CN103937858B - 一种从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，包括如下步骤：（1）加水对裂壶藻藻粕进行浸泡，得到料液；（2）将料液搅拌均匀后进行均质处理；（3）将均质处理后的料液灭菌并调节pH值至7.5－9.5，然后加入蛋白酶，水解至蛋白质水解度为5－10％，灭酶后得到水解液；（4）将水解液进行离心分离，得到上清液A；（5）将上清液A用酒精沉淀，并离心分离，得到上清液B；（6）脱除上清液B中的酒精，得到上清液C；（7）将上清液C浓缩后，加入葡萄糖，反应得到美拉德反应产物；（8）将美拉德反应产物进行喷雾干燥，得到抗氧化剂。本发明以裂壶藻藻粕为原料，生产工艺简单，生产成本低，且制得的抗氧化剂抗氧化活性高、食用安全性高。
Description
技术领域
本发明涉及肽的制备，具体涉及一种从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，即以裂壶藻提取油脂后剩余的藻粕为原料制备抗氧化剂的方法。
背景技术
对含油的食品而言，许多研究表明，所有含油食品的变质都是从脂肪氧化开始的。脂肪氧化方式包括空气氧化、光氧化、酶促氧化、金属催化氧化等。氧化后的油脂具有三大害处：一是出现“哈喇味”等刺激性气味，婴幼儿奶粉出现这种情况时，孩子的直接表现就是拒食，即使勉强食用，也会出现呕吐现象；二是营养价值被破坏，不饱和脂肪酸氧化后不再具有营养价值；三是产生毒性物质，如氢过氧化物、醛类、环氧化物等，这些毒物不仅对生物膜、酶、蛋白质造成破坏，还与人体衰老、致癌、动脉粥样硬化等有关，严重危害人体健康。
对人体而言，正常生理状态下，体内活性氧的生成与清除处于动态平衡，活性氧可维持在有益健康的极低水平。消除活性氧的抗氧化防御体系包括内源性抗氧化系统和外源性抗氧化剂。人体内的天然抗氧化剂主要为还原型谷胱甘肽和肌肽，但含量很低。人体通过摄入适量的外源性抗氧化剂，能够明显降低体内自由基的水平，防止脂质过氧化，预防疾病的发生。
目前使用的外源性抗氧化剂大多为化学合成物，如丁基羟基茴香醚（BHA） 、2,6-二叔丁基对甲基酚（BHT） 等，其抗氧化效果良好，但具有毒副作用，因此这些化学合成物在食品上的应用受到了限制。天然抗氧化剂不仅能够防止食品中油脂体系的氧化，而且可以防止人体内自由基的危害，延缓衰老导致的各种疾病（如癌症、糖尿病等），且无毒副作用，因此，α-生育酚、β-胡萝卜素、黄酮、儿茶素、抗氧化肽等天然抗氧化剂具有良好的市场前景，其中抗氧化肽（即生物活性肽）是现今的研究热点。
抗氧化肽作为一种抗氧化物质，除了具有高的抗氧化活性之外，还具有很高的食用安全性。在食品加工中，通过添加抗氧化肽，能够提高食品的稳定性，延长食品的储藏期；将抗氧化肽用在保健食品和抗氧化药物中，能延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病的发生；在化妆品中适量添加入抗氧化肽，既能起到有效抑制皮肤老化的作用，又能抵抗化妆品自身的氧化，保持其色泽持久。
抗氧化肽的来源包括:（1） 从天然生物体提取；（2） 胃肠道消化蛋白质过程中产生，或体外酶解蛋白质产生；（3） 化学合成、酶法合成或重组DNA 技术合成等。天然生物体中抗氧化肽含量很少、提取困难，因此天然生物体中提取的活性肽不能满足人类大规模的需求。药理级肽常用的化学合成法有副反应发生，这些副产物对人体有害。酶法水解生产抗氧化肽，因具有生产条件温和、安全性高、价廉等优点，是生产抗氧化肽的主流方法。
目前，酶法水解生产抗氧化肽，大多以植物蛋白或动物蛋白为原料，如大豆蛋白、麦胚蛋白、玉米醇溶蛋白等植物蛋白，乳蛋白、鱼类蛋白、卵白蛋白、胶原蛋白等动物蛋白。组成底物蛋白的氨基酸种类、数量及序列皆与其酶解产物中抗氧化肽的含量、组成、活性强弱有着密切联系。至今为止，已发现的抗氧化肽中，所有的氨基酸残基均有参与，其在肽中的位置或在两端或在中间，但不同肽的抗氧化性能不同，肽的抗氧化能力取决于肽的氨基酸组成、肽序及结构，因此，底物蛋白即蛋白原料的选择是能否制备高活性的抗氧化肽的重要因素之一。而且，不同蛋白酶对底物蛋白水解，所得的酶解物的种类和生物活性都是不同的，因此，选用合适的蛋白酶也是能否制备高活性的抗氧化肽的重要因素之一。
抗氧化肽的生产过程中，面临的问题之一是脱盐，因为在酶解过程中需反复调节pH值，导致酶解液中盐的含量较高。虽然酶解可使原先埋藏在蛋白质分子内部的疏水性氨基酸暴露出来，从而使蛋白酶解物从水相通过疏水作用吸附到树脂的疏水表面，并可利用不同浓度洗脱剂的不同极性，对蛋白酶解物进行分级纯化，而蛋白酶解物中的无机盐则因不被树脂吸附，需在水洗脱时去除。但是这些方法工艺复杂，成本很高。
抗氧化肽的生产过程中，面临的另一个问题是纯化。利用膜分离、凝胶层析、离子交换层析及高压液相色谱等方法可对蛋白酶解物中的抗氧化肽进行分离纯化，并利用质谱和氨基酸分析鉴定其氨基酸序列。目前，已确知氨基酸序列的蛋白肽，按蛋白原料的来源区分，有乳清蛋白肽、酪蛋白肽、青鳕肽、鱼皮肽、鱿鱼皮肽、贻贝肽、蓝贝肽、鸡精肽、大豆肽、玉米肽海参肽等；按功能区分，有吗啡活性肽、抗高血压肽、免疫调节肽、抗血栓肽、促进金属离子吸收的肽、抗菌肽、促进细胞生长的肽等。这些已知序列的蛋白肽的氨基酸残基数大多小于20，分子量均较小，且氨基酸序列间几乎无同源性，因而增加了蛋白肽分离纯化的难度，分离纯化成本很高。
综上所述，现有的制备抗氧化肽的方法，存在生产工艺路线复杂、生产成本高的缺陷。另外，制得的抗氧化肽风味较差（尤其是苦味明显）。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，这种方法以裂壶藻提取油脂后剩余的藻粕为原料，生产工艺简单，生产成本低，且制得的抗氧化剂抗氧化活性高、食用安全性高。采用的技术方案如下：
一种从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）以裂壶藻提取油脂后剩余的裂壶藻藻粕为原料，加水对裂壶藻藻粕进行浸泡，得到料液；
（2）将步骤（1）得到的料液搅拌均匀后进行均质处理；
（3）将均质处理后的料液灭菌，并调节料液的pH值至7.5－9.5，然后加入蛋白酶，在搅拌的情况下水解至蛋白质水解度为5－10％，灭酶后得到水解液；
所加入的蛋白酶是碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜酶、Protamex复合蛋白酶和风味酶中的一种或其中两种的组合，蛋白酶的重量是裂壶藻藻粕的2－8%；
（4）将步骤（3）得到的水解液进行离心分离，去除其中不溶解的成分，得到上清液A；
（5）将上清液A用酒精沉淀，并离心分离，得到上清液B；
（6）脱除上清液B中的酒精，得到上清液C；
（7）将上清液C浓缩至固形物含量为20－30%（重量）后，加入葡萄糖，在110－121℃下反应30－60分钟，得到美拉德反应产物；
所加入的葡萄糖的重量是浓缩后的上清液C的1－5%；
（8）喷雾干燥：将美拉德反应产物进行喷雾干燥，得到抗氧化剂。
优选步骤（1）中，所加入的水的重量是裂壶藻藻粕的8－12倍，浸泡时间为30－60分钟。
优选步骤（2）中，均质压力为10－25MPa，均质处理时料液温度为30－70℃。
步骤（3）中，蛋白质的水解度的测定方法为：DH = AN/TN×100% [式中：DH 为氨基酸态氮生成率（%），即水解度；AN 为氨基酸态氮含量（重量）, 用甲醛电位滴定法测定；TN为总氮含量（重量）, 用微量凯氏定氮法测定]。采用水解度（DH）来检测蛋白质酶解反应的进度。
优选步骤（3）中，将均质处理后的料液在85－95℃下灭菌15－30分钟，然后冷却至37－50℃，再调节料液的pH值。
优选步骤（3）中，灭酶温度为85－95℃、灭酶时间为10－15分钟。
步骤（3）中水解时间通常为1－2 小时。
步骤（4）中，水解液中不溶解的成分有纤维素和大分子蛋白等。优选步骤（4）中，以3000－4000转/分钟的转速离心10－15分钟。
步骤（5）中，通过酒精沉淀分离出上清液A中能沉淀的大分子蛋白，得到纯度及澄清度更高的上清液B。优选步骤（5）中，所用酒精浓度为75－85%（重量），所用酒精与上清液A的体积比为1:1－1:2。
优选步骤（5）中，以3000－4000转/分钟的转速离心10－15分钟。
优选步骤（6）中，采用蒸馏方法脱除上清液B中的酒精。
步骤（6）得到的上清液C是氨基酸、寡肽、多肽和蛋白质的混合物，富含抗氧化肽。
步骤（7）中通过美拉德反应，可进一步提高抗氧化肽的抗氧化活性，并可改善抗氧化肽的风味。
优选步骤（7）中，采用真空浓缩方法对上清液C进行浓缩。
裂壶藻是用来生产可促进婴幼儿脑发育和视网膜发育的多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸（DHA）油脂的主要藻类，裂壶藻提取油脂后的副产物即为裂壶藻藻粕。
本发明以裂壶藻提取油脂后的副产物藻粕为原料，通过控制酶解、离心分离、浓缩、美拉德反应、喷雾干燥等步骤，得到源自裂壶藻蛋白的抗氧化剂。本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
1.本发明以裂壶藻提取油脂后的藻粕为原料，裂壶藻藻粕中的蛋白质含量高达40% 以上（干基），有良好的氨基酸组成，有利于获得高活性的抗氧化肽；而且，以裂壶藻提取油脂后的藻粕为原料制备抗氧化肽，实现了资源的充分利用，提高经济效益；
2、本发明选择碱性条件下的蛋白酶（包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜酶、Protamex复合蛋白酶、风味酶），既能快速达到所需要的水解度，又能使产品中的盐分降低，并使产品的抗氧化能力达到要求。
3、本发明通过适当调整pH值的方式和控制合适的水解度，对含盐量进行控制，无需脱盐，简化了工艺，降低了生产成本。
4、本发明利用裂壶藻独有的蛋白组成和结构，通过控制酶解，得到的酶解产物经离心分离、酒精沉淀并再次离心分离后，与葡萄糖发生美拉德反应而得到抗氧化剂产品，无需纯化，简化了工艺，降低了生产成本。
5、利用本发明方法制备的抗氧化剂，水溶性较好，抗氧化活性高，能够有效防止食品的氧化变质，且食用安全性高，具有较佳的风味。
本发明制得的抗氧化剂适合于含油的液态食品、固态或半固态食品，也可用于含油或不含油的化妆品和保健品中，但不适合用于纯油制品中。
具体实施方式
实施例1
本实施例中，从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法包括如下步骤：
（1）以裂壶藻提取油脂后剩余的裂壶藻藻粕为原料，加水对裂壶藻藻粕进行浸泡，得到料液；
本骤（1）中，所加入的水的重量是裂壶藻藻粕的8倍，浸泡时间为60分钟；
（2）将步骤（1）得到的料液搅拌均匀后进行均质处理；
本步骤（2）中，均质压力为10MPa，均质处理时料液温度为70℃；
（3）将均质处理后的料液灭菌（在85℃下灭菌30分钟），然后冷却至37℃，并调节料液的pH值至7.5，然后加入蛋白酶，在搅拌的情况下水解至蛋白质水解度为5％，灭酶后得到水解液（灭酶温度为95℃、灭酶时间为10分钟）；
所加入的蛋白酶是胰蛋白酶，蛋白酶的重量是裂壶藻藻粕的8%；
（4）将步骤（3）得到的水解液进行离心分离（以4000转/分钟的转速离心10分钟），去除其中不溶解的成分（如纤维素和大分子蛋白等），得到上清液A；
（5）将上清液A用酒精沉淀，并离心分离（以4000转/分钟的转速离心10分钟），得到上清液B；
本步骤（5）中，所用酒精浓度为75%（重量），所用酒精与上清液A的体积比为1:1；
（6）采用蒸馏方法脱除上清液B中的酒精，得到上清液C；
（7）将上清液C浓缩至固形物含量为20%（重量）后，加入葡萄糖，在121℃下反应30分钟，得到美拉德反应产物；
所加入的葡萄糖的重量是浓缩后的上清液C的1%；
本步骤（7）中，采用真空浓缩方法对上清液C进行浓缩；
（8）喷雾干燥：将美拉德反应产物进行喷雾干燥，得到抗氧化剂。得到的抗氧化剂的蛋白质含量约为65%。
实施例2
本实施例中，从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法包括如下步骤：
（1）以裂壶藻提取油脂后剩余的裂壶藻藻粕为原料，加水对裂壶藻藻粕进行浸泡，得到料液；
本骤（1）中，所加入的水的重量是裂壶藻藻粕的12倍，浸泡时间为30分钟；
（2）将步骤（1）得到的料液搅拌均匀后进行均质处理；
本步骤（2）中，均质压力为25MPa，均质处理时料液温度为30℃；
（3）将均质处理后的料液灭菌（在90℃下灭菌25分钟），然后冷却至50℃，并调节料液的pH值至9.5，然后加入蛋白酶，在搅拌的情况下水解至蛋白质水解度为10％，灭酶后得到水解液（灭酶温度为85℃、灭酶时间为15分钟）；
所加入的蛋白酶是碱性蛋白酶和Protamex复合蛋白酶的组合（其中碱性蛋白酶与Protamex复合蛋白酶重量相等），蛋白酶的重量是裂壶藻藻粕的2%；
（4）将步骤（3）得到的水解液进行离心分离（以3000转/分钟的转速离心15分钟），去除其中不溶解的成分（如纤维素和大分子蛋白等），得到上清液A；
（5）将上清液A用酒精沉淀，并离心分离（以3000转/分钟的转速离心15分钟），得到上清液B；
本步骤（5）中，所用酒精浓度为75%（重量），所用酒精与上清液A的体积比为1:2；
（6）采用蒸馏方法脱除上清液B中的酒精，得到上清液C；
（7）将上清液C浓缩至固形物含量为30%（重量）后，加入葡萄糖，在110℃下反应60分钟，得到美拉德反应产物；
所加入的葡萄糖的重量是浓缩后的上清液C的5%；
本步骤（7）中，采用真空浓缩方法对上清液C进行浓缩；
（8）喷雾干燥：将美拉德反应产物进行喷雾干燥，得到抗氧化剂。得到的抗氧化剂的蛋白质含量约为68%。
实施例3
本实施例中，从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法包括如下步骤：
（1）以裂壶藻提取油脂后剩余的裂壶藻藻粕为原料，加水对裂壶藻藻粕进行浸泡，得到料液；
本骤（1）中，所加入的水的重量是裂壶藻藻粕的10倍，浸泡时间为45分钟；
（2）将步骤（1）得到的料液搅拌均匀后进行均质处理；
本步骤（2）中，均质压力为20MPa，均质处理时料液温度为45℃；
（3）将均质处理后的料液灭菌（在95℃下灭菌15分钟），然后冷却至40℃，并调节料液的pH值至8.5，然后加入蛋白酶，在搅拌的情况下水解至蛋白质水解度为9.5％，灭酶后得到水解液（灭酶温度为85℃、灭酶时间为15分钟）；
所加入的蛋白酶是木瓜酶和风味酶的组合（木瓜酶与风味酶重量相等），蛋白酶的重量是裂壶藻藻粕的5%；
（4）将步骤（3）得到的水解液进行离心分离（以3500转/分钟的转速离心12分钟），去除其中不溶解的成分（如纤维素和大分子蛋白等），得到上清液A；
（5）将上清液A用酒精沉淀，并离心分离（以3500转/分钟的转速离心12分钟），得到上清液B；
本步骤（5）中，所用酒精浓度为80%（重量），所用酒精与上清液A的体积比为1:1.5；
（6）采用蒸馏方法脱除上清液B中的酒精，得到上清液C；
（7）将上清液C浓缩至固形物含量为25%（重量）后，加入葡萄糖，在121℃下反应45分钟，得到美拉德反应产物；
所加入的葡萄糖的重量是浓缩后的上清液C的2%；
本步骤（7）中，采用真空浓缩方法对上清液C进行浓缩；
（8）喷雾干燥：将美拉德反应产物进行喷雾干燥，得到抗氧化剂。得到的抗氧化剂的蛋白质含量约为66%。
以上实施例1－3的步骤（3）中，蛋白质的水解度的测定方法为：DH = AN/TN×100%[式中：DH 为氨基酸态氮生成率（%），即水解度；AN 为氨基酸态氮含量（重量）, 用甲醛电位滴定法测定；TN 为总氮含量（重量）, 用微量凯氏定氮法测定]。
以下是本发明实施例1－3的抗氧化剂的抗氧化能力的测试：
本发明采用过氧化值和茴香胺值来评价抗氧化剂的抗氧化能力。
根据Arrhenius经验公式，对于正常的化学反应，反应温度每升高10℃，反应速度升高1倍，即K[T+10℃]/K(T)=2(式中的K为反应速度），而反应速度与食品货架寿命成反比，即反应速度常数越大，货架寿命越短，因此有Q(T)/Q(T+10℃)=2（式中Q为食品货架寿命），即有表1数据：
表1
| 温度/℃ | 62 | 52 | 42 | 32 | 22 | 12 |
| 货架寿命/天 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 |
所以用Schaat烘箱法抗氧化性实验，在62℃恒温箱内实验一天相当于15℃时贮藏1个月。
测试方法：
用全脂奶粉为原料，分别添加本发明实施例1－3所制备的抗氧化剂（添加量0.05%，w/w）、BHA、BHT，溶解混合，均质并浓缩、干燥后，得到脂肪含量为25.8 g/100g的五种奶粉样品。另取空白样全脂奶粉（即不添加抗氧化剂的全脂奶粉），作为对照。
将奶粉装于螺口试瓶2/3处，充氮、旋紧，呈密闭状态，置于62℃的恒温箱中，每隔2天，对以上六个奶粉样品分别取样，对其过氧化值、茴香胺值进行测试。
26天的测试结果如表2所示，表2的测试结果表明：本发明实施例1－3的抗氧化剂的抗氧化效果与BHA、BHT（添加量0.05%，w/w）接近，过氧化值pov均为3.2meq/kg，茴香胺值均小于4.8。与此相对照，空白样全脂奶粉26天的测试结果为：过氧化值18.3meq/kg，茴香胺值16.1。
表2
| 空白 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | BHA | BHT | |
| Pov, meq/kg | 18.3 | 3.2 | 3.2 | 3.2 | 3.1 | 2.9 |
| 茴香胺值 | 16.1 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.8 | 4.6 |
由此可见，本发明的抗氧化剂可明显抑制含油食品储存过程中脂肪的氧化。
Claims (10)
1.一种从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）以裂壶藻提取油脂后剩余的裂壶藻藻粕为原料，加水对裂壶藻藻粕进行浸泡，得到料液；
（2）将步骤（1）得到的料液搅拌均匀后进行均质处理；
（3）将均质处理后的料液灭菌，并调节料液的pH值至7.5－9.5，然后加入蛋白酶，在搅拌的情况下水解至蛋白质水解度为5－10％，灭酶后得到水解液；
所加入的蛋白酶是胰蛋白酶，或者是碱性蛋白酶和Protamex复合蛋白酶的组合，或者是木瓜酶和风味酶的组合；蛋白酶的总重量是裂壶藻藻粕的2－8%；
（4）将步骤（3）得到的水解液进行离心分离，去除其中不溶解的成分，得到上清液A；
（5）将上清液A用酒精沉淀，并离心分离，得到上清液B；
（6）脱除上清液B中的酒精，得到上清液C；
（7）将上清液C浓缩至固形物重量百分比含量为20－30%后，加入葡萄糖，在110－121℃下反应30－60分钟，得到美拉德反应产物；
所加入的葡萄糖的重量是浓缩后的上清液C的1－5%；
（8）喷雾干燥：将美拉德反应产物进行喷雾干燥，得到抗氧化剂。
2.根据权利要求1所述的从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，其特征是：步骤（1）中，所加入的水的重量是裂壶藻藻粕的8－12倍，浸泡时间为30－60分钟。
3.根据权利要求1所述的从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，其特征是：步骤（2）中，均质压力为10－25MPa，均质处理时料液温度为30－70℃。
4.根据权利要求1所述的从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，其特征是：步骤（3）中，将均质处理后的料液在85－95℃下灭菌15－30分钟，然后冷却至37－50℃，再调节料液的pH值。
5.根据权利要求1所述的从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，其特征是：步骤（3）中，灭酶温度为85－95℃、灭酶时间为10－15分钟。
6.根据权利要求1所述的从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，其特征是：步骤（4）中，以3000－4000转/分钟的转速离心10－15分钟。
7.根据权利要求1所述的从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，其特征是：步骤（5）中，所用酒精的重量百分比浓度为75－85%，所用酒精与上清液A的体积比为1:1－1:2。
8.根据权利要求1所述的从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，其特征是：步骤（5）中，以3000－4000转/分钟的转速离心10－15分钟。
9.根据权利要求1所述的从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，其特征是：步骤（6）中，采用蒸馏方法脱除上清液B中的酒精。
10.根据权利要求1所述的从裂壶藻藻粕制备抗氧化剂的方法，其特征是：步骤（7）中，采用真空浓缩方法对上清液C进行浓缩。
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