CN106279463A - 一种灰兜巴多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灰兜巴多糖及其制备方法，该方法包括以下步骤：提取灰兜巴粗多糖；灰兜巴中性多糖的收集；灰兜巴酸性多糖的收集；将灰兜巴中性多糖和灰兜巴酸性多糖进行分离与纯化，制备得到纯化后的灰兜巴多糖，即为灰兜巴多糖。本发明采用乙醇除杂脱脂，再水提的提取方法，比传统水提醇沉法所得多糖的复溶率更高，可提高多糖得率。本发明两次纯化可提高灰兜巴多糖的纯度，从而提高活性。

Description

一种灰兜巴多糖及其制备方法

技术领域

本发明属于植物提取领域，具体地说，涉及一种灰兜巴多糖及其制备方法。

背景技术

灰兜巴又名闭口袋、灰蔸巴，其外观形似一个布口袋，上端开口处附于老茶树的树干上，而下端藏于洞穴之中，主要产于四川省峨眉山市。灰兜巴主要有益气健脾，滋补肾阴，消除和缓解糖尿病症状，平衡机体阴阳，调和气血，纠正代谢紊乱等多种功效，作为一种偏方药长期在民间使用，主要用于治疗Ⅱ型糖尿病，被誉作治疗糖尿病的优良偏方，是峨眉山地区千年来世代相传的药物，拥有“仙山灵药”、“糖尿病克星”、“天然纯绿色的大自然珍宝”等多种美誉。

灰兜巴对糖尿病长期的临床疗效以及部分实验研究表明了灰兜巴具有良好的降糖效果。已有研究表明灰兜巴的提取液、含有灰兜巴的复方制剂等具有降血糖以及清除体外自由基等作用，其作用机理可能是通过增强糖尿病患者的抗氧化能力和免疫力，防止发生脂质过氧化以及减缓肾功能衰竭等途径实现的降糖作用。灰兜巴中含有蛋白质、氨基酸、多糖及苷、生物碱、有机酸、鞣质等。其中主要活性成分为蛋白质、多糖和生物碱，均具有降糖效果。从灰兜巴提取所得的活性成分分为蛋白质组、多糖组、生物碱组及复合组(蛋白质、多糖和生物碱联合使用)，分别对四氧嘧啶制作的Ⅱ型糖尿病模型小鼠进行治疗，结果表明其有效成分为蛋白质成分。伍艳等人报道指出，中药灰兜巴中的活性成分在针对Ⅱ型糖尿病动物模型进行治疗时，其中的蛋白质活性成分是主要药效成分，在对Ⅱ型糖尿病动物模型治疗后，小鼠的血糖水平和醛糖还原酶含量及对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，相比多糖、生物碱成分的治疗结果，都有显著性提高，有明显的疗效。

谢美娜等(谢美娜,范慧芬,陈朝喜等.正交试验优选灰兜巴多糖的提取工艺[J].中国兽医杂志,2014,9(50):75-77.)通过水提醇沉法提取灰兜巴粗多糖,硫酸苯酚法检测多糖含量，研究不同提取温度(60、70、80、90、100℃)对灰兜巴粗多糖提取率的影响。实验结果表明，当提取温度低于90℃时随着温度提高多糖提取率增加，当超过90℃时反而降低。认为在提取温度为90℃时灰兜巴多糖提取率最高。并通过考察提取温度、提取时间和料液比3个因素，以灰兜巴多糖提取率为指标，用正交试验优化粗多糖提取工艺。结果表明提取温度为90℃，提取时间为1.5h，料液比为1∶10时灰兜巴多糖提取率最高。陈燕忠(陈燕忠,符美燕,谢清春等.灰兜巴粗多糖的提取及含量测定[J].中国实验方剂学,2011,6(17):79-82.)采用水提醇沉法从灰兜巴药材中提取灰兜巴粗多糖，采用苯酚-硫酸法显色后用分光光度法测定多糖的总糖含量。为了优化灰兜巴粗多糖的提取工艺，利用水提醇沉法提取灰兜巴粗多糖。表明温度对灰兜巴多糖提取率影响显著，其次是时间。邓晓婷等(邓晓婷，钟南京，李冰，等.灰兜巴多糖的提取分离纯化研究[J].食品科技,2014,39(6):203-206.)对灰兜巴多糖进行提取、分离及纯化研究，认为木瓜蛋白酶-Sevage法为灰兜巴粗多糖脱蛋白的最佳工艺；通过DEAE-52纤维素离子交换层析得到4个组分，总的多糖回收率为86.22％。

目前对于灰兜巴多糖的报道大多为粗多糖，未对粗多糖进行分离纯化和结构鉴定，也未见灰兜巴抗肿瘤活性的研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种灰兜巴多糖及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种灰兜巴多糖的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、提取灰兜巴粗多糖；

步骤2、灰兜巴中性多糖的收集；

步骤3、灰兜巴酸性多糖的收集；

步骤4、将灰兜巴中性多糖和灰兜巴酸性多糖进行分离与纯化，制备得到纯化后的灰兜巴多糖，即为灰兜巴多糖。

进一步地，提取灰兜巴粗多糖具体为：

步骤1.1、前处理：将灰兜巴样品洗净在50-60℃烘干箱中干燥，用中草药粉碎机粉碎，过10目至65目筛，制备得到灰兜巴粗粉；

步骤1.2、取灰兜巴粗粉，按照料液比1:8-1:12g/mL加入体积分数为95％-100％的乙醇，微沸4-6小时，提取3次，至提取液无色；残渣用体积分数为45％-55％的乙醇，按照料液比1:8-1:12g/mL，微沸4-6小时提取至无色；残渣加蒸馏水，按照料液比1:8-1:12g/mL，微沸提取1.5-2.5小时，提取两次，滤液浓缩至干或近干于烧瓶中，放入-80℃冰箱冻成冰，冷冻干燥，制备得到灰兜巴粗多糖样品。

进一步地，步骤2中的灰兜巴中性多糖的收集具体为：取步骤1制备得到的灰兜巴粗多糖样品，加蒸馏水定容，灰兜巴粗多糖样品占定容总量的1:5-1:15g/mL，装入处理好的分子量为3500的透析袋中，两端用夹子夹好透析，一天换两次水，透析至无颜色；透析后的样品3000-4000r/min离心5-10min，用滤头过滤，放入4℃冰箱中保存；取1/2的样品上样，用DEAE琼脂糖凝胶FF柱分离纯化；洗脱液为蒸馏水，流速2mL/min，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得灰兜巴中性多糖。

进一步地，步骤3中的灰兜巴酸性多糖的收集具体为：收集中性多糖后，继续用蒸馏水洗柱子2小时，以0-1.5mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，用电脑自动部分收集器收集洗脱液，采用苯酚—硫酸法测定多糖含量，制定多糖含量曲线，收集特征峰，浓缩至100ml，装入透析袋透析，6小时换水一次，透析至透析桶里的水不再使硝酸银溶液产生沉淀为止，再浓缩近干，冷冻干燥，得不同分子量的灰兜巴酸性多糖。

进一步地，步骤4中的将灰兜巴中性多糖和灰兜巴酸性多糖进行分离与纯化，制备得到纯化后的灰兜巴多糖具体为：

步骤4.1、以琼脂糖凝胶6FF为填料装柱，取分子量分别为10000、40000、70000、500000、2000000的多糖标准品各5mg混合，蒸馏水溶解，上凝胶柱洗脱；并将前期分离纯化并冷冻干燥的中性多糖和酸性多糖，分别用蒸馏水完全溶解，上样洗脱；

步骤4.2、标准曲线的制备：收集混合多糖标准品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管；测定每管多糖的含量；以5个对照品的分子量的对数为横坐标，以5个含量曲线峰值对应的体积为纵坐标，制作标准曲线，并进行线性关系分析；

步骤4.3、样品分子量的测定：收集各样品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管；测定每管多糖的含量，制作曲线，取样品多糖含量曲线的峰值，代入标准曲线，计算得出相应样品多糖分子量；

步骤4.4、纯化样品的收集：根据分子量的不同，合并样品洗脱液，浓缩至干，冷冻干燥，即得纯化多糖，即为灰兜巴多糖。

本发明还公开了一种由上述的制备方法制备得到的灰兜巴多糖。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明采用乙醇除杂脱脂，再水提的提取方法，比传统水提醇沉法所得多糖的复溶率更高，可提高多糖得率。

2)本发明首次阴离子交换层析法和凝胶柱层析法对灰兜巴粗多糖进行分离、纯化。

3)本发明两次纯化可提高灰兜巴多糖的纯度，从而提高活性。

4)本发明采用冷冻干燥技术，可提高所得多糖的复溶率，更有利于多糖的分离、纯化。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明灰兜巴酸性多糖DEAE琼脂糖凝胶FF柱分离洗脱图谱；

图2是本发明灰兜巴酸性多糖HDB-S-1凝胶柱层析柱分离图；

图3是本发明灰兜巴多糖HDB-S-1抗癌活性检测。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明提供一种灰兜巴多糖的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、提取灰兜巴粗多糖：

步骤1.1、前处理：将灰兜巴样品洗净在50-60℃烘干箱中干燥，用中草药粉碎机粉碎，过10目至65目筛，制备得到灰兜巴粗粉；

步骤1.2、取灰兜巴粗粉，按照料液比1:8-1:12g/mL加入体积分数为95％-100％的乙醇，微沸4-6小时，提取3次，至提取液无色；残渣用体积分数为45％-55％的乙醇，按照料液比1:8-1:12g/mL，微沸4-6小时提取至无色；残渣加蒸馏水，按照料液比1:8-1:12g/mL，微沸提取1.5-2.5小时，提取两次，滤液浓缩至干或近干于烧瓶中，放入-80℃冰箱冻成冰，冷冻干燥，制备得到灰兜巴粗多糖样品；

步骤2、灰兜巴中性多糖的收集：取步骤1制备得到的灰兜巴粗多糖样品，加蒸馏水定容，灰兜巴粗多糖样品占定容总量的1:5-1:15g/mL，装入处理好的分子量为3500的透析袋中，两端用夹子夹好透析，一天换两次水，透析至无颜色；透析后的样品3000-4000r/min离心5-10min，用滤头过滤，放入4℃冰箱中保存；取1/2的样品上样，用DEAE琼脂糖凝胶FF柱分离纯化；洗脱液为蒸馏水，流速2mL/min，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得灰兜巴中性多糖。

步骤3、灰兜巴酸性多糖的收集：收集中性多糖后，继续用蒸馏水洗柱子2小时，以0-1.5mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，用电脑自动部分收集器收集洗脱液，采用苯酚—硫酸法测定多糖含量，制定多糖含量曲线，收集特征峰，浓缩至100ml，装入透析袋透析，6小时换水一次，透析至透析桶里的水不再使硝酸银溶液产生沉淀为止，再浓缩近干，冷冻干燥，得不同分子量的灰兜巴酸性多糖。

步骤4、将灰兜巴中性多糖和灰兜巴酸性多糖进行分离与纯化：

步骤4.1、以琼脂糖凝胶6FF为填料装柱，取分子量分别为10000、40000、70000、500000、2000000的多糖标准品各5mg混合，蒸馏水溶解，上凝胶柱洗脱；并将前期分离纯化并冷冻干燥的中性多糖和酸性多糖，分别用蒸馏水完全溶解，上样洗脱；

步骤4.2、标准曲线的制备：收集混合多糖标准品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管；测定每管多糖的含量；以5个对照品的分子量的对数为横坐标，以5个含量曲线峰值对应的体积为纵坐标，制作标准曲线，并进行线性关系分析；

步骤4.3、样品分子量的测定：收集各样品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管；测定每管多糖的含量，制作曲线，取样品多糖含量曲线的峰值，代入标准曲线，计算得出相应样品多糖分子量；

步骤4.4、纯化样品的收集：根据分子量的不同，合并样品洗脱液，浓缩至干，冷冻干燥，即得纯化多糖。

实施例1

将灰兜巴样品洗净在50℃烘干箱中干燥，用中草药粉碎机粉碎，过筛，取10目至65目的粗粉，称取200g。加1000mL95％乙醇，微沸5小时，提取3次，至提取液无色。浓缩乙醇提取液至10mL，于4℃冰箱保存。残渣用50％乙醇，每次1000mL，微沸3小时提取至无色，滤液浓缩至10mL，于4℃冰箱保存。残渣加蒸馏水1000mL，微沸提取2小时，提取两次，滤液浓缩至干或近干于100mL烧瓶中，放入-80℃冰箱冻成冰，冷冻干燥，得粗多糖样品，精密称重，计算得率。

取0.5g粗多糖样品，加50ml蒸馏水定容，装入处理好的透析袋(分子量3500)中，两端用夹子夹好透析，一天换两次水，透析至无颜色。透析后的样品3000r/min离心5min，用滤头过滤，放入4℃冰箱中保存。取1/2的样品上样，用DEAE琼脂糖凝胶FF柱分离纯化。洗脱液为蒸馏水，流速2mL/min，收集1000mL洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得中性多糖。

收集中性多糖后，继续用蒸馏水洗柱子2小时。以0—1.5mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱。用电脑自动部分收集器收集洗脱液，每管10ml，共收集160管酸性多糖洗脱液。采用苯酚—硫酸法测定每管的多糖含量，制定多糖含量曲线，收集特征峰。浓缩至100ml，装入透析袋透析，6小时换水一次，透析至透析桶里的水不再使硝酸银溶液产生沉淀为止。再浓缩近干，冷冻干燥，得不同的酸性多糖。

以琼脂糖凝胶6FF为填料装柱，取分子量分别为10000、40000、70000、500000、2000000的多糖标准品各5mg混合，蒸馏水溶解，上凝胶柱洗脱。并将前期分离纯化并冷冻干燥的中性和酸性多糖，分别用蒸馏水完全溶解，上样洗脱。

收集混合多糖标准品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管。测定每管多糖的含量。以5个对照品的分子量的对数为横坐标，以5个含量曲线峰值对应的体积为纵坐标，制作标准曲线，并进行线性关系分析。收集各样品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管。测定每管多糖的含量，制作曲线。取样品多糖含量曲线的峰值，代入标准曲线，计算得出相应样品多糖分子量。根据分子量的不同，合并样品洗脱液，浓缩至干，冷冻干燥，即得纯化多糖。

实施例2

一种灰兜巴多糖的制备方法，包括以下步骤：

将灰兜巴样品洗净在60℃烘干箱中干燥，用中草药粉碎机粉碎，过10目至65目筛，制备得到灰兜巴粗粉；取灰兜巴粗粉，按照料液比1:12g/mL加入体积分数为100％的乙醇，微沸4小时，提取3次，至提取液无色；残渣用体积分数为45％的乙醇，按照料液比1:12g/mL，微沸4小时提取至无色；残渣加蒸馏水，按照料液比1:12g/mL，微沸提取2.5小时，提取两次，滤液浓缩至干或近干于烧瓶中，放入-80℃冰箱冻成冰，冷冻干燥，制备得到灰兜巴粗多糖样品。

取灰兜巴粗多糖样品，加蒸馏水定容，灰兜巴粗多糖样品占定容总量的1:5g/mL，装入处理好的分子量为3500的透析袋中，两端用夹子夹好透析，一天换两次水，透析至无颜色；透析后的样品4000r/min离心8min，用滤头过滤，放入4℃冰箱中保存；取1/2的样品上样，用DEAE琼脂糖凝胶FF柱分离纯化；洗脱液为蒸馏水，流速2mL/min，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得灰兜巴中性多糖。

收集中性多糖后，继续用蒸馏水洗柱子2小时，以0-1.5mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，用电脑自动部分收集器收集洗脱液，采用苯酚—硫酸法测定多糖含量，制定多糖含量曲线，收集特征峰，浓缩至100ml，装入透析袋透析，6小时换水一次，透析至透析桶里的水不再使硝酸银溶液产生沉淀为止，再浓缩近干，冷冻干燥，得不同分子量的灰兜巴酸性多糖。

以琼脂糖凝胶6FF为填料装柱，取分子量分别为10000、40000、70000、500000、2000000的多糖标准品各5mg混合，蒸馏水溶解，上凝胶柱洗脱；并将前期分离纯化并冷冻干燥的中性多糖和酸性多糖，分别用蒸馏水完全溶解，上样洗脱；

收集混合多糖标准品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管；测定每管多糖的含量；以5个对照品的分子量的对数为横坐标，以5个含量曲线峰值对应的体积为纵坐标，制作标准曲线，并进行线性关系分析；

收集各样品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管；测定每管多糖的含量，制作曲线，取样品多糖含量曲线的峰值，代入标准曲线，计算得出相应样品多糖分子量；

根据分子量的不同，合并样品洗脱液，浓缩至干，冷冻干燥，即得纯化多糖，即为灰兜巴多糖。

实施例3

一种灰兜巴多糖的制备方法，包括以下步骤：

将灰兜巴样品洗净在55℃烘干箱中干燥，用中草药粉碎机粉碎，过10目至65目筛，制备得到灰兜巴粗粉；取灰兜巴粗粉，按照料液比1:8g/mL加入体积分数为98％的乙醇，微沸6小时，提取3次，至提取液无色；残渣用体积分数为55％的乙醇，按照料液比1:8g/mL，微沸6小时提取至无色；残渣加蒸馏水，按照料液比1:8g/mL，微沸提取1.5小时，提取两次，滤液浓缩至干或近干于烧瓶中，放入-80℃冰箱冻成冰，冷冻干燥，制备得到灰兜巴粗多糖样品。

取灰兜巴粗多糖样品，加蒸馏水定容，灰兜巴粗多糖样品占定容总量的1:15g/mL，装入处理好的分子量为3500的透析袋中，两端用夹子夹好透析，一天换两次水，透析至无颜色；透析后的样品3500r/min离心10min，用滤头过滤，放入4℃冰箱中保存；取1/2的样品上样，用DEAE琼脂糖凝胶FF柱分离纯化；洗脱液为蒸馏水，流速2mL/min，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得灰兜巴中性多糖。

收集中性多糖后，继续用蒸馏水洗柱子2小时，以0-1.5mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，用电脑自动部分收集器收集洗脱液，采用苯酚—硫酸法测定多糖含量，制定多糖含量曲线，收集特征峰，浓缩至100ml，装入透析袋透析，6小时换水一次，透析至透析桶里的水不再使硝酸银溶液产生沉淀为止，再浓缩近干，冷冻干燥，得不同分子量的灰兜巴酸性多糖。

以琼脂糖凝胶6FF为填料装柱，取分子量分别为10000、40000、70000、500000、2000000的多糖标准品各5mg混合，蒸馏水溶解，上凝胶柱洗脱；并将前期分离纯化并冷冻干燥的中性多糖和酸性多糖，分别用蒸馏水完全溶解，上样洗脱；

收集混合多糖标准品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管；测定每管多糖的含量；以5个对照品的分子量的对数为横坐标，以5个含量曲线峰值对应的体积为纵坐标，制作标准曲线，并进行线性关系分析；

收集各样品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管；测定每管多糖的含量，制作曲线，取样品多糖含量曲线的峰值，代入标准曲线，计算得出相应样品多糖分子量；

根据分子量的不同，合并样品洗脱液，浓缩至干，冷冻干燥，即得纯化多糖，即为灰兜巴多糖。

下面结合具体的实验过程来说明本发明的技术效果：

1灰兜巴酸性多糖DEAE-琼脂糖凝胶FF柱分离、纯化结果

灰兜巴酸性多糖收集图谱见图1，根据图1，收集到两个组分，分别为41-96管和96-115管。但96管-115管多糖合并洗脱液后得率太少，故未进行第二次分离纯化。

2灰兜巴酸性多糖凝胶柱层析柱分离、纯化结果

灰兜巴酸性多糖凝胶柱层析柱分离图谱见图2。根据图2出峰情况，收集第24-40管洗脱液，合并，浓缩，冷冻干燥，命名为HDB-S-1。

3灰兜巴酸性多糖HDB-S-1分子量测定结果

根据多糖对照品的峰浓度的洗脱体积和分子量的对数制备标准曲线。得标准曲线方程y＝-0.0414x+7.0395,其中x为洗脱体积，y为lg Mw。把HDB-S-1的峰值代入方程，计算得其分子量为471.3kDa。

4灰兜巴酸性多糖HDB-S-1单糖组成分析

称取经P2O5真空干燥后的1mg多糖样品于瓶中，通干燥氮气，用注射器注入制备1mL 3M HCl甲醇溶液，封管，在80℃反应20h，反应完后，冷却至室温，小心用氮气吹干，真空干燥，得到多糖的甲醇解产物。

向干燥的多糖甲醇解产物注入200μLTMS反应液(无水吡啶，六甲基二硅氨烷和氯化三甲基硅烷，混合比例5：2：1)，摇匀室温防止30min。最后取上清液1～5μL进样，将三甲硅醚衍生物进行GC分析(GC条件：SE-54石英毛细管柱(0.25mm×30m)，进口样温度270℃，升温150℃，保持1min，以10℃/min升温至230℃，保持4min)。

经过对照品和样品的GC图谱，分析得到灰兜巴酸性多糖HDB-S-1的单糖组成，具体见表1。

表1 灰兜巴多糖HDB-I-I单糖组分(mol％)

5灰兜巴酸性多糖HDB-S-1抗直肠癌细胞SW480活性测定结果

将SW480(直肠癌细胞)细胞接种于10cm培养板上，培养基为含10％FBS的DMEM，待生长密度致70％左右，进行传代接种于96孔细胞培养板(接种密度约4×104个/孔)，培养12h后，换液并加入多糖刺激，浓度分别为50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml。刺激12h后，加入CCK-8试剂(10ul/孔)，培养半小时，于酶标仪450nm处测定吸光值，并进行细胞存活率分析。

灰兜巴酸性多糖HDB-S-1抗直肠癌细胞SW480活性测定结果见图3。

如图3所示，不同浓度的灰兜巴多糖HDB-S-1均表现出一定的抗肿瘤活性，其中200mg/ml该多糖的抗肿瘤率超过了50％。这表明灰兜巴多糖HDB-S-1在抗肿瘤方面具有很好的活性，具有进一步研究和开发的潜力。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种灰兜巴多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、提取灰兜巴粗多糖；

步骤2、灰兜巴中性多糖的收集；

步骤3、灰兜巴酸性多糖的收集；

步骤4、将灰兜巴中性多糖和灰兜巴酸性多糖进行分离与纯化，制备得到纯化后的灰兜巴多糖，即为灰兜巴多糖。

2.根据权利要求1所述的灰兜巴多糖的制备方法，其特征在于，所述提取灰兜巴粗多糖具体为：

步骤1.1、前处理：将灰兜巴样品洗净在50-60℃烘干箱中干燥，用中草药粉碎机粉碎，过10目至65目筛，制备得到灰兜巴粗粉；

步骤1.2、取灰兜巴粗粉，按照料液比1:8-1:12g/mL加入体积分数为95％-100％的乙醇，微沸4-6小时，提取3次，至提取液无色；残渣用体积分数为45％-55％的乙醇，按照料液比1:8-1:12g/mL，微沸4-6小时提取至无色；残渣加蒸馏水，按照料液比1:8-1:12g/mL，微沸提取1.5-2.5小时，提取两次，滤液浓缩至干或近干于烧瓶中，放入-80℃冰箱冻成冰，冷冻干燥，制备得到灰兜巴粗多糖样品。

3.根据权利要求1所述的灰兜巴多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的灰兜巴中性多糖的收集具体为：取步骤1制备得到的灰兜巴粗多糖样品，加蒸馏水定容，灰兜巴粗多糖样品占定容总量的1:5-1:15g/mL，装入处理好的分子量为3500的透析袋中，两端用夹子夹好透析，一天换两次水，透析至无颜色；透析后的样品3000-4000r/min离心5-10min，用滤头过滤，放入4℃冰箱中保存；取1/2的样品上样，用DEAE琼脂糖凝胶FF柱分离纯化；洗脱液为蒸馏水，流速2mL/min，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得灰兜巴中性多糖。

4.根据权利要求1所述的灰兜巴多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的灰兜巴酸性多糖的收集具体为：收集中性多糖后，继续用蒸馏水洗柱子2小时，以0-1.5mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，用电脑自动部分收集器收集洗脱液，采用苯酚—硫酸法测定多糖含量，制定多糖含量曲线，收集特征峰，浓缩至100ml，装入透析袋透析，6小时换水一次，透析至透析桶里的水不再使硝酸银溶液产生沉淀为止，再浓缩近干，冷冻干燥，得不同分子量的灰兜巴酸性多糖。

5.根据权利要求1所述的灰兜巴多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤4中的将灰兜巴中性多糖和灰兜巴酸性多糖进行分离与纯化，制备得到纯化后的灰兜巴多糖具体为：

步骤4.1、以琼脂糖凝胶6FF为填料装柱，取分子量分别为10000、40000、70000、500000、2000000的多糖标准品各5mg混合，蒸馏水溶解，上凝胶柱洗脱；并将前期分离纯化并冷冻干燥的中性多糖和酸性多糖，分别用蒸馏水完全溶解，上样洗脱；

步骤4.2、标准曲线的制备：收集混合多糖标准品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管；测定每管多糖的含量；以5个对照品的分子量的对数为横坐标，以5个含量曲线峰值对应的体积为纵坐标，制作标准曲线，并进行线性关系分析；

步骤4.3、样品分子量的测定：收集各样品洗脱液，每根试管收集10ml，共收集120管；测定每管多糖的含量，制作曲线，取样品多糖含量曲线的峰值，代入标准曲线，计算得出相应样品多糖分子量；

步骤4.4、纯化样品的收集：根据分子量的不同，合并样品洗脱液，浓缩至干，冷冻干燥，即得纯化多糖，即为灰兜巴多糖。

6.一种由权利要求1至5任一权利要求所述的制备方法制备得到的灰兜巴多糖。