达27-30％，蛋白资源被浪费掉。但是由于沙棘籽中含有有较多的植酸和单宁类物质，可能会影响沙棘巧蛋白的消化吸收，所以要想利用这些蛋白，就应当对沙棘籽渣进行处理后再利用。将蛋白加工成多肽，不但能够提高蛋白质在人体内的消化利用率而且产出的多肽会因选取蛋白质的不同而可能具有某种生理活性，所以利用沙棘籽渣废弃物加工出促进生长发育、抗氧化及抑菌防腐的沙棘多肽。该沙棘多肽可应用于食品添加剂及饲料添加剂。水解沙棘蛋白制备多肽的方式多种多样，主要有酸式水解、碱式水解、蛋白酶水解以及等电渗点解等工艺，随着蛋白水解技术日益完善，将极大地促进蛋白产业的发展。
现有技术如授权公告号为CN 103421873 B的中国发明专利，公开了一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法，步骤包括：将沙棘籽渣经过浸泡处理后，用单宁酶、植酸酶组成的复合酶水解处理沙棘籽渣，再用酸性蛋白酶与木瓜蛋白酶联合水解底物中的蛋白质，将多肽水解液低温静置过夜，然后通过低温高速离心去除大分子杂质，离心上清液浓缩、干燥后得到沙棘籽抑菌多肽。体外抑菌培养试验表明，此多肽对大肠杆菌、沙门氏菌等常见细菌都具有良好的抑制作用。该多肽口感好，没有副作用，可以作为防腐剂添加到食品或饲料中使用。但是该多肽制备方法用时较长，提取效率低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取方法简单可行，预处理时间短，沙棘活性蛋白纯度高、提取率高，得到的沙棘活性多肽具有抗菌性和保水性的超声波提取沙棘活性多肽的方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，包括沙棘超微粉制备、沙棘超微粉预处理、超声波辅助提取、分离纯化，其具体制备步骤为：
沙棘超微粉制备：将沙棘籽中加入吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖，混合均匀，初粉碎至40-80目，然后超微粉碎至500-700目，即得沙棘超微粉，备用，上述吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖的添加量分别为沙棘籽重量的0.2-0.24‰和0.1-0.15‰，吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖的加入能够防止沙棘蛋白在超微粉碎时发生变性，减小沙棘蛋白的损失，且吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖的存在可协助植酸酶与单宁酶快速识别植酸与单宁的位置，进而快速酶解除去沙棘中的纤维素、植酸和单宁类物质，减少沙棘超微粉预处理所需的时间，提高沙棘蛋白溶出率，经过初粉碎能够为超微粉碎提供一定细度的原料，使超微粉碎更加容易进行，提高超微粉碎的工作效率，降低能耗，节约生产能耗和成本，超微粉碎能够破坏沙棘籽的细胞壁，使细胞内蛋白质充分暴露出来，提高了沙棘籽多肽的提取速率；
沙棘超微粉预处理：按料液比为1:5-10（g/mL）向沙棘超微粉中加入蒸馏水，混合均匀，调节pH至4-5，然后按加酶量为0.8-1.2%分别加入纤维素酶、植酸酶与单宁酶，水解1-2h，水解完后90-100℃保温10-20min灭酶，随后在6000-8000r/min的条件下离心10-20min，留取沉淀物质，干燥，备用，上述纤维素酶、植酸酶与单宁酶的重量比为2:0.8-1.0:1.1-1.3，纤维素与半纤维素形成的牢固的空间结构限制了部分蛋白质在水解过程中与底物的接触，植酸和单宁与蛋白质所形成的结构稳定，非常不利于蛋白质的水解，所以蛋白酶水解之前要进行预处理，提高沙棘蛋白溶出率；
超声波辅助提取：按料液比为1:12-17（g/mL）向沙棘超微粉预处理得到的沙棘粉中加入蒸馏水，混合均匀，调节pH至7.5-8.5，然后按加酶量为1.2-1.4%和0.5-1.2%分别加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶，再加入碱性蛋白酶重量3-5%的左旋维生素C，随后在50-60℃、超声波功率为120-150W的条件下超声波辅助提取1.5-2.5h，然后将温度升至90-100℃，保温10-20min进行灭酶，冷却后的酶解液过截留分子量为2-3kDa的超滤膜，收集小于2-3kDa组分，即为沙棘活性多肽粗液，备用，该超声波辅助提取具有收率高，产品成色较好，生产时间短等优点，同时经过内切酶碱性蛋白酶与中性蛋白酶的共同作用，能够使酶切作用位点被完全打开后，使沙棘活性多肽得到有效释放，提高沙棘活性多肽的得率，同时左旋维生素C的加入有助于碱性蛋白酶快速识别丝氨酸位置，将蛋白酶解成小分子的活性多肽，溶于酶解液中，同时能赋予活性多肽具有蛋白质或其组成氨基酸所没有的新功能-保水性，且能够使得到的活性多肽能够用于护肤品领域，进而第一时间被肌肤吸收利用，提高护肤品中多肽的利用率；
分离纯化：按照活性炭色谱柱体积的1:15-20将沙棘活性多肽粗液加入到色谱柱中，用双蒸水洗脱2-3个体积后，收集洗脱液，洗脱液按照大孔树脂柱体积的1:15-20加入到大孔树脂柱，用双蒸水洗脱1-2个体积后，然后用70-80%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经喷雾干燥得沙棘活性多肽，该沙棘活性多肽的纯度高，不仅对葡萄状球菌、链球菌、丙酸菌和棒状杆菌有广谱的抑菌效果，可减少面部痘痘的产生，为易起痘皮肤提供一种新型护肤品，同时该沙棘活性多肽还具有保水作用，能促进细胞生长、分化、增殖，持续滋润皮肤及抗皱抗氧化的功能。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明利用沙棘超微粉进行提取沙棘活性多肽，超微粉碎能够破坏沙棘籽的细胞壁，使细胞内蛋白质充分暴露出来，提高了沙棘籽多肽的提取速率；2）该超声波辅助提取具有收率高，产品成色较好，生产时间短等优点，同时能赋予活性多肽具有蛋白质或其组成氨基酸所没有的新功能-保水性，且能够使得到的活性多肽能够用于护肤品领域，进而第一时间被肌肤吸收利用，提高护肤品中多肽的利用率；3）该制备方法得到的沙棘活性多肽的纯度高，具有抗菌性和保水作用，为易起痘皮肤提供一种新型护肤品，同时还能促进细胞生长、分化、增殖，持续滋润皮肤及抗皱抗氧化的功能。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，包括沙棘超微粉制备、沙棘超微粉预处理、超声波辅助提取、分离纯化，其具体制备步骤为：
1）沙棘超微粉制备：将沙棘籽中加入吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖，混合均匀，初粉碎至80目，然后超微粉碎至500目，即得沙棘超微粉，备用，上述吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖的添加量分别为沙棘籽重量的0.24‰和0.1‰，吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖的加入能够防止沙棘蛋白在超微粉碎时发生变性，减小沙棘蛋白的损失，且吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖的存在可协助植酸酶与单宁酶快速识别植酸与单宁的位置，进而快速酶解除去沙棘中的纤维素、植酸和单宁类物质，减少沙棘超微粉预处理所需的时间，提高沙棘蛋白溶出率，经过初粉碎能够为超微粉碎提供一定细度的原料，使超微粉碎更加容易进行，提高超微粉碎的工作效率，降低能耗，节约生产能耗和成本，超微粉碎能够破坏沙棘籽的细胞壁，使细胞内蛋白质充分暴露出来，提高了沙棘籽多肽的提取速率；
2）沙棘超微粉预处理：按料液比为1:10（g/mL）向沙棘超微粉中加入蒸馏水，混合均匀，调节pH至4，然后按加酶量为1.2%分别加入纤维素酶、植酸酶与单宁酶，水解1h，水解完后100℃保温10min灭酶，随后在8000r/min的条件下离心10min，留取沉淀物质，干燥，备用，上述纤维素酶、植酸酶与单宁酶的重量比为2:1.0:1.1，纤维素与半纤维素形成的牢固的空间结构限制了部分蛋白质在水解过程中与底物的接触，植酸和单宁与蛋白质所形成的结构稳定，非常不利于蛋白质的水解，所以蛋白酶水解之前要进行预处理，提高沙棘蛋白溶出率；
3）超声波辅助提取：按料液比为1:17（g/mL）向沙棘超微粉预处理得到的沙棘粉中加入蒸馏水，混合均匀，调节pH至7.5，然后按加酶量为1.4%和0.5%分别加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶，再加入碱性蛋白酶重量5%的左旋维生素C，随后在50℃下、超声波功率为120W的条件下超声波辅助提取2.5h，然后将温度升至90℃，保温20min进行灭酶，冷却后的酶解液过截留分子量为2kDa的超滤膜，收集小于3kDa组分，即为沙棘活性多肽粗液，备用，该超声波辅助提取具有收率高，产品成色较好，生产时间短等优点，同时经过内切酶碱性蛋白酶与中性蛋白酶的共同作用，能够使酶切作用位点被完全打开后，使沙棘活性多肽得到有效释放，提高沙棘活性多肽的得率，同时左旋维生素C的加入有助于碱性蛋白酶快速识别丝氨酸位置，将蛋白酶解成小分子的活性多肽，溶于酶解液中，同时能赋予活性多肽具有蛋白质或其组成氨基酸所没有的新功能-保水性，且能够使得到的活性多肽能够用于护肤品领域，进而第一时间被肌肤吸收利用，提高护肤品中多肽的利用率；
4）分离纯化：按照活性炭色谱柱体积的1:15将沙棘活性多肽粗液加入到色谱柱中，用双蒸水洗脱3个体积后，收集洗脱液，洗脱液按照大孔树脂柱体积的1:15加入到大孔树脂柱，用双蒸水洗脱2个体积后，然后用70%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经喷雾干燥得沙棘活性多肽，该沙棘活性多肽的纯度高，不仅对葡萄状球菌、链球菌、丙酸菌和棒状杆菌有广谱的抑菌效果，可减少面部痘痘的产生，为易起痘皮肤提供一种新型护肤品，同时该沙棘活性多肽还具有保水作用，能促进细胞生长、分化、增殖，持续滋润皮肤及抗皱抗氧化的功能。
实施例2：
一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，包括沙棘超微粉制备、沙棘超微粉预处理、超声波辅助提取、分离纯化，其具体制备步骤为：
1）沙棘超微粉制备：将沙棘籽中加入吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖，混合均匀，初粉碎至40目，然后超微粉碎至700目，即得沙棘超微粉，备用，上述吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖的添加量分别为沙棘籽重量的0.2‰和0.15‰；
2）沙棘超微粉预处理：按料液比为1:5（g/mL）向沙棘超微粉中加入蒸馏水，混合均匀，调节pH至5，然后按加酶量为0.8%分别加入纤维素酶、植酸酶与单宁酶，水解2h，水解完后90℃保温20min灭酶，随后在6000r/min的条件下离心20min，留取沉淀物质，干燥，备用，上述纤维素酶、植酸酶与单宁酶的重量比为2:0.8:1.3；
3）超声波辅助提取：按料液比为1:12（g/mL）向沙棘超微粉预处理得到的沙棘粉中加入蒸馏水，混合均匀，调节pH至8.5，然后按加酶量为1.2%和1.2%分别加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶，再加入碱性蛋白酶重量3%的左旋维生素C，随后在60℃、超声波功率为150W的条件下超声波辅助提取1.5h，然后将温度升至100℃，保温10min进行灭酶，冷却后的酶解液过截留分子量为3kDa的超滤膜，收集小于2kDa组分，即为沙棘活性多肽粗液，备用；
4）分离纯化：按照活性炭色谱柱体积的1:20将沙棘活性多肽粗液加入到色谱柱中，用双蒸水洗脱2个体积后，收集洗脱液，洗脱液按照大孔树脂柱体积的1:20加入到大孔树脂柱，用双蒸水洗脱1个体积后，然后用80%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经喷雾干燥得沙棘活性多肽。
实施例3：
一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，包括沙棘超微粉制备、沙棘超微粉预处理、超声波辅助提取、分离纯化，其具体制备步骤为：
1）沙棘超微粉制备：将沙棘籽中加入吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖，混合均匀，初粉碎至50目，然后超微粉碎至600目，即得沙棘超微粉，备用，上述吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖的添加量分别为沙棘籽重量的0.22‰和0.12‰；
2）沙棘超微粉预处理：按料液比为1:8（g/mL）向沙棘超微粉中加入蒸馏水，混合均匀，调节pH至4.5，然后按加酶量为1.0%分别加入纤维素酶、植酸酶与单宁酶，水解1.5h，水解完后95℃保温15min灭酶，随后在7000r/min的条件下离心15min，留取沉淀物质，干燥，备用，上述纤维素酶、植酸酶与单宁酶的重量比为2:0.9:1.2；
3）超声波辅助提取：按料液比为1:15（g/mL）向沙棘超微粉预处理得到的沙棘粉中加入蒸馏水，混合均匀，调节pH至8.0，然后按加酶量为1.2%和0.8%分别加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶，再加入碱性蛋白酶重量4%的左旋维生素C，随后在55℃、超声波功率为140W的条件下超声波辅助提取2.0h，然后将温度升至95℃，保温15min进行灭酶，冷却后的酶解液过截留分子量为2.5kDa的超滤膜，收集小于2.5kDa组分，即为沙棘活性多肽粗液，备用；
4）分离纯化：按照活性炭色谱柱体积的1:18将沙棘活性多肽粗液加入到色谱柱中，用双蒸水洗脱2个体积后，收集洗脱液，洗脱液按照大孔树脂柱体积的1:18加入到大孔树脂柱，用双蒸水洗脱2个体积后，然后用75%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经喷雾干燥得沙棘活性多肽。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，包括沙棘超微粉制备、沙棘超微粉预处理、超声波辅助提取、分离纯化，其特征在于：所述沙棘超微粉制备步骤为：将将沙棘籽中加入吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖，混合均匀，初粉碎后超微粉碎，即得沙棘超微粉，备用。
2.根据权利要求1所述的一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，其特征在于：所述吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖的添加量分别为沙棘籽重量的0.2-0.24‰和0.1-0.15‰。
3.根据权利要求1所述的一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，其特征在于：所述沙棘超微粉预处理步骤为：按料液比为1:5-10（g/mL）向沙棘超微粉中加入蒸馏水，混合均匀，调节pH至4-5，然后加入纤维素酶、植酸酶与单宁酶，水解1-2h，灭酶，离心，留取沉淀物质，干燥，备用。
4.根据权利要求3所述的一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，其特征在于：所述加酶量为0.8-1.2%，所述纤维素酶、植酸酶与单宁酶的重量比为2:0.8-1.0:1.1-1.3。
5.根据权利要求1所述的一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，其特征在于：所述超声波辅助提取步骤为：按料液比为1:12-17（g/mL）向沙棘超微粉预处理得到的沙棘粉中加入蒸馏水，混合均匀，调节pH至7.5-8.5，然后加入碱性蛋白酶和中性蛋白酶，再加入左旋维生素C，随后在50-60℃、超声波功率为120-150W的条件下超声波辅助提取1.5-2.5h，灭酶，冷却后的酶解液过截留分子量为2-3kDa的超滤膜，收集小于2-3kDa组分，即为沙棘活性多肽粗液。
6.根据权利要求5所述的一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，其特征在于：所述碱性蛋白酶和中性蛋白酶的加酶量为1.2-1.4%和0.5-1.2%。
7.根据权利要求5所述的一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，其特征在于：所述左旋维生素C的添加量为碱性蛋白酶重量3-5%。
8.根据权利要求1所述的一种超声波提取沙棘活性多肽的方法，其特征在于：所述分离纯化步骤为：按照活性炭色谱柱体积的1:15-20将沙棘活性多肽粗液加入到色谱柱中，用双蒸水洗脱2-3个体积后，收集洗脱液，洗脱液按照大孔树脂柱体积的1:15-20加入到大孔树脂柱，用双蒸水洗脱1-2个体积后，然后用70-80%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，经喷雾干燥得沙棘活性多肽。
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