CN102154423B - 一种紫菜活性肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种紫菜活性肽的制备方法，其特征在于：它以条斑紫菜为原料，烘干后粉碎取150-200目部分，按照原料与水重量体积比1:100g/mL向原料中加水并混合均匀；然后将料液放入超声波细胞粉碎机破碎处理，离心得上清液；取上清液调节pH至7.0，加入木瓜蛋白酶酶解，灭活后冷却、离心得酶解液；将酶解液超滤，滤液经浓缩、真空冷冻干燥，即得紫菜活性肽冻干品。本发明制备工艺更为合理，工艺简单，可操作性强，提取率高，所制得的紫菜活性肽杂质少，生物活性也得到最大程度的保留。

Description

一种紫菜活性肽的制备方法
技术领域
 本发明涉及一种活性肽的制备方法，特别是一种紫菜活性肽的制备方法。
背景技术
公开号为CN1687444、申请号为CN200510038532.5的中国公开专利文献公开了一种“利用酶-膜耦合技术制备紫菜降血压肽的方法及其用途”，该技术为酶-膜耦合技术制备紫菜降血压肽的方法，选用的蛋白酶为胰蛋白酶、复合蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶以及由其构成的复合酶。该发明的核心技术为酶-膜耦合技术，产品产量得到提高，但是也存在着操作复杂，在实际生产中难以实现的缺陷，与本发明使用的木瓜蛋白酶不同。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法更为合理、可操作性强的紫菜活性肽的制备方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种紫菜活性肽的制备方法，其特点是，其步骤如下：
（1）以条斑紫菜（Porphyra yezoensis）为原料，烘干后粉碎，过筛，取150-200目部分，按照原料与水重量体积比1:100 g/mL向原料中加水并混合均匀；然后将料液放入超声波细胞粉碎机破碎处理，超声波功率650W，空化比为30%，料液温度保持在50℃，破碎处理时间为15min；将超声波处理后的物料在离心机上4000r/min离心10min，得上清液；
（2）取上清液用1mol/L NaOH调节pH至7.0，按照原料条斑紫菜重量的1%加入酶活力为3×105U/g的木瓜蛋白酶，充分混合均匀后置于55℃的水浴中水解，每间隔20min搅拌振荡一次，反应过程中监测pH的变化，适时加入NaOH或HCl调整pH，保持pH为7.0，持续水解5小时；酶解结束后，加热升温到100℃并保持10min，破坏木瓜蛋白酶的活性，冷却，在8000r/min的离心机中离心15min，所得上清液即酶解液；
（3）将酶解液通过1×105Da分子量的超滤膜，去除残留的生物大分子物质和杂质，滤液经浓缩、真空冷冻干燥，即得紫菜活性肽冻干品。
本发明活性肽生物活性的定量如下。将本发明方法制得的活性肽冻干品分别用于测定抗氧化活性和降血压活性，羟自由基清除率采用活性肽对Fenton体系产生羟自由基的清除实验法，二苯代苦味酰基自由基清除率采用体外实验测定法，体外降血压活性的测定采用紫外比色法用血管紧张素转换酶（ACE）的抑制率来表示，相对分子质量分布采用凝胶层析法测定。测定结果表明，其清除羟自由基时的IC50值（清除率为50%的活性肽浓度）为0.397mg/mL，清除二苯代苦味酰基自由基时的IC50值为0.423 mg/mL，抑制血管紧张素转化酶的半抑制浓度IC50值为4.48mg/mL，活性肽的相对分子量主要分布于1000-2000Da之间，属小分子肽类。
本发明是木瓜蛋白酶法制备活性肽的技术，其技术特征为制备工艺和工艺参数的掌握。主要表现在技术路线简单，使用的超声处理、离心分离、酶水解、浓缩、冻干等方法，在实验室以及实际工业生产中容易实现；本发明工艺参数为实现上述处理方法时的最佳工艺条件，经过了实验室的大量实验而得到的，得到了多次验证实验的证实，数据真实、可靠。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）它解决了活性肽制备过程中紫菜粉碎颗粒细度的问题，经过试验研究证实应该以150-200目的颗粒细度最佳。紫菜颗粒过大，紫菜细胞中的水溶性蛋白质不易提取，得率显著下降且提取时间显著延长；颗粒太小，后续的离心分离困难，得到蛋白质溶液中杂质含量较高。
（2）本发明所述的超声波处理有效地破坏紫菜的细胞壁，使细胞内的水溶性蛋白质充分溶出，按照本方案超声波处理的条件来处理料液，显著提高了蛋白质的提取率。经实验测算，本发明超声处理方法及工艺参数使蛋白质的提取率高达39.5%，比常规的提取率25%提高了近15个百分点。
（3）在作用于不同的底物（本发明的底物即为紫菜）时，木瓜蛋白酶的水解条件是不同的，本发明进一步优化了紫菜作为水解底物时的水解条件，可以得到最大的水解效果，同时其生物活性也得到最大程度的保留。
（4）经过分析测定，本发明制备的紫菜活性肽在清除羟自由基和二苯代苦味酰基自由基方面效果良好，清除羟自由基的能力高于阳性对照的VC，清除二苯代苦味酰基自由基的能力与阳性对照的BHT（二丁基羟基甲苯）相当；同时，也具有良好的降血压活性。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1。一种紫菜活性肽的制备方法，其步骤如下：
（1）以条斑紫菜为原料，烘干后粉碎，过筛，取150-200目部分，按照原料与水重量体积比1:100 g/mL向原料中加水并混合均匀；然后将料液放入超声波细胞粉碎机破碎处理，超声波功率650W，空化比为30%，料液温度保持在50℃，破碎处理时间为15min；将超声波处理后的物料在离心机上4000r/min离心10min，得上清液；
（2）取上清液用1mol/L NaOH调节pH至7.0，按照原料条斑紫菜重量的1%加入酶活力为3×105U/g的木瓜蛋白酶，充分混合均匀后置于55℃的水浴中水解，每间隔20min搅拌振荡一次，反应过程中监测pH的变化，适时加入NaOH或HCl调整pH，保持pH为7.0，持续水解5小时；酶解结束后，加热升温到100℃并保持10min，破坏木瓜蛋白酶的活性，冷却，在8000r/min的离心机中离心15min，所得上清液即酶解液；
（3）将酶解液通过1×105Da分子量的超滤膜，去除残留的生物大分子物质和杂质，滤液经浓缩、真空冷冻干燥，即得紫菜活性肽冻干品。

Claims (1)

1.一种紫菜活性肽的制备方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）以条斑紫菜为原料，烘干后粉碎，过筛，取150-200目部分，按照原料与水重量体积比1:100 g/mL向原料中加水并混合均匀；然后将料液放入超声波细胞粉碎机破碎处理，超声波功率650W，空化比为30%，料液温度保持在50℃，破碎处理时间为15min；将超声波处理后的物料在离心机上4000r/min离心10min，得上清液；
（2）取上清液用1mol/L NaOH调节pH至7.0，按照原料条斑紫菜重量的1%加入酶活力为3×105U/g的木瓜蛋白酶，充分混合均匀后置于55℃的水浴中水解，每间隔20min搅拌振荡一次，反应过程中监测pH的变化，适时加入NaOH或HCl调整pH，保持pH为7.0，持续水解5小时；酶解结束后，加热升温到100℃并保持10min，破坏木瓜蛋白酶的活性，冷却，在8000r/min的离心机中离心15min，所得上清液即酶解液；
（3）将酶解液通过1×105Da分子量的超滤膜，去除残留的生物大分子物质和杂质，滤液经浓缩、真空冷冻干燥，即得紫菜活性肽冻干品。
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