CN103805666B - 一种利用胰酶水解米渣制备抗氧化活性肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用胰酶水解米渣制备抗氧化活性肽的方法，以味精生产副产物大米渣为原料，通过酸洗法浓缩提取米渣蛋白、胰酶水解、离心、超滤、冷冻干燥，得到抗氧化活性肽产品，其酶解条件为将米渣蛋白按质量体积比1:6~1:9加水后，加盐酸调pH值至7.5~8.0，在45~55℃下加入米渣蛋白质量6%~8%的胰酶，酶解5~6h。本发明生产成本低、工艺简便，绿色环保，所得抗氧化活性肽具有合理氨基酸组成、低过敏性、安全可靠等特点，且其总酚含量为34.47mg/g，DPPH自由基和羟自由基的IC50值分别为2.27mg/mL和2.98mg/mL，表明其具有很好的清除能力，因此本发明所得抗氧化活性肽具有较强的抗氧化活性，是一种极具潜力的功能性食品基料。

Description

一种利用胰酶水解米渣制备抗氧化活性肽的方法
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，涉及一种利用胰酶水解米渣制备抗氧化活性肽的方法，具体涉及一种以味精生产副产物大米渣为原料，利用胰酶酶解方法制备抗氧化活性肽产品。
背景技术
米渣是工业生产中大米糖化后产生的副产物，被认为是一种具有很好发展潜力的蛋白质资源。据统计，在味精和葡萄糖生产过程中，每吨大米通过糖化后约能产生0.5吨湿米渣，在中国南方每季度可以产生超过20000吨的米渣。米渣中保留了大米几乎所有的蛋白质，且其蛋白质含量高达600 g/kg（干基），明显高于大豆蛋白含量，可与鱼肉相媲美。米渣富含蛋白质，但是长期以来它主要以低廉的价格卖给饲料厂作为动物饲料而未被充分利用，造成了资源的浪费以及经济损失。因此，与大米相比，廉价而富含蛋白质的米渣更适合作为提取大米蛋白和制备功能产品的理想原料。
在大米糖化的过程中，米渣蛋白往往由于加热和高压处理而变性，导致蛋白质难以提取、溶解度低，限制了它们在食品中的应用。因此，建立一个有效的提取方法，使其既能从米渣中回收这些蛋白质，又能改善其功能性质，对于提高大米蛋白资源在食品工业领域中的应用及发掘其潜在价值是非常重要的。目前国内外研究人员主要应用碱法、酶法、复合法和排杂法这四种方法来提取大米蛋白。其中酶法提取反应条件温和，节省碱和水，对营养成分的破坏较少，并且可以降解蛋白质，提高其功能性质与溶解度，还可产生活性肽。
植物来源的抗氧化肽由于其天然性、高安全性以及高抗氧化活力等特点，已成为国内外研究的热点，在医药、食品领域具有很好的发展前景。目前已有研究人员从大米或米糠中提取抗氧化活性肽，但是关于用米渣制备抗氧化活性肽的报道仍较少。本发明以味精生产副产物大米渣为原料，提供一种利用胰酶水解米渣蛋白制备抗氧化活性肽的方法，有效提高米渣的附加价值，实现米渣的高值化利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用胰酶水解米渣蛋白制备抗氧化活性肽的方法，是以味精生产副产物大米渣为原料，利用胰酶酶解方法制备抗氧化活性肽产品，以实现米渣的高值化利用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用胰酶水解米渣制备抗氧化活性肽的方法，是以味精生产副产物大米渣为原料，通过酸洗法浓缩提取米渣蛋白、胰酶水解、离心、超滤、冷冻干燥，得到抗氧化活性肽产品。
其包括以下步骤：
（1） 酸洗法浓缩提取米渣蛋白：将大米渣按质量体积比1:5～1:6加水，以盐酸调节pH值至3.0~4.0，充分搅拌60min，待蛋白质凝聚沉淀，抽滤得到米渣蛋白；
（2）胰酶水解：将米渣蛋白按质量体积比1:6~1:9加水后，调pH值至7.5~8.0，在45~55℃下加入米渣蛋白质量6%~8%的胰酶，酶活力为4000u/g，酶解5~6h后沸水浴10 min进行灭酶处理，得酶解液；
（3）离心超滤：将酶解液10000 r/min离心10min后取上清液，于0.18MPa、40℃下采用分子量为10kDa的超滤膜进行处理，得到超滤液；
（4）冷冻干燥：将超滤液于-40～-50℃，真空度0~20Pa下进行冷冻干燥，即得到抗氧化活性肽产品。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明制备的抗氧化活性肽总酚含量为34.47 mg/g，对DPPH自由基和羟自由基具有很好的清除能力，IC50值分别为2.27 mg/mL、2.98 mg/mL；10 mg/mL抗氧化活性肽的还原力为1.01，因此具有较强的抗氧化活性。
（2）生物活性肽由于其安全、易吸收、成本低等特点，具有良好的市场前景。本发明采用酶法水解米渣蛋白制备抗氧化活性肽，不仅原料成本低廉，而且所得到的活性肽具有氨基酸组成合理、低过敏性、安全可靠等特点，特别是具有较强的抗氧化性，是极具潜力的一种功能性食品基料。
（3）本发明以味精生产副产物大米渣为原料，提供一种利用胰酶水解米渣蛋白制备抗氧化活性肽的方法，大大提高了米渣的附加值，且生产成本低，工艺简便，绿色环保，实现了米渣的高值化利用，具有很好的应用价值。
附图说明
图1为料液比对本发明方法酶解工艺的影响。
图2为pH值对本发明方法酶解工艺的影响。
图3为温度对本发明方法酶解工艺的影响。
图4为加入胰酶的量对本发明方法酶解工艺的影响。
图5为酶解时间对本发明方法酶解工艺的影响。
图6为不同浓度的米渣蛋白酶解产物的DPPH自由基清除能力。
图7为本发明所得米渣蛋白酶解产物的羟自由基清除能力。
图8为本发明所得米渣蛋白酶解产物的还原力。
具体实施方式
以福建建阳武夷味精厂提供的味精生产副产物米渣为原料；胰酶（4000u/g）购自南宁庞博生物工程有限公司，其主要成分包括羧肽酶A、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。
1、大米渣的预处理
采用酸洗法浓缩提取米渣蛋白。称取1kg大米渣，按质量体积比1:6加入蒸馏水，调节pH值至4.0，充分搅拌60 min，待蛋白质凝聚沉淀后抽滤，得到的滤渣烘干称重，蛋白质含量可达65.9%，比干米渣原料的蛋白质含量提高了14.5%。
2、胰酶酶解工艺的建立
将米渣蛋白按一定量的料液比加水后，调至一定的pH值，在一定温度下加入一定量的胰酶，水解一定时间后，以水解度为指标，对胰酶酶解工艺中的料液比、pH值、温度、加入胰酶的量和酶解时间进行确定。
（1）料液比的确定
在加酶量1%，pH 8.0，温度50℃，酶解时间2h的条件下，如图1所示，随着料液比的增加，水解度先上升后下降，最佳料液比为1∶9（w/v）。
（2）pH值的确定
在料液比1∶9，加酶量1%，温度50℃，酶解时间2h的条件下，如图2所示，酶解最佳pH值为8.0。这是因为米渣蛋白主要是碱溶性蛋白，反应pH值的增加有利于蛋白质的溶出。
（3）温度的确定
在料液比1∶9，加酶量1%，pH8.0，酶解时间2h的条件下，如图3所示，最佳酶解温度为50℃。
（4）加酶量的确定
在料液比1∶9，pH 8.0，温度50℃，酶解时间2h的条件下，如图4所示，最佳加酶量为7%（w/v）。
（5）酶解时间的确定
在料液比1∶9，加酶量7%，pH8.0，温度50℃的条件下，如图5所示，最佳酶解时间为6h。
（6）验证实验
在料液比1∶9，加酶量7%，pH8.0，温度50℃的条件下，酶解6h，米渣蛋白的水解度可达12.22%。
3、米渣蛋白酶解产物的抗氧化活性测定
（1）总酚含量
酚类化合物是肽链易断裂的抗氧化物。样品的总酚含量越高，则其抗氧化活性也就越高。经检测，米渣蛋白酶解产物的总酚含量为34.47 mg/g。
（2）DPPH自由基清除活性
清除稳定的DPPH自由基的能力已被广泛用来测试各种抗氧化物的抗氧化能力。不同浓度的米渣蛋白酶解产物的DPPH自由基清除能力如图6所示，米渣蛋白酶解产物的DPPH自由基清除能力随着浓度的增加而增长。按所得拟合方法y=33.35ln(x)+22.598（R2=0.9916）计算，当酶解产物的浓度达到10 mg/mL时其DPPH自由基清除率可达98.61%，表现出与Vc相似的自由基清除能力。
用IC50值（清除率为50%时的抗氧化剂浓度）来评估清除能力，IC50值越低表示自由基清除能力越高。米渣蛋白酶解产物的IC50值为2.27 mg/mL。
（3）羟自由基清除活性
细胞中发生的许多生化反应均与羟自由基有关，它可导致DNA断裂、突变、脂质氧化、蛋白质变性等多种病理性变化，羟自由基是已知的最强氧化剂。如图7所示，米渣蛋白酶解产物的羟自由基清除能力随着酶解产物浓度的增加而增加。按所得拟合方程y=37.116ln(x)+9.4143（R2=0.9911），当酶解产物浓度为10 mg/mL时米渣蛋白酶解产物的羟自由基清除率为95.17%，表现出与Vc相似的自由基清除能力。米渣蛋白酶解产物的IC50值为2.98 mg/mL。
（4）还原力
还原力被用于评估蛋白质的抗氧化活性是基于它可通过提供一个电子使铁的三价化合物（Fe3+）变成亚铁离子（Fe2+），并可用分光光度计在700nm处检测亚铁离子（Fe2+）的形成。如图8所示，米渣蛋白酶解产物的还原力随浓度的增加而增加，按所得线性方程y=0.0893x+0.1427（R2=0.9943）计算，10 mg/mL酶解物的还原力1.01。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1. 一种利用胰酶水解米渣制备抗氧化活性肽的方法，其特征在于：以味精生产副产物大米渣为原料，通过酸洗法浓缩提取米渣蛋白、胰酶水解、离心、超滤、冷冻干燥，得到抗氧化活性肽产品；
其包括以下步骤：
（1）酸洗法浓缩提取米渣蛋白：将大米渣按质量体积比1:5～1:6加水，以盐酸调节pH值至3.0~4.0，充分搅拌60min，待蛋白质凝聚沉淀，抽滤得到米渣蛋白；
（2）胰酶水解：将米渣蛋白按质量体积比1:6~1:9加水后，调pH值至7.5~8.0，在45~55℃下加入米渣蛋白质量6%~8%的胰酶，酶活力为4000u/g，酶解5~6h后沸水浴10 min进行灭酶处理，得酶解液；
（3）离心超滤：将酶解液10000 r/min离心10min后取上清液，于0.18MPa、40℃下采用分子量为10kDa的超滤膜进行处理，得到超滤液；
（4）冷冻干燥：将超滤液于-40～-50℃，真空度0~20Pa下进行冷冻干燥，即得到抗氧化活性肽产品。
2. 根据权利要求1所述的利用胰酶水解米渣制备抗氧化活性肽的方法，其特征在于：所述胰酶水解是将米渣蛋白按质量体积比1:9加水后，加盐酸调pH值至8.0，在50℃下加入米渣蛋白质量7%的胰酶，酶解6h后得酶解液。
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