CN114196721B - 一种沙棘生物活性肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种沙棘生物活性肽及其制备方法。该制备方法包括：将适度变性的沙棘籽分散液通过纤维素酶、植酸酶、单宁酶进行一次酶解，随后经分离得到残渣沉淀B；将残渣沉淀B加水混合，随后通过中性蛋白酶进行二次酶解，随后经分离得到上清液C；将上清液C通过超滤膜过滤、超滤膜浓缩、微滤、干燥得到沙棘生物活性肽。本发明通过先将纤维素酶、植酸酶、单宁酶混合酶解，去除对水解蛋白酶影响极大的成分，再用中性蛋白酶作用于蛋白，有利于提高沙棘肽的得率；本方法的方法简单，制备条件温和，无需加入除酶以外的添加剂，沙棘生物活性肽收率高，有利于降低成本，具有极大的应用价值。

Description

一种沙棘生物活性肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，尤其是涉及一种沙棘生物活性肽及其制备方法。
背景技术
沙棘主要分布在我国的华北、西北、东北及西南地区，我国沙棘资源丰富，素有“沙棘王国”之称。沙棘具有很高的药用价值，是我国古代蒙医、藏医常用药材，具有祛痰、养胃、活血、健脾、祛癖的药理功效。沙棘中含有多种生物活性物质，例如维生素、黄酮类化合物、三萜及甾类化合物、蛋白质和氨基酸、脂肪酸类、有机酸和糖等。大量研究证明，沙棘中的营养与保健成分对人体的健康有着重要的促进作用。
沙棘果肉、果汁、种子中均含有蛋白质，含量分别为2.89％、0.90％-1.20％、24.38％。与其他植物鲜果对比，沙棘果中蛋白质含量处于较高水平。沙棘籽中含蛋白约25-30％，并且含有18种氨基酸，其中人体所需的8种必需氨基酸和2种半必需氨基酸的含量为42.3％，营养价值较高。沙棘籽蛋白和大豆分离蛋白相比，虽然必需氨基酸含量稍低，但种类之间的构成比例相近。与花生等干果蛋白相比，氨基酸评分在70以上，有利于人体的吸收。从氨基酸组成与配比的角度来看，沙棘籽蛋白是一种较为优秀的蛋白质。过去沙棘籽未能合理的开发利用的主要原因是由于其中的单宁、植酸、纤维素等抗营养物质较多，这些物质可能会影响沙棘籽蛋白的消化吸收，所以要想利用这些蛋白，就应当对沙棘籽渣进行处理后再利用。
目前沙棘籽蛋白提取方法为碱提酸沉法和醇法，有时为提高蛋白提取率还可以两种方法复合提取。但上述方法均存在提取率困难的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提出一种沙棘生物活性肽及其制备方法，解决现有技术中沙棘生物活性肽提取率困难的技术问题。
本发明的第一方面提供一种沙棘生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
将沙棘籽加水混合后经破壁、匀浆得到沙棘籽分散液；
对沙棘籽分散液进行适度变性处理；
将适度变性的沙棘籽分散液通过纤维素酶、植酸酶、单宁酶进行一次酶解，随后经分离得到上清液A和残渣沉淀B；
将残渣沉淀B加水混合，随后通过中性蛋白酶进行二次酶解，随后经分离得到上清液C和残渣沉淀D；
将上清液C通过超滤膜过滤、超滤膜浓缩、微滤、干燥得到沙棘生物活性肽。
本发明的第二方面提供一种沙棘生物活性肽，该沙棘生物活性肽通过本发明第一方面提供的沙棘生物活性肽的制备方法得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
本发明通过先将纤维素酶、植酸酶、单宁酶混合酶解，去除对水解蛋白酶影响极大的成分(如纤维素、植酸、单宁等)，再用中性蛋白酶作用于蛋白，有利于提高沙棘肽的得率；同时，将纤维素酶、植酸酶、单宁酶混合酶解还减少了操作流程和反应时间；本方法的方法简单，制备条件温和，无需加入除酶以外的添加剂，沙棘生物活性肽收率高，有利于降低成本，具有极大的应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例1所得沙棘生物活性肽的抗氧化能力测试图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的第一方面提供一种沙棘生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将沙棘籽加水混合后经破壁、匀浆得到沙棘籽分散液；
S2、对沙棘籽分散液进行适度变性处理；
S3、将适度变性的沙棘籽分散液通过纤维素酶、植酸酶、单宁酶进行一次酶解，随后经分离得到上清液A和残渣沉淀B；
S4、将残渣沉淀B加水混合，随后通过中性蛋白酶进行二次酶解，随后经分离得到上清液C和残渣沉淀D；
S5、将上清液C通过超滤膜过滤、超滤膜浓缩、微滤、干燥得到沙棘生物活性肽。
本发明的步骤S1中，沙棘籽加水混合前，还包括：将沙棘籽粉碎过筛，除去杂质；沙棘籽加水混合过程中，沙棘籽与水的的质量比为1：(5～10)，进一步为1:8；沙棘籽加水混合后，采用破壁机进行破壁，采用匀浆机进行匀浆。
本发明的步骤S2中，适度变性处理的温度为55～65℃，进一步为60℃，时间为2～4h，进一步为3h。通过对沙棘籽分散液进行适度变性处理能够使其能更好的和蛋白酶发生反应，提高收率。
本发明的步骤S3中，纤维素酶、植酸酶、单宁酶的总加入量为沙棘籽总质量的0.1％～5％，进一步为0.5％～2％，更进一步为0.8％～1.2％，更进一步为1％；纤维素酶、植酸酶、单宁酶的质量比为1：(0.1～1)：(0.1～1)，进一步为1：(0.4～0.6)：(0.4～0.6)；更进一步为1：0.5：0.5；一次酶解过程中，控制pH为4～5，一次酶解的温度为40～50℃，一次酶解的时间为2～4h，进一步为2.5～3.5h，更进一步为3h；一次酶解结束后，采用管式离心机离心，离心机转速>20000r/min，离心时间为10～20min，离心温度控制在20～30℃。
本发明的步骤S4中，残渣沉淀B与水的质量比为1：(10～20)，更进一步为1:15；中性蛋白酶的加入量为沙棘籽总质量的0.01％～1％，进一步为0.1％～0.5％，更进一步为0.18％～0.22％，更进一步为0.2％；二次酶解过程中，控制体系pH为6.5～7.5，温度为50～60℃，时间为4～6h，进一步为4.5～5.5h，更进一步为5h；二次酶解结束后，采用管式离心机离心，离心机转速>20000r/min，离心时间为10～20min，离心温度控制在20～30℃。
本发明的步骤S5中，通过超滤膜过滤除去上清液C中残余的酶，同时可以除去大分子色素等杂质，得到稀料液；超滤膜过滤过程中，膜孔径>3000D，例如可以为5000D或者10000D等，控制稀料液及环境温度为20～30℃；采用膜设备浓缩至固形物含量20％以上，除去水和小分子无机盐等，得到浓缩液；超滤膜浓缩过程中，膜孔径为100～300D；通过微滤除去微生物，微滤过程中，将浓缩液过0.22μm的PES滤芯；干燥的方式为喷雾干燥，喷雾干燥过程中，进风温度为180～220℃，进一步为190～210℃，出风温度为80～100℃，进一步为85～95℃。本发明通过采用超滤膜过滤、超滤膜浓缩和微滤对沙棘生物活性肽中进行灭酶、浓缩、除菌的处理，摒弃了常规的高温灭酶及高温浓缩等过程，有利于提高产品纯度。
本发明的第二方面提供一种沙棘生物活性肽，该沙棘生物活性肽通过本发明第一方面提供的沙棘生物活性肽的制备方法得到。
实施例1
(1)将沙棘籽粉碎过筛，除去杂质，加入8倍质量的水，用破壁机进行破壁，随后用匀浆机进行匀浆，得到均一的沙棘籽分散液；
(2)将沙棘籽分散液置于60℃下，保温3h，进行适度变性，使其能更好的和蛋白酶发生反应；
(3)将纤维素酶、植酸酶、单宁酶按2：1：1的质量比加入适度变性的沙棘籽分散液中进行一次酶解，随后采用管式离心机离心，得到上清液A和残渣沉淀B；一次酶解过程中，纤维素酶、植酸酶、单宁酶的总添加量为原料质量的1％，一次酶解过程中维持体系温度为40～50℃，pH为4.0～5.0，一次酶解的时间为3h；离心过程中，离心机转速为25000r/min，离心时间为10min，控制温度为20～30℃；
(4)将残渣沉淀B按照1:15的质量比加水混合，并添加占残渣沉淀B质量0.2％的中性蛋白酶进行二次酶解，随后采用管式离心机离心，得到上清液C和残渣沉淀D；二次酶解过程中，维持体系温度为50～60℃，pH为6.5～7.5，二次酶解的时间为5h；离心过程中，离心机转速为25000r/min，离心时间为10min，控制温度为20～30℃；
(5)将上清液C采用超滤膜过滤(膜孔径为5000D)得到产品稀料液，随后将稀料液采用膜设备(膜孔径200D)浓缩至固形物含量20％以上得到浓缩液，再将浓缩液过0.22μmPES滤芯以除去微生物，最后经喷雾干燥得到固体粉末；喷雾干燥过程中，进风温度为200℃，出风温度为90℃。
实施例2
(1)将沙棘籽粉碎过筛，除去杂质，加入10倍质量的水，用破壁机进行破壁，随后用匀浆机进行匀浆，得到均一的沙棘籽分散液；
(2)将沙棘籽分散液置于55℃下，保温4h，进行适度变性，使其能更好的和蛋白酶发生反应；
(3)将纤维素酶、植酸酶、单宁酶按2：1.2：1.2的质量比加入适度变性的沙棘籽分散液中进行一次酶解，随后采用管式离心机离心，得到上清液A和残渣沉淀B；一次酶解过程中，纤维素酶、植酸酶、单宁酶的总添加量为原料质量的0.5％，一次酶解过程中维持体系温度为40～50℃，pH为4.0～5.0，一次酶解的时间为3.5h；离心过程中，离心机转速为25000r/min，离心时间为10min，控制温度为20～30℃；
(4)将残渣沉淀B按照1:20的质量比加水混合，并添加占残渣沉淀B质量0.5％的中性蛋白酶进行二次酶解，随后采用管式离心机离心，得到上清液C和残渣沉淀D；二次酶解过程中，维持体系温度为50～60℃，pH为6.5～7.5，二次酶解的时间为4.5h；离心过程中，离心机转速为25000r/min，离心时间为10min，控制温度为20～30℃；
(5)将上清液C采用超滤膜过滤(膜孔径为5000D)得到产品稀料液，随后将稀料液采用膜设备(膜孔径200D)浓缩至固形物含量20％以上得到浓缩液，再将浓缩液过0.22μmPES滤芯以除去微生物，最后经喷雾干燥得到固体粉末；喷雾干燥过程中，进风温度为200℃，出风温度为90℃。
实施例3
(1)将沙棘籽粉碎过筛，除去杂质，加入5倍质量的水，用破壁机进行破壁，随后用匀浆机进行匀浆，得到均一的沙棘籽分散液；
(2)将沙棘籽分散液置于65℃下，保温2h，进行适度变性，使其能更好的和蛋白酶发生反应；
(3)将纤维素酶、植酸酶、单宁酶按2：0.8：0.8的质量比加入适度变性的沙棘籽分散液中进行一次酶解，随后采用管式离心机离心，得到上清液A和残渣沉淀B；一次酶解过程中，纤维素酶、植酸酶、单宁酶的总添加量为原料质量的2％，一次酶解过程中维持体系温度为40～50℃，pH为4.0～5.0，一次酶解的时间为2.5h；离心过程中，离心机转速为25000r/min，离心时间为10min，控制温度为20～30℃；
(4)将残渣沉淀B按照1:10的质量比加水混合，并添加占残渣沉淀B质量0.15％的中性蛋白酶进行二次酶解，随后采用管式离心机离心，得到上清液C和残渣沉淀D；二次酶解过程中，维持体系温度为50～60℃，pH为6.5～7.5，二次酶解的时间为5.5h；离心过程中，离心机转速为25000r/min，离心时间为10min，控制温度为20～30℃；
(5)将上清液C采用超滤膜过滤(膜孔径为5000D)得到产品稀料液，随后将稀料液采用膜设备(膜孔径200D)浓缩至固形物含量20％以上得到浓缩液，再将浓缩液过0.22μmPES滤芯以除去微生物，最后经喷雾干燥得到固体粉末；喷雾干燥过程中，进风温度为200℃，出风温度为90℃。
对比例1
(1)将沙棘籽粉碎过筛，除去杂质，加入8倍质量的水，用破壁机进行破壁，随后用匀浆机进行匀浆，得到均一的沙棘籽分散液；
(2)将纤维素酶、植酸酶、单宁酶按2：1：1的质量比加入沙棘籽分散液中进行一次酶解，随后采用管式离心机离心，得到上清液A和残渣沉淀B；一次酶解过程中，纤维素酶、植酸酶、单宁酶的总添加量为原料质量的1％，一次酶解过程中维持体系温度为40～50℃，pH为4.0～5.0，一次酶解的时间为3h；离心过程中，离心机转速为25000r/min，离心时间为10min，控制温度为20～30℃；
(3)将残渣沉淀B按照1:15的质量比加水混合后置于60℃下，保温3h，进行适度变性，使其能更好的和蛋白酶发生反应；
(4)向上述适度变性后的分散液中添加占残渣沉淀B质量0.2％的中性蛋白酶进行二次酶解，随后采用管式离心机离心，得到上清液C和残渣沉淀D；二次酶解过程中，维持体系温度为50～60℃，pH为6.5～7.5，二次酶解的时间为5h；离心过程中，离心机转速为25000r/min，离心时间为10min，控制温度为20～30℃；
(5)将上清液C采用超滤膜过滤(膜孔径为5000D)得到产品稀料液，随后将稀料液采用膜设备(膜孔径200D)浓缩至固形物含量20％以上得到浓缩液，再将浓缩液过0.22μmPES滤芯以除去微生物，最后经喷雾干燥得到固体粉末；喷雾干燥过程中，进风温度为200℃，出风温度为90℃。
试验组1
对上述实施例和对比例所得沙棘生物活性肽的收率进行测试，结果见表1。
表1
收率(％)
实施例1 71.12
实施例2 67.77
实施例3 70.19
对比例1 62.84
通过表1可以看出，本发明实施例1～3所得沙棘生物活性肽具有很高的收率。
试验组2
通过分光光度计法对本发明实施例1所得沙棘生物活性肽的抗氧化能力进行测试，结果见图1。
DPPH·(即，1,1-二苯基-2-苦肼基自由基)，其为稳定的自由基，在甲醇或乙醇溶液中显示为紫色，在517nm有较强的紫外吸收峰。当DPPH·溶液中存在抗氧化剂时，DPPH·中的孤对电子被配对，溶液的颜色由紫色变为黄色，在517nm的吸收值降低。通过DPPH·法对不同沙棘生物活性肽的抗氧化能力进行测试，具体测试过程如下：
(1)将DPPH·溶解至95％乙醇中制成浓度为0.1mmol/L DPPH·(95％乙醇)溶液；
(2)将实施例1的沙棘生物活性肽样品分别用蒸馏水溶解，配制成浓度为0.2～1mg/ml的样品溶液；
(3)将1.5mL蒸馏水加入1.5mL含0.1mmol/L DPPH·的(95％乙醇)中，混匀并在25℃保温30min，在517nm处测量吸光度值，计为A0；将1.5mL样品溶液加入1.5mL 0.1mmol/LDPPH·(95％乙醇)中，混匀并在25℃保温30min，在517nm处测量吸光度值，计为A1；将1.5mL样品溶液加入1.5mL95％乙醇中，混匀并在25℃保温30min，在517nm处测量吸光度值，计为A2。DPPH·清除能力W(％)计算如下：
通过图1可以看出，实施例1所得沙棘生物活性肽的自由基清除率随着浓度的增加变化不大，自由基清除率一直稳定在60％以上，说明沙棘肽的抗氧化能力比较强。
试验组3
对本发明实施例1～3所得沙棘生物活性肽的总黄酮含量进行检测，结果见表2。
黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基。沙棘籽中的黄酮类化合物主要是异鼠李类、槲皮素、山奈酚、杨梅素、芦丁、儿茶素等黄酮苷元及其苷类。总黄酮是产品中起到抗氧化和消除自由基功能的主要有效成分。总黄酮含量的检测方法参考《保健食品功效成分及卫生指标检验规范》附录中保健食品中总黄酮的测定，具体检测过程如下：
绘制芦丁标准曲线：称取5.0mg芦丁，加甲醇溶解并定容至100mL，即得50μg/ml芦丁标准溶液。吸取芦丁标准溶液：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm比色。
试样处理：称取一定量的试样，加乙醇定容至25mL，摇匀后，超声提取20min，放置，吸取上清液1.0mL，于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱，先用20mL苯洗，苯液废去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至25mL。此液于波长360nm测定吸收值。同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮含量。
式中：
X-试样中总黄酮的含量，mg/100g；
A-由标准曲线算得被测液中黄酮量，μg；
M-试样质量，g；
V1-测定用试样体积，mL；
V2-试样定容总体积，mL。
表2
总黄酮含量(ppm)
实施例1 3100
实施例2 2700
实施例3 3000
对比例1 1900
通过表2可以看出，与对比例1相比，本发明实施例1～3的总黄酮含量显著提升。
与现有技术相比，本发明还具有以下有益效果：
沙棘籽中纤维素、植酸、单宁等抗营养物质酶解后，酶解产物可作为饲料有利于禽畜的消化吸收，使得这一优秀蛋白质得到合理利用。
本发明沙棘籽蛋白的开发利用，对促进沙棘资源的深度开发，延伸产业链，促进当地经济林的发展和农民增收致富具有积极的作用；同时对于减少环境污染，促进循环经济和资源再生利用具有良好的促进作用。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种沙棘生物活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
沙棘籽加水混合前，还包括：将沙棘籽粉碎过筛，除去杂质；沙棘籽加水混合过程中，沙棘籽与水的的质量比为1：（5~10），将沙棘籽加水混合后经破壁、匀浆得到沙棘籽分散液；
对所述沙棘籽分散液进行适度变性处理；将沙棘籽分散液置于55~65℃下，保温2-4h，进行适度变性，使其能更好的和蛋白酶发生反应；
将适度变性的所述沙棘籽分散液通过纤维素酶、植酸酶、单宁酶进行一次酶解，所述一次酶解过程中，控制pH为4~5，一次酶解的温度为40~50℃，一次酶解的时间为2~4h，随后经分离得到上清液A和残渣沉淀B；所述纤维素酶、植酸酶、单宁酶的总加入量为沙棘籽总质量的0.1%~5%，且所述纤维素酶、植酸酶、单宁酶的质量比为1：（0.1~1）：（0.1~1）；
将所述残渣沉淀B加水混合，随后通过中性蛋白酶进行二次酶解，随后经分离得到上清液C和残渣沉淀D；所述残渣沉淀B与水的质量比为1：（10~20），所述中性蛋白酶的加入量为沙棘籽总质量的0.01%~1%，所述二次酶解过程中，控制体系pH为6.5~7.5，温度为50~60℃，时间为4~6h；
将所述上清液C通过超滤膜过滤、超滤膜浓缩、微滤、干燥得到沙棘生物活性肽。
2.根据权利要求1所述沙棘生物活性肽的制备方法，其特征在于，所述超滤膜过滤过程中，膜孔径>3000D；超滤膜浓缩过程中，膜孔径为100~300D；微滤过程中，将浓缩液过0.22μm的PES滤芯。
3.根据权利要求1所述沙棘生物活性肽的制备方法，其特征在于，所述干燥的方式为喷雾干燥，喷雾干燥过程中，进风温度为180~220℃，出风温度为80~100℃。
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