CN103468774B

CN103468774B - 一种从紫菜酶解产物中分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法

Info

Publication number: CN103468774B
Application number: CN201310422683.5A
Authority: CN
Inventors: 田亚平; 周锋; 潘红阳; 刘冬冬
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Nantong Chitsuru Foods Co., Ltd.
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2033-09-17
Also published as: CN103468774A

Abstract

一种从紫菜酶解产物中分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，属于生物制品分离纯化技术领域。本发明涉及复配可控酶解成本低廉的末水条斑紫菜，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂粗品。该粗品利用SP Sepharose High Performance 阳离子交换层析、Sephadex G-10 凝胶层析和Mono Q 阴离子交换层析分离纯化，所得对α-葡萄糖苷酶的高抑制活性部分(LGI)用反相高效液相及超高效液相色谱-质谱法分析其纯度和主要组成。LGI对α-葡萄糖苷酶的IC₅₀值为97.36μg/mL，有较好的温度和pH稳定性：80℃水浴7h抑制活性保持在80%以上，在pH3~12的缓冲液中50℃保温2h抑制活性仍保持在87%以上。LGI分子量较小，稳定性好，成本低、应用安全，在医药和食品等领域有较广泛的应用前景。

Description

一种从紫菜酶解产物中分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法

技术领域

一种从紫菜酶解产物中分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，属于生物制品分离纯化技术领域。

背景技术

糖尿病是一种常见的由生活环境和遗传因素等引起，以高血糖为特征的内分泌代谢疾病。根据世界卫生组织（WTO）统计，全球约有3.5亿多人饱受糖尿病痛苦的折磨，我国糖尿病人约占全世界糖尿病人口的三分之一，预计到2025年人数将增加一倍。糖尿病及其并发症已经成为继肿瘤和心血管疾病之后人类第三大杀手。医学界通常将其分为两大类：Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。糖尿病的发病机制尚未阐述全面，但主要原因可以归结为胰岛素的分泌异常，临床上主要表现为三多一少的症状。目前糖尿病基本无法治愈，主要通过控制血糖在一个良好的水平，有效减少糖尿病病人的并发症。

α-葡萄糖苷酶（简称，EC 3.2.1.20）为一种低聚糖水解酶，在细胞外主要作用于多糖末端的非还原性α-葡萄糖苷键，产生α-D-葡萄糖。通常把它归为淀粉水解酶中的第三类，是人类在体内水解淀粉等糖类物质的关键酶，并作为医学上治疗糖尿病的重要标靶。α-葡萄糖苷酶抑制剂是上个世纪末出现的一类治疗糖尿病的新型降血糖药物，主要作用机制是通过竞争性抑制小肠上段细胞表面的α-葡萄糖苷酶活性，减缓碳水化合物的分解吸收，增强对胰岛素刺激作用的敏感性并减少胰腺刺激的作用，进而达到降低餐后血糖和治疗糖尿病的目的。目前已被用作Ⅱ型糖尿病的抑制糖苷酶水解的临床药物有：阿卡波糖( Acarbose )、伏格列波糖( Voglibose )、乙格列酯( Emiglitate )、米格列醇( Miglitof )等。国内对α-葡萄糖苷酶抑制剂药物的需求量巨大，主要依靠进口，但来源稀少，价格昂贵，给广大糖尿病患者带来了沉重的经济压力。所以迫切需要来源广泛，价格低廉的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物。我国海洋资源丰富，充分利用海洋资源研发α-葡萄糖苷酶抑制剂意义重大。

紫菜( Porphyra yezoensis )为红藻门、原红藻纲、红毛菜科、紫菜属，具有很高的食用和药用价值，可以治疗甲状腺肿大，降低胆固醇和预防动脉粥样硬化。我国紫菜原料来源广泛，优质紫菜主要用于制成海苔等休闲食品，末水紫菜口感差，售价很低，但其蛋白质含量仍然在37%左右、另外还含有多糖、纤维、VC、各种矿物质等。继续对低值末水紫菜进行综合利用和深加工具有深远意义。

紫菜经过酶解的产物主要以小分子紫菜多肽为主，附带有多种功效成分共存的蛋白质。这些物质对人体有多方面的生理功能，在医疗卫生，食品保健，食品加工等领域具有广阔的开发潜能，为紫菜的深加工指明了方向，扩大了紫菜的应用前景。

发明内容

本发明目的是提供一种从紫菜酶解产物中分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，从天然产物中分离出一种天然α-葡萄糖苷酶抑制剂，该方法操作简单、安全性高，成本低。

本发明的技术方案：一种从紫菜酶解产物中分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，步骤为：

（1）α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取：

(a) 末水条斑紫菜：启东市海鲜市场。

(b) 沸水浴热处理：末水条斑紫菜研磨成粉后，以pH7.0 Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液为介质，底物与缓冲液的质量比为1:25～33，沸水浴热处理15 min。

(c) 复配酶解紫菜：加入中性蛋白酶( E/S=8×10⁴ U/g )，50℃水解7 h，沸水浴灭酶15 min；调节pH8.5，加入固体氨肽酶( E/S=28 U/g )和碱性蛋白酶( E/S=8×10⁴ U/g )，50℃水解3 h，沸水浴灭酶15 min；加入乙醇至终浓度为60%。室温静置过夜，8000 r/min离心10 min，得到的上清液为含α-葡萄糖苷酶抑制剂的混合物。

（2）α-葡萄糖苷酶抑制剂分离纯化：将含α-葡萄糖苷酶抑制剂的混合物通过活性炭脱色，再将该活性炭脱色液依次经过SP Sepharose High Performance 阳离子交换层析、Sephadex G-10凝胶层析和Mono Q 阴离子交换层析进一步分离纯化后，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。

(d) SP Sepharose High Performance 阳离子交换层析：将含抑制剂的上清液混合物通过活性炭脱色后，用1mL的预装柱SP Sepharose High Performance 阳离子交换层析进行分离纯化。平衡缓冲液A为pH3.0的10 mmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。洗脱缓冲液B为pH3.0的10 mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液( 含2 mol/L NaCl溶液 )。洗脱方式：首先用平衡缓冲液A平衡8个柱体积，上样后用平衡缓冲液A洗脱3个柱体积，随后进行0~30%洗脱缓冲液B洗脱12个柱体积；流速：1 mL/min；检测波长：220 nm。收集活性较高的活性峰3，冷冻干燥，结果如图1。

(e) Sephadex G-10凝胶层析：取离子交换层析分离样品溶解在超纯水中，配制浓度10 mg/mL，用0.22 μm的针头过滤器过滤备用。用超纯水平衡Sephadex G-10凝胶层析柱后，进样品1 mL，用超纯水进行洗脱。检测波长为220 nm，洗脱液流速为0.5 mL/min。收集活性较高的峰组分2，冷冻干燥，结果如图2。

(f) Mono Q 阴离子交换层析：将Sephadex G-10凝胶层析分离活性成分溶解于pH8.5的10 mmol/L的Tris-HCl中，配制浓度为1 mg/mL。利用Mono Q 阴离子交换层析进一步分离纯化。平衡缓冲液C为pH8.5 Tris-HCl，洗脱液D为分别含40 mmol/L NaCl、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl及0.9 mol/L NaCl的pH8.5的10 mmol/L Tris-HCl缓冲液，流速0.5 mL/min，检测波长为220 nm，收集活性较高活性峰组分4，冷冻干燥，结果如图3。

反相高效液相（RP-HPLC）测定其纯度后，超高效液相色谱-质谱法（Q-TOF-MS）分析鉴定其为小分子多肽。

（3）紫菜酶解产物纯化所得α-葡萄糖苷酶抑制剂的稳定性

紫菜酶解产物纯化所得α-葡萄糖苷酶抑制剂分别在60℃、70℃及80℃的水浴环境中放置7 h，立即用冰水冷却，其抑制活性均保持在80%以上，温度耐受性较好，结果如图4。此抑制剂经过pH3~12不同酸碱中50℃处理2 h，对α-葡萄糖苷酶抑制活性仍然保持87%以上，pH耐受性较好。

（4）测定样品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制活性

采用对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷( pNPG )法。首先取70 μL待测样品加入1.5 mL的离心管中，接着加入70 μL的6 mg/mL的α-葡萄糖苷酶，混合均匀后于水浴锅37℃保温20 min，再加入70 μL的10 mmol/L的对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷继续反应1 h，然后加入70 μL的1 mol/L Na₂CO₃终止反应。用酶标仪在405 nm处测定吸光度Ai；另取70 μL待测样品加入1.5 mL的离心管中，接着加入70 μL的6 mg/mL的α-葡萄糖苷酶，混合均匀后于水浴锅37℃保温20 min，加入70 μL的pH6.8磷酸钾缓冲液( 20 mmol/L )反应1 h，操作同上，吸光值为Aj；取70 μL缓冲液加入1.5 mL的离心管中，操作同上，吸光值为Ao，样品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率的公式：

清除率=(1－ )×100

式中：A_i———加入抑制剂的吸光值；

A_j———背景颜色对照的吸光值；

A_o———不加抑制剂的吸光值。

酶活力单位定义：在37℃，pH6.8条件下，1 min内水解对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)释放1 μmol对硝基酚(PNP)所需的酶量为一个活力单位( U )。

抑制单位定义：依上述方法，在相同条件下降低1个酶活力单位所需的抑制剂量。抑制率=[( 抑制前酶活－抑制后酶活 )/抑制前酶活]×100%，规定在上述条件下，对α-葡萄糖苷酶抑制率达5%的抑制活性为一个抑制单位(IU)。

IC₅₀值定义：在最适条件下，对一定量α-葡萄糖苷酶活性抑制率达50%时的抑制剂添加量，LGI对α-葡萄糖苷酶的IC₅₀值为97.36 μg/mL。

本发明的有益效果：本发明采用中性蛋白酶，碱性蛋白酶和枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶分步复合酶解末水条斑紫菜产α-葡萄糖苷酶抑制剂，有效利用海洋资源，防止资源浪费，变废为宝。通过阳离子交换层析、凝胶层析和阴离子交换层析三步组合的分离步骤从中分离出纯度较高的α-葡萄糖苷酶抑制剂。该α-葡萄糖苷酶抑制剂分子量小，稳定性高。对人体有多方面的生理功能，也有在医疗卫生，食品保健，食品加工的领域的开发潜能，为紫菜的深加工指明了方向，扩大了紫菜的应用前景。

附图说明

图1紫菜酶解液的SP Sepharose High Performance 阳离子交换色谱图。

图2紫菜酶解液的Sephadex G-10凝胶层析色谱图。

图3紫菜酶解液的Mono Q 阴离子交换色谱图。

图4酶解紫菜α-葡萄糖苷酶抑制剂温度的稳定性。

图5紫菜酶解产物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备流程示意图。

具体实例方式

实施例1

以烘干至恒重的末水条斑紫菜粉末3 g为底物，以pH7.0 Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液为介质，底物与缓冲液的比例为1:33，沸水浴热处理15 min。加入中性蛋白酶( E/S=8×10⁴U/g )，50℃水解7 h，沸水浴灭酶15 min；调节pH8.5，加入固体氨肽酶( E/S=28 U/g )和碱性蛋白酶( E/S=8×10⁴U/g )，50℃水解3 h，沸水浴灭酶15 min，加入乙醇至终浓度为60%。室温静置过夜，8000 r/min离心10 min，得到的上清液为含α-葡萄糖苷酶抑制剂的混合物。将含抑制剂的紫菜上清液混合物通过活性炭脱色后，经1 mL预装柱SP Sepharose High Performance 阳离子交换层析分离纯化。平衡缓冲液A为pH3.0的10 mmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。洗脱缓冲液B为pH3.0的10 mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液( 含2mol/L NaCl溶液 )。洗脱方式：首先用平衡缓冲液A平衡8个柱体积，上样后先用平衡缓冲液A洗脱3个柱体积洗去未吸附的部分，随后进行0~30%洗脱缓冲液B洗脱12个柱体积收集活性峰，冷冻干燥。再经Sephadex G-10凝胶层析，用超纯水进行洗脱。检测波长为220 nm，洗脱液流速为0.5 mL/min。收集活性较高的峰组分，冷冻干燥。最后将Sephadex G-10凝胶层析分离后冻干的活性成分溶解于pH8.5的10 mmol/L 的Tris-HCl中，配制浓度为1 mg/mL。利用Mono Q 阴离子交换层析进一步分离纯化。平衡缓冲液C为pH8.5的10 mmol/L Tris-HCl，洗脱缓冲液D为分别含40 mmol/L NaCl、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl及0.9mol/L NaCl的pH8.5 Tris-HCl缓冲液，流速0.5 mL/min，检测波长为220 nm，收集活性较高活性峰组分，冷冻干燥。该抑制剂分别在60℃、70℃及80℃的水浴环境中放置7 h，立即用冰水冷却，其抑制活性仍保持在80%以上，温度耐受性较好。该抑制剂分别在放在pH3.0、pH4.0、pH50、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0，pH12.0的缓冲液中50℃保温2 h，其抑制活性均保持在87%以上，pH耐受性较好。

实施例2

以烘干到恒重的条斑紫菜粉末4 g为底物，以pH7.0 Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液为介质，底物与缓冲液的比例为1:25，沸水浴热处理15 min。加入中性蛋白酶( E/S=8×10⁴U/g )，50℃水解7 h，沸水浴灭酶15 min，调节pH8.5，加入固体氨肽酶( E/S=28 U/g ) 和碱性蛋白酶( E/S=8×10⁴U/g )，50℃水解3 h，沸水浴灭酶15 min，加入乙醇至终浓度为60%。室温静置过夜，8000 r/min离心10 min，得到的上清液为含抑制剂的混合物。将含抑制剂的紫菜上清液混合物通过活性炭脱色后，经1 mL预装柱SP Sepharose High Performance 阳离子交换层析分离纯化。平衡缓冲液A为pH3.0的10 mmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。洗脱缓冲液B为pH3.0的10mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液( 含2mol/L NaCl溶液 )。洗脱方式：首先用平衡缓冲液A平衡8个柱体积，上样后先用平衡缓冲液洗脱3个柱体积除去未吸附的部分，随后进行0~30%洗脱缓冲液B洗脱15个柱体积，收集活性峰，冷冻干燥。再经Sephadex G-10凝胶层析，用超纯水进行洗脱。检测波长为220 nm，洗脱液流速为0.5 mL/min。收集活性较高的峰组分，冷冻干燥。最后将Sephadex G-10凝胶层析分离后冻干的活性成分溶解于pH8.5的10 mmol/L的Tris-HCl中，配制浓度为1 mg/mL。利用Mono Q 阴离子交换层析进一步分离纯化。平衡缓冲液C为pH8.5的10 mmol/L Tris-Hcl，洗脱缓冲液D为分别含40 mmol/L NaCl、0.1 mol/L NaCl 、0.3 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl和0.9 mol/L NaCl的pH8.5 Tris-HCl缓冲液，流速0.5 mL/min，检测波长为220 nm，收集活性较高活性峰组分，冷冻干燥。该抑制剂分别在60℃，70℃及80℃的水浴环境中放置7 h，立即用冰水冷却，其抑制活性仍保持在80%以上，温度耐受性较好。该抑制剂分别在放在pH3.0、pH4.0、pH50、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0，pH12.0缓冲液中50℃保温2 h，其抑制活性均保持在87%以上，pH耐受性较好。

Claims

1.一种从紫菜酶解产物中分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于：步骤为：

（1）α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取：以烘干至恒重的末水条斑紫菜粉末为底物，以pH7.0 Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液为介质，底物与缓冲液的质量比为1:25～33，沸水浴热处理15 min；加入中性蛋白酶 E/S=8×10⁴U/g，50℃水解7 h，沸水浴灭酶15 min；调节pH8.5，加入固体氨肽酶 E/S=28 U/g和碱性蛋白酶 E/S=8×10⁴U/g，50℃水解3 h，沸水浴灭酶15 min；加入乙醇至终浓度为60%，室温静置过夜，8000 r/min离心10 min，上清液为含α-葡萄糖苷酶抑制剂的混合物；

（2）α-葡萄糖苷酶抑制剂分离纯化：将步骤（1）所得上清液通过活性炭脱色，再将该活性炭脱色液依次经过SP Sepharose High Performance 阳离子交换层析、Sephadex G-10凝胶层析和Mono Q 阴离子交换层析分离纯化，检测波长为220 nm，收集活性峰组分；反相高效液相RP-HPLC测定其纯度后，超高效液相色谱-质谱法Q-TOF-MS分析鉴定其为小分子多肽。