CN102286584A - 一种天然活性水溶蛋白质和多肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是：一种天然活性水溶蛋白质和多肽及其制备方法。采用精选的天然的富含蛋白质原料，通过研磨制浆，利用蛋白提取剂提取出粗蛋白，利用溶剂简单脱脂，再用酶法精细脱脂，酶法精细脱纤维素，得到精制蛋白浆，然后利用封端剂保护有用蛋白端基、再用局部酸化剂把蛋白长链局部酸化，再用酸性蛋白酶初步酶水解，中性蛋白酶深度酶水解，适时检测水溶性蛋白和多肽分子量、分子量分布和氨基酸含量等控制指标，当控制指标至所需值后，终止酶解反应，然后加入脱味剂脱异味、脱色剂脱色，经过滤器过滤分离，冷冻或喷雾干燥即得到天然活性水溶蛋白和多肽的成品。

Description

一种天然活性水溶蛋白质和多肽及其制备方法

所属领域

本发明属于生物制品新技术，涉及天然活性植物激素、饲料添加剂、食品添加剂、保健品和医疗领域，尤其涉及一种天然活性水溶蛋白质和多肽及其制备方法。

技术背景

1986年的诺贝尔生理学奖颁给了发现多肽生长因子(NGF与EGF)的丽塔·莱维-蒙塔尔奇尼(Rita Levi-Mont.alcini)和斯坦利·科恩(Stanley Co-hen)，表彰他们为基础科学研究开辟了一个具有广泛重要性的新领域。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。伴随着分子生物学、生物化学技术的飞速发展，多肽的研究取得惊人的、划时代的进展，人们发现存在于生物的多肽已有数万种，并且发现所有的细胞都能合成多肽，同时，几乎所有生物的细胞都受多肽调节，涉及激素、神经、细胞生长、生长、生殖等各个领域。

在动物细胞中，按化学本质不同，细胞外第一信使(化学信号)主要包括气体信号分子、有机小分子以及多肽及蛋白质类，其中多肽及蛋白质类信号的种类很多，包括各种神经肽、激素(如胰岛素)及生长因子(如表皮生长因子)等，说明细胞广泛地利用多肽作为第一信使。在医疗和保健方面，活性多肽物质因来源不同，功能上各有差异。象胰岛素样生长因子活性多肽类物质能有效促进皮肤胶原蛋白生成，从而延缓和减少皮肤皱纹产生；大豆多肽消化吸收性好，具有增强免疫、降低胆固醇、抗氧化、降血压和调节胰岛素等作用；蜂毒中含蜂毒素I和II，属于多肽类，在体外有抗血液凝固和防止血栓形成作用。倪莉等研究腐乳中大豆蛋白酶酶解产物主要为分子量小于10,000多肽和氨基酸，它们具有降压作用；管华诗等“对海洋活性多肽进行研究，发现其具有很强抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等功能；宋益民等对蝎毒活性多肽进行分离研究，证实它具有明显改善肠系膜微循环、静脉血流速度及血管口径，增加毛细血管开放数目作用；顾俊峰等按Khanna院士授权使用专利技术从印度引进专用苦瓜种子提取一种降糖多肽，经小鼠实验证明，能使四氧嘧啶所导致高血糖小鼠空腹血糖降低。李峦峰等通过胰蛋白酶水解酪蛋白纯化得到一种具有抗菌活性多肽(Trpi)，研究表明该肽可抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等多种细菌生长。总体来讲，在医学方面活性多肽具有抗肿瘤、抗神经生理活性、抗炎、降压、抗氧化及增强免疫力等功能。

活性多肽还具有降低血压、降脂、减肥、通便，防治心脏病、中风，清洗血管，净化血液，防治血栓的功效；可以促进人体有益菌的生长；可促进人体对大豆所含各种营养的吸收及人体平常所食营养的吸收，并对消化系统未成熟的婴儿，可促进其对各种营养的吸收，促进婴儿生长发育，改善老人因机能退化而引起的机能失调；可强身健体，抵御各种疾病的发生，改善人的亚健康状态。

植物中系统素(Systemin)作为的第1个多肽激素是由Pearce等于1991年在番茄中发现的，植物多肽激素的发现是植物激素研究上的重大突破，为植物激素的进一步深入研究开辟了一条崭新的道路。植物多肽信号分子的发现改变了人们对植物信号调控的传统认识，开辟了植物科学研究的新领域。目前公认的植物多肽激素包括4种：系统素(Systemin)、植物硫肽激素(Phytosulfokine-PSK)、SCR/SPII和CLV3，分别参与了植食性昆虫防御反应、细胞增殖、自交不亲和的识别，以及茎分生组织干细胞分裂与分化平衡的维持。多肽不仅可为植物提供有机态营养成分，而且对于植物的生理调节、细胞组织活化、激活植株分解除草剂和杀虫剂残留活性、降低植物发病指数、提高植物生命力、促进植物对养分的吸收等方面具有明显的效果。尤其在提高肥料和农药等的利用率、提高植物抗逆性、提高植物品质等方面具有显著成效。多肽一定会在高效、低残留、有机、绿色生态农业方面发挥越来越重要的作用。

目前，我国多肽制备研究中还存在以下几个问题：1)水解产物存在苦味。2)水解用蛋白酶种类的选择。3)蛋白酶水解机理研究及过程控制。4)酶法水解产物的精制工艺研究。5)多肽结构与功能之间的关系。

发明内容

为了解决现有多肽存在的问题，本发明的目的是：提供了一种全新结构和概念的多肽的生产方法。既保护了有用的基团，又克服了一般多肽的异味和颜色。

为了达到上述目的本发明的技术方案是：一种天然活性水溶蛋白质和多肽及其制备方法；采用天然的富含蛋白质原料，通过研磨制浆，利用蛋白提取剂提取出粗蛋白，利用溶剂简单脱脂，再用酶法精细脱脂，酶法精细脱纤维素，得到精制蛋白浆，然后利用封端剂保护有用蛋白端基、再用局部酸化剂把蛋白长链局部酸化，再用酸性蛋白酶初步酶水解，中性蛋白酶深度酶水解，适时检测水溶性蛋白和多肽分子量、分子量分布和氨基酸含量等控制指标，当控制指标至所需值后，终止酶解反应，然后加入脱味剂脱异味、脱色剂脱色，经过滤器过滤分离，冷冻或喷雾干燥即得到水溶性蛋白和多肽的成品。

本发明所述的天然活性水溶蛋白质和多肽的原料包括：

富含蛋白质原料：动物皮、鱼皮、蚕蛹、沙蚕、贝类裙边、蚯蚓、蜗牛、豆粨、菜籽饼的至少其中一种，或几种的混合物。

蛋白质提取剂：1％的氢氧化钠溶液、1％的氢氧化钾溶液的至少其中一种。

脱脂剂：环己烷、六号溶剂油、乙醇、甲醇、丙酮的至少其中一种，或几种的混合物。

脱脂酶：解脂假丝酵母脂肪酶。

脱纤维素酶：纤维素酶。

保护性封端改性剂：甲醇、乙醇、碘乙酸、氯乙酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠的至少其中一种。

局部酸化剂：0.03N的盐酸、0.03N的碳酸氢铵的至少其中一种。

酸性蛋白酶：胃蛋白酶、糜蛋白酶的至少其中一种、或两种的混合物。

中性蛋白酶：木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶的至少其中一种、或几种的混合物。

脱色剂：活性碳、活性白土、自制色泽吸附剂的至少其中一种、或几种的混合物。

脱味剂：自制脱味剂A、自制脱味剂B的至少其中一种或两种的混合物。

去离子水。

本发明所述天然活性水溶性蛋白质和多肽的原料规格如下：

本发明所述的天然活性水溶性蛋白质和多肽的各组分的质量配比分数如下：

本发明所述的天然活性水溶性蛋白质和多肽的组分的质量最佳配比分数如下：

本发明所述的天然活性水溶性蛋白质和多肽的工艺流程如下：

天然的富含蛋白质原料——研磨制浆——提取粗蛋白——简单脱脂——酶法脱脂——酶法脱纤维素——封端保护、局部酸化——初步酶水解——深度酶水解——脱苦、脱色——过滤分离——喷雾干燥或冷冻——成品。

本发明所述的天然活性水溶性蛋白质和多肽的具体制造操作方法如下：

(1)取质量配比为100份的天然的富含蛋白质原料，一边加入质量配比200～800份蛋白质提取剂，一边研磨制浆，然后在搅拌的条件下加入反应釜内，加热至40～75℃，反应1h～6h；降温，过滤，取滤液用酸或碱调节pH值至3～4.5，沉淀，倾倒掉上清液，过滤沉淀物，烘干，粉碎制得粗蛋白粉；

(2)在搅拌的条件下，把质量配比为50～250份的脱脂剂和(1)制得的粗蛋白粉加入配有回流装置的反应釜内，加热至60～85℃，反应4h～12h；降温，过滤，烘干，粉碎制得简单脱脂粗蛋白粉；

(3)在搅拌的条件下，加入质量配比为200～1200份的去离子水，和(2)制得的简单脱脂粗蛋白粉，用酸或碱调pH值至6.0～7.5，加热至35～45℃，再加入质量配比为0.01～0.2份的脱脂酶，水解30min～120min，反应结束后，终止酶解反应，得到酶法脱脂粗蛋白浆。

(4)在搅拌的条件下，在(3)得到的酶法精细脱脂粗蛋白浆中加入酸或碱调pH值至4.0～5.5，加入质量配比为0.05～0.5份的纤维素酶，加热至46～55℃，反应1h～6h，反应结束后，终止酶解反应，得到酶法脱脂、脱纤维素的精制蛋白浆；

(5)在搅拌的条件下，在(4)得到的精制蛋白浆中加入质量配比为0.02～0.1份的保护性封端改性剂，质量配比为3～30份的局部酸化剂，加热至70～105℃，反应1h～4h，得到保护性封端、局部酸化的精制蛋白浆；

(6)在搅拌的条件下，将(5)得到的保护性封端、局部酸化的精制蛋白浆降温至35～45℃，加入酸或碱，调节pH至1.5～3.5，加入质量配比为0.02～0.4份酸性蛋白酶，反应1h～4h，制得初步酶解水溶性蛋白和多肽粗液；

(7)在搅拌的条件下，在(6)制得的初步酶解水溶性蛋白和多肽粗液中加入酸或碱，调节pH至6.5～7.5，加热至46～65℃加入质量配比为0.01～0.3中性蛋白酶，继续反应1h～12h，每0.5h取样，检测水溶性蛋白和多肽分子量、分子量分布和氨基酸含量等控制指标，当控制指标至所需值后，终止酶解反应，加入质量配比为2～20份的脱色剂、质量配比为0.5～10份的脱味剂，搅拌0.5h～1.0h然后降温至室温，制得天然活性水溶性蛋白质和多肽粗液；

(8)取(7)制得的酶解水溶性蛋白和多肽粗液，过滤，分装，冷冻保存，即为含水天然活性水溶性蛋白质和多肽产品；

(9)取(7)制得的酶解水溶性蛋白和多肽粗液，过滤，把滤液闪蒸，分装，保存，制得粉状天然活性水溶性蛋白质和多肽产品。

本发明的有益效果

提高了活性水溶蛋白质和多肽的内在质量，而且工艺简单、容易掌握，实用性强。活性多肽具有降低血压、降脂、减肥、通便，防治心脏病、中风，清洗血管，净化血液，防治血栓的功效；可以促进人体有益菌的生长；可促进人体对大豆所含各种营养的吸收及人体平常所食营养的吸收，并对消化系统未成熟的婴儿，可促进其对各种营养的吸收，促进婴儿生长发育，改善老人因机能退化而引起的机能失调；可强身健体，抵御各种疾病的发生，改善人的亚健康状态。农业方面，可以提高肥料和农药等的利用率、提高植物抗逆性、提高植物品质等方面具有显著成效，一定会在高效、低残留、有机、绿色生态农业方面发挥越来越重要的作用。

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要指出的是：实施例对本发明进行只是具体进一步说明，不对本发明的保护范围有限制。

实施例1

本实施例的质量配比分数如下：

天然的富含蛋白质原料：精选家蚕蛹干制品100份；

蛋白提取剂：1％的氢氧化钠溶液800份；

脱脂剂：环己烷250份

去离子水：1000份

脱脂酶：解脂假丝酵母脂肪酶0.01份

脱纤维素酶：纤维素酶0.05份

保护性封端改性剂：碘乙酸0.1份

局部酸化剂：0.03N的盐酸30份

酸性蛋白酶：胃蛋白酶0.4份

中性蛋白酶：木瓜蛋白酶0.3份

脱色剂：活性碳20份

脱味剂：自制脱味剂A5份

本实施例的反应步骤和具体操作如下：

(1)取质量配比为100份的精选家蚕蛹干制品，一边加入质量配比800份的1％的氢氧化钠溶液，一边研磨制浆，然后在搅拌的条件下加入反应釜内，加热至55℃，反应6h；降温，过滤，取滤液用酸或碱调节pH值至3，沉淀，倾倒掉上清液，过滤沉淀物，烘干，粉碎制得粗蛋白粉；

(2)在搅拌的条件下，把质量配比为250份的环己烷和(1)制得的粗蛋白粉加入配有回流装置的反应釜内，加热至85℃，反应12h；降温，过滤，烘干，粉碎制得简单脱脂粗蛋白粉；

(3)在搅拌的条件下，加入质量配比为1000份的去离子水，和(2)制得的简单脱脂粗蛋白粉，用酸或碱调pH值至7.5，加热至45℃，再加入质量配比为0.01份的解脂假丝酵母脂肪酶，水解120min，反应结束后，终止酶解反应，得到酶法脱脂粗蛋白浆。

(4)在搅拌的条件下，在(3)得到的酶法精细脱脂粗蛋白浆中加入酸或碱调pH值至4.0，加入质量配比为0.05份的纤维素酶，加热至46℃，反应6h，反应结束后，终止酶解反应，得到酶法脱脂、脱纤维素的精制蛋白浆；

(5)在搅拌的条件下，在(4)得到的精制蛋白浆中加入质量配比为0.1份的碘乙酸，质量配比为30份的0.03N的盐酸，加热至105℃，反应1h，得到保护性封端、局部酸化的精制蛋白浆；

(6)在搅拌的条件下，将(5)得到的保护性封端、局部酸化的精制蛋白浆降温至35℃，加入酸或碱，调节pH至1.5，加入质量配比为0.4份的酸性蛋白酶，反应4h，制得初步酶解水溶性蛋白和多肽粗液；

(7)在搅拌的条件下，在(6)制得的初步酶解水溶性蛋白和多肽粗液中加入酸或碱，调节pH至7.0，加热至46℃加入质量配比为0.3份的木瓜蛋白酶，继续反应12h，每0.5h取样，检测水溶性蛋白和多肽分子量、分子量分布和氨基酸含量等控制指标，当控制指标至所需值后，终止酶解反应，加入质量配比为20份的活性碳、质量配比为5份的自制脱味剂A，搅拌1.0h然后降温至室温，制得天然活性水溶性蛋白质和多肽粗液；

(8)取(7)制得的酶解水溶性蛋白和多肽粗液，过滤，分装，冷冻保存，即为冷冻天然活性水溶性蛋白质和多肽产品。

实施例2

本实施例的质量配比分数如下：

天然的富含蛋白质原料：精选家蚯蚓干制品100份；

蛋白提取剂：1％的氢氧化钾溶液600份；

脱脂剂：六号溶剂油200份

去离子水：800份

脱脂酶：解脂假丝酵母脂肪酶0.04份

脱纤维素酶：纤维素酶0.02份

保护性封端改性剂：焦亚硫酸钠0.1份

局部酸化剂：0.03N的盐酸20份

酸性蛋白酶：胃蛋白酶0.2份

中性蛋白酶：胰蛋白酶0.1份

脱色剂：自制色泽吸附剂10份

脱味剂：自制脱味剂B 2份

本实施例的反应步骤和具体操作如下：

(1)取质量配比为100份的精选家蚯蚓干制品，一边加入质量配比600份的1％的氢氧化钾溶液，一边研磨制浆，然后在搅拌的条件下加入反应釜内，加热至65℃，反应4h；降温，

过滤，取滤液用酸或碱调节pH值至3，沉淀，倾倒掉上清液，过滤沉淀物，烘干，粉碎制得粗蛋白粉；

(2)在搅拌的条件下，把质量配比为200份的六号溶剂油和(1)制得的粗蛋白粉加入配有回流装置的反应釜内，加热至75℃，反应12h；降温，过滤，烘干，粉碎制得简单脱脂粗蛋白粉；

(3)在搅拌的条件下，加入质量配比为800份的去离子水，和(2)制得的简单脱脂粗蛋白粉，用酸或碱调pH值至7.0，加热至40℃，再加入质量配比为0.04份的解脂假丝酵母脂肪酶，水解100min，反应结束后，终止酶解反应，得到酶法脱脂粗蛋白浆。

(4)在搅拌的条件下，在(3)得到的酶法精细脱脂粗蛋白浆中加入酸或碱调pH值至4.5，加入质量配比为0.02份的纤维素酶，加热至46℃，反应6h，反应结束后，终止酶解反应，得到酶法脱脂、脱纤维素的精制蛋白浆；

(5)在搅拌的条件下，在(4)得到的精制蛋白浆中加入质量配比为0.1份的焦亚硫酸钠，质量配比为20份的0.03N的盐酸，加热至85℃，反应1h，得到保护性封端、局部酸化的精制蛋白浆；

(6)在搅拌的条件下，将(5)得到的保护性封端、局部酸化的精制蛋白浆降温至35℃，加入酸或碱，调节pH至3.0，加入质量配比为0.2份的胃蛋白酶，反应4h，制得初步酶解水溶性蛋白和多肽粗液；

(7)在搅拌的条件下，在(6)制得的初步酶解水溶性蛋白和多肽粗液中加入酸或碱，调节pH至7.0，加热至46℃加入质量配比为0.1份的胰蛋白酶，继续反应12h，每0.5h取样，检测水溶性蛋白和多肽分子量、分子量分布和氨基酸含量等控制指标，当控制指标至所需值后，终止酶解反应，加入质量配比为10份的自制色泽吸附剂、质量配比为2份的自制脱味剂B，搅拌0.5h然后降温至室温，制得天然活性水溶性蛋白质和多肽粗液；

(8)取(7)制得的酶解水溶性蛋白和多肽粗液，过滤，把滤液闪蒸，分装，保存，制得粉状天然活性水溶性蛋白质和多肽产品。

本发明的公开对我国相关的医药品、保健品内在质量的提高起到积极作用，使相关产品可以参与国际市场的竞争，在农业方面，可以提高肥料和农药等的利用率、提高植物抗逆性、提高植物品质，它的推广应用一定会在高效、低残留、有机、绿色生态农业方面发挥越来越重要的作用。

Claims (6)

1.一种天然活性水溶蛋白质和多肽及其制备方法；采用天然的富含蛋白质原料，通过研磨制浆，利用蛋白提取剂提取出粗蛋白，利用溶剂简单脱脂，再用酶法精细脱脂，酶法精细脱纤维素，得到精制蛋白浆，然后利用封端剂保护有用蛋白端基、再用局部酸化剂把蛋白长链局部酸化，再用酸性蛋白酶初步酶水解，中性蛋白酶深度酶水解，适时检测水溶性蛋白和多肽分子量、分子量分布和氨基酸含量等控制指标，当控制指标至所需值后，终止酶解反应，然后加入脱味剂脱异味、脱色剂脱色，经过滤器过滤分离，冷冻或喷雾干燥得到水溶性蛋白和多肽的成品。

2.如权利要求1所述的一种天然活性水溶蛋白质和多肽，其原料如下：天然的富含蛋白质原料；蛋白提取剂；脱脂剂；保护性封端改性剂；局部酸化剂；去离子水；脱脂酶；脱纤维素酶；酸性蛋白酶；中性蛋白酶；脱色剂；脱味剂。

3.如权利要求1或2所述的一种天然活性水溶蛋白质和多肽，其原料配比(按质量计)如下：

4.如权利要求1所述的一种天然活性水溶蛋白质和多肽，原料的较佳配比(按质量计)如下：

5.如权利要求1所述的一种天然活性水溶蛋白质和多肽的制备方法，其工艺流程如下：天然的富含蛋白质原料——研磨制浆——提取粗蛋白——简单脱脂——酶法脱脂——酶法脱纤维素——封端保护、局部酸化——初步酶水解——深度酶水解——脱苦、脱色——过滤分离——喷雾干燥或冷冻——成品。

6.一种天然活性水溶蛋白质和多肽的制造方法如下：

(1)取质量配比为100份的天然的富含蛋白质原料，一边加入质量配比200～800份蛋白提取剂，一边研磨制浆，然后在搅拌的条件下加入反应釜内，加热至40～75℃，反应1h～6h；降温，过滤，取滤液用酸或碱调节pH值至3～4.5，沉淀，倾倒掉上清液，过滤沉淀物，烘干，粉碎制得粗蛋白粉；

(2)在搅拌的条件下，把质量配比为50～250份的脱脂剂和(1)制得的粗蛋白粉加入配有回流装置的反应釜内，加热至60～85℃，反应4h～12h；降温，过滤，烘干，粉碎制得简单脱脂粗蛋白粉；

(3)在搅拌的条件下，加入质量配比为200～1200份的去离子水，和(2)制得的简单脱脂粗蛋白粉，用酸或碱调pH值至6.0～7.5，加热至35～45℃，再加入质量配比为0.01～0.2份的脱脂酶，水解30min～120min，反应结束后，终止酶解反应，得到酶法脱脂粗蛋白浆；

(4)在搅拌的条件下，在(3)得到的酶法精细脱脂粗蛋白浆中加入酸或碱调pH值至4.0～5.5，加入质量配比为0.05～0.5份的纤维素酶，加热至46～55℃，反应1h～6h，反应结束后，终止酶解反应，得到酶法脱脂、脱纤维素的精制蛋白浆；

(5)在搅拌的条件下，在(4)得到的精制蛋白浆中加入质量配比为0.02～0.1份的保护性封端改性剂，质量配比为3～30份的局部酸化剂，加热至70～105℃，反应1h～4h，得到保护性封端、局部酸化的精制蛋白浆；

(6)在搅拌的条件下，将(5)得到的保护性封端、局部酸化的精制蛋白浆降温至35～45℃，加入酸或碱，调节pH至1.5～3.5，加入质量配比为0.02～0.4份酸性蛋白酶，反应1h～4h，制得初步酶解水溶性蛋白和多肽粗液；

(7)在搅拌的条件下，在(6)制得的初步酶解水溶性蛋白和多肽粗液中加入酸或碱，调节pH至6.5～7.5，加热至46～65℃加入质量配比为0.01～0.3中性蛋白酶，继续反应1h～12h，每0.5h取样，检测水溶性蛋白和多肽分子量、分子量分布和氨基酸含量等控制指标，当控制指标至所需值后，终止酶解反应，加入质量配比为2～20份的脱色剂、质量配比为0.5～10份的脱味剂，搅拌0.5h～1.0h然后降温至室温，制得天然活性水溶性蛋白质和多肽粗液；

(8)取(7)制得的酶解水溶性蛋白和多肽粗液，过滤，分装，冷冻保存，即为冷冻天然活性水溶性蛋白质和多肽产品；

(9)取(7)制得的酶解水溶性蛋白和多肽粗液，过滤，把滤液闪蒸，分装，保存，制得粉状天然活性水溶性蛋白质和多肽产品。