CN109371084B - 一种具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,包括以下步骤:(1)超声辅助纤维素酶与淀粉酶水解;(2)三种蛋白酶复配水解;(3)超滤分离;(4)超声辅助肽与钙离子的螯合,制备得具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙。该具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法工艺简单,可大规模应用于实际生产中,以裂壶藻提取油脂后剩余的藻渣为原料,提高了裂壶藻的资源利用率;采用本发明方法制备的裂壶藻肽螯合钙具有抗氧化与促进钙离子吸收的双重生物活性。
Description
技术领域
本发明属于功能性肽螯合钙离子技术领域,具体涉及一种具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,还涉及由该方法制成的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙。
背景技术
肽-矿物离子螯合物是一种金属有机化合物,它是由矿物离子与肽通过螯合反应制备而得的,其能够借助肽类在机体内的吸收机制提高金属离子的生物利用率,具备无机态金属离子所没有的生理生化特性。目前,以人体必需的微量元素与肽螯合后制得的螯合物已成为一种新型矿物离子补充剂,越来越受到人们的重视。
同时由于特定分子量及氨基酸序列的肽类物质还具有较好的抗氧化活性,因此肽-矿物离子螯合物不仅具有促进矿物离子吸收的活性,还可能具备较高的抗氧化等生物活性,具有很大的研发价值。
近年来,以食源性蛋白为原料采用酶解法制备抗氧化肽已取得了很大的进展,获得了较多具有高抗氧化活性的肽段。但目前关于以裂壶藻提取油脂后剩余的藻渣为原料制备具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,该方法简单方便,易于操作,以裂壶藻提取油脂后剩余的藻渣为原料,提高了裂壶藻资源利用率。
本发明的目的还在于提供上述具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法制成的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的:
一种具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,包括以下步骤:
(1)超声辅助纤维素酶与淀粉酶水解:以裂壶藻提取油脂后剩余的藻渣为原料,用粉碎机将其粉碎成粉末,过80-150目筛备用;将裂壶藻渣粉加水,再同时加入纤维素酶与淀粉酶,在超声波作用下水解,水解后离心,取离心后的沉淀物;
(2)三种蛋白酶复配水解:取离心沉淀物,加水,调节温度为50~65℃,调节pH为6.0-8.0,加入胰蛋白酶、复合蛋白酶、菠萝蛋白酶进行酶解,酶解至水解度为8~20%,灭酶后离心,取上清液,得酶解液;
(3)超滤分离:将酶解液过截留分子量为1~10kDa的超滤膜,取滤过液,得抗氧化肽;
(4)超声辅助肽与钙离子的螯合:在抗氧化肽中加入钙盐,调节pH值为5.0~10.0、温度为35~90℃,在超声波作用下进行螯合反应15~240min后,透析、浓缩和干燥,即得具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙。
在上述具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法中:
步骤(1)中裂壶藻渣粉和水的质量比为1∶5~20。
步骤(1)中所述的纤维素酶与淀粉酶两者复配的质量比为0.5-2,两者添加的总质量为裂壶藻渣粉质量的0.5-5%,调节温度为45~65℃,调节pH为4.5-7.5,水解时间为0.5-3h。
步骤(1)超声处理频率为18-40KHz,超声功率为200-500W,超声作用时间占整个水解时间的20-60%。
步骤(1)中离心时转速为4000~10000r/min,离心时间为10~40min。
步骤(2)中离心后的沉淀物和水的质量比为1∶5~20,胰蛋白酶、复合蛋白酶、菠萝蛋白酶三者复配的质量比为2∶1∶1或1∶2∶1或1∶1∶2或1∶1∶1,三者添加的总质量为裂壶藻渣粉质量的0.5-5%,水解时间为1-8h。
步骤(2)中灭酶时温度为85~100℃,时间为10~30min。
步骤(2)中离心时转速为6000~10000r/min,离心时间为10~40min。
步骤(3)中所述的抗氧化肽的活性测定是采用分光光度计比色法检测各超滤组分的DPPH自由基清除率和OH自由基清除率,自由基清除率最高的超滤组分予以收集,经冷冻或喷雾干燥得抗氧化肽。
步骤(4)中所述的超声处理其作用频率为18-40KHz,超声功率为100-500W。
步骤(4)中所述的钙盐为氯化钙或硫酸钙或磷酸二氢钙,其与抗氧化肽的质量比为1∶1~30。
步骤(4)中所述的透析采用截留分子量为100-300Da的透析袋,透析温度为4℃,时间为1-24h。
步骤(4)中所述的浓缩为真空浓缩,所述的干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的:采用上述一种具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法制成的抗氧化裂壶藻肽螯合钙。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明中的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙同时具有较好的抗氧化活性与促进钙离子吸收的生物活性;
(2)本发明中的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备工艺较为简便,产品安全,可应用于实际生产;
(3)本发明制备抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的原料为裂壶藻提取油脂后剩余的藻渣,提高了裂壶藻的资源利用率。
附图说明
图1为本发明裂壶藻抗氧化肽及其肽钙螯合物的DPPH自由基清除活性;
图2为本发明裂壶藻抗氧化肽及其肽钙螯合物的OH自由基清除活性;
图3为本发明裂壶藻抗氧化肽及其肽钙螯合物的还原力;
图4为未加任何样品的Caco-2细胞样显微镜图;
图5为未添加裂壶藻肽螯合钙样品的H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤样显微镜图;
图6为添加裂壶藻肽螯合钙样品的H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤样显微镜图;
图7为添加裂壶藻肽螯合钙样品对H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤细胞存活率的影响情况图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1
一种具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,包括以下步骤:
(1)以裂壶藻提取油脂后剩余的藻渣为原料,粉碎机粉碎,过120目筛,按照1∶8的料水重量比加水,水温调节至50℃,同时加入纤维素酶与淀粉酶,两者复配的质量比为2∶1,两者添加的总质量为裂壶藻渣粉质量的2%,调节pH为6.0,水解时间为1.5h。在水解过程中辅助以超声处理,超声处理频率为20KHz,超声功率为300W,超声作用时间为0.75h。水解完毕后,以转速为8000r/min离心30min,取离心后的沉淀物;
(2)取离心沉淀物,按照1∶10的料水重量比加水,水温调节至55℃,调节pH为7.5,同时加入胰蛋白酶、复合蛋白酶、菠萝蛋白酶进行酶解,三者复配的质量比为1∶2∶1,三者添加的总质量为裂壶藻渣粉质量的0.8%,酶解至水解度为15%后95℃灭酶15min,再以转速为10000r/min离心20min,取上清液,得酶解液;
(3)将酶解液过截留分子量为1kDa的超滤膜,取滤过液,再予以冷冻或喷雾干燥得抗氧化肽;
(4)在抗氧化肽中加入磷酸二氢钙,其与抗氧化肽的质量比为1∶6,调节pH值为7.0、温度为45℃,同时在超声作用频率为20KHz,超声功率为200W条件下处理60min,再将上述溶液用截留分子量为200Da的透析袋进行透析,透析温度为4℃,时间为12h;
(5)真空浓缩螯合物,喷雾干燥得具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙。
实施例2
一种具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,包括以下步骤:
(1)以裂壶藻提取油脂后剩余的藻渣为原料,粉碎机粉碎,过150目筛,按照1∶12的料水重量比加水,水温调节至60℃,同时加入纤维素酶与淀粉酶,两者复配的质量比为1∶1,两者添加的总质量为裂壶藻渣粉质量的1.5%,调节pH为6.5,水解时间为2h。在水解过程中辅助以超声处理,超声处理频率为30KHz,超声功率为250W,超声作用时间为1h。水解完毕后,以转速为10000r/min离心20min,取离心后的沉淀物;
(2)取离心沉淀物,按照1∶15的料水重量比加水,水温调节至60℃,调节pH为7.0,同时加入胰蛋白酶、复合蛋白酶、菠萝蛋白酶进行酶解,三者复配的质量比为1∶1∶1,三者添加的总质量为裂壶藻渣粉质量的1.5%,酶解至水解度为13%后100℃灭酶10min,再以转速为9000r/min离心25min,取上清液,得酶解液;
(3)将酶解液过截留分子量为3kDa的超滤膜,取滤过液,再予以冷冻或喷雾干燥得抗氧化肽;
(4)在抗氧化肽中加入氯化钙,其与抗氧化肽的质量比为1∶10,调节pH值为7.5、温度为50℃,同时在超声作用频率为20KHz,超声功率为300W条件下处理45min,再将上述溶液用截留分子量为200Da的透析袋进行透析,透析温度为4℃,时间为24h;
(5)真空浓缩螯合物,喷雾干燥得具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙。
实施例3
一种具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,包括以下步骤:
(1)以裂壶藻提取油脂后剩余的藻渣为原料,粉碎机粉碎,过80目筛,按照1∶5的料水重量比加水,水温调节至55℃,同时加入纤维素酶与淀粉酶,两者复配的质量比为1∶2,两者添加的总质量为裂壶藻渣粉质量的3%,调节温度为55℃,调节pH为6.5,水解时间为2.5h。在水解过程中辅助以超声处理,超声处理频率为40KHz,超声功率为400W,超声作用时间为1h。水解完毕后,以转速为10000r/min离心30min,取离心后的沉淀物;
(2)取离心沉淀物,按照1∶15的料水重量比加水,水温调节至60℃,调节pH为8.0,同时加入胰蛋白酶、复合蛋白酶、菠萝蛋白酶进行酶解,三者复配的质量比为1∶1∶2,三者添加的总质量为裂壶藻渣粉质量的2.5%,酶解至水解度为18%后95℃灭酶25min,再以转速为10000r/min离心25min,取上清液,得酶解液;
(3)将酶解液过截留分子量为5kDa的超滤膜,取滤过液,再予以冷冻或喷雾干燥得抗氧化肽;
(4)在抗氧化肽中加入硫酸钙,其与抗氧化肽的质量比为1∶8,调节pH值为7.5、温度为50℃,同时在超声作用频率为30KHz,超声功率为250W条件下处理60min,再将上述溶液用截留分子量为100Da的透析袋进行透析,透析温度为4℃,时间为16h,
(5)真空浓缩螯合物,喷雾干燥得具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙。
性能检测
下面对本发明制得的裂壶藻肽螯合钙组分的抗氧化活性进行测试。
1、裂壶藻酶解物、裂壶藻酶解物经超滤后的小肽组分和裂壶藻肽螯合钙各组分的DPPH自由基清除率、OH自由基清除率和还原力
采用分光光度计比色法检测实施例1中裂壶藻酶解物、裂壶藻酶解物经超滤后的小肽组分和裂壶藻肽螯合钙组分的DPPH自由基清除率和OH自由基清除率,结果见图1-2。(注:SLPH为裂壶藻酶解物;SLPHU为裂壶藻酶解物经超滤后的小肽组分;SLPHU-Ca为裂壶藻肽螯合钙组分。)
由图1可知,SLPH的DPPH自由基半清除率浓度(IC50)为1.33mg/mL,表明其具有较好的清除DPPH自由基能力;SLPHU、SLPHU-Ca的DPPH自由基半清除率浓度(IC50)分别为0.29mg/mL、0.33mg/mL,两者值不存在显著性差异(P>0.05),并显著低于SLPH其值。结果表明:SLPHU、SLPHU-Ca清除DPPH自由基能力显著高于SLPH,同时表明在选定的条件下进行钙离子螯合不会影响SLPHU的抗氧化活性。
由图2可知,SLPH、SLPHU、SLPHU-Ca的羟自由基半清除率浓度(IC50)分别为1.62mg/mL、0.58mg/mL、0.63mg/mL。结果表明:SLPH、SLPHU、SLPHU-Ca三者具有高清除羟自由基的活性,同时SLPHU、SLPHU-Ca清除羟自由基能力要显著高于SLPH;SLPHU与SLPHU-Ca在清除羟自由基活性上不存在显著性差异。
还原力测定方法:取待测样液1mL,加入质量分数1%的铁氰化钾溶液1mL,0.2mol/L磷酸缓冲液(pH 6.6)1mL,混匀后于50℃水浴保温20min,再加入质量分数10%三氯乙酸(TCA)1mL,震荡混匀后离心(10000r/mim,10min)。取上清液1mL,加入1mL去离子水和0.2mL质量分数0.1%的FeCl3溶液,震荡混匀后置于50℃保温10min,体系变为蓝色,再于700nm下测量吸光值,具体结果见图3。(注:还原力是用测得的吸光值表示)
由图3可知,SLPH、SLPHU、SLPHU-Ca的还原力分别为0.18、0.77、0.71。结果表明:SLPHU、SLPHU-Ca的还原力要显著高于SLPH,裂壶藻肽螯合钙后形成的产物SLPHU-Ca仍具有极高的抗氧化活性。
2、裂壶藻肽螯合钙样品对H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤的保护作用
以未加入任何样品的Caco-2细胞为空白组,加入H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤为对照组,同时加入H2O2和实施例1制得的裂壶藻肽螯合钙样品为实验组,其中H2O2的浓度为1mmol/L,检测对照组和实验组对H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤作用情况以及Caco-2细胞存活率,结果见图4-图7。
从图4-6可以看出,对照组加入H2O2后Caco-2细胞的活力显著降低,实验组加入裂壶藻肽螯合钙样品后Caco-2细胞仍然具有较高活力。
从图7可以看出,加入本发明制备的裂壶藻肽螯合钙样品的实验组相较于未加入裂壶藻肽螯合钙样品的对照组,Caco-2细胞经H2O2氧化损伤后其细胞存活率由38.6%提升至79.3%,可见,制得的裂壶藻肽螯合钙样品对H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤,具有较明显保护作用,该裂壶藻肽螯合钙样品具有较好的抗氧化活性。
以上实施例仅本发明的部分实施例,但不能作为对本发明保护范围的限制,任何基于本发明构思基础上作出的改进和变形,均落入本发明的保护范围之内,具体保护范围以权利要求书记载为准。
Claims (10)
1.一种具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,其特征是,包括以下步骤:
(1)超声辅助纤维素酶与淀粉酶水解:以裂壶藻提取油脂后剩余的藻渣为原料,用粉碎机将其粉碎成粉末,过80-150目筛备用;将裂壶藻渣粉加水,再同时加入纤维素酶与淀粉酶,在超声波作用下水解,水解后离心,取离心后的沉淀物;
(2)三种蛋白酶复配水解:取离心沉淀物,加水,调节温度为55~60℃,调节pH为7.0-8.0,加入胰蛋白酶、复合蛋白酶、菠萝蛋白酶进行酶解,酶解至水解度为13~18%,灭酶后离心,取上清液,得酶解液;胰蛋白酶、复合蛋白酶、菠萝蛋白酶三者复配的质量比为1∶2∶1或1∶1∶2或1∶1∶1;
(3)超滤分离:将酶解液过截留分子量为1~5kDa的超滤膜,取滤过液,得抗氧化肽;
(4)超声辅助肽与钙离子的螯合:在抗氧化肽中加入钙盐,调节pH值为7.0~7.5、温度为45~50℃,在超声波作用下进行螯合反应45~60min后,透析、浓缩和干燥,即得具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙。
2.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,其特征是,步骤(1)中所述的纤维素酶与淀粉酶两者复配的质量比为0.5-2,两者添加的总质量为裂壶藻渣粉质量的1.5-3%,调节温度为50~60℃,调节pH为6.0-6.5,水解时间为1.5-2.5h。
3.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,其特征是,步骤(1)超声处理频率为20-40KHz,超声功率为250-400W,超声作用时间占整个水解时间的40-50%。
4.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,其特征是,步骤(2)中离心后的沉淀物和水的质量比为1∶10~15,胰蛋白酶、复合蛋白酶、菠萝蛋白酶三者添加的总质量为裂壶藻渣粉质量的0.8-2.5%,水解时间为1-8h。
5.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,其特征是,步骤(2)中离心时转速为9000~10000r/min,离心时间为20~25min。
6.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,其特征是,步骤(3)中所述的抗氧化肽的活性测定是采用分光光度计比色法检测各超滤组分的DPPH自由基清除率和OH自由基清除率,自由基清除率最高的超滤组分予以收集,经冷冻或喷雾干燥得抗氧化肽。
7.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,其特征是,步骤(4)中所述的超声处理其作用频率为20-30KHz,超声功率为200-300W。
8.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,其特征是,步骤(4)中所述的钙盐为氯化钙或硫酸钙或磷酸二氢钙,其与抗氧化肽的质量比为1∶6~10。
9.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法,其特征是,步骤(4)中所述的透析采用截留分子量为100-200Da的透析袋,透析温度为4℃,时间为12-24h。
10.采用权利要求1-9任一项所述的具有抗氧化活性的裂壶藻肽螯合钙的制备方法制成的抗氧化裂壶藻肽螯合钙。
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