CN105906737A - 一种灰兜巴多糖及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于保健食品和药品领域，公开了一种灰兜巴多糖及其制备方法。其步骤包括：以灰兜巴为原料，经过热水提取，乙醇沉淀得到灰兜巴粗多糖，将粗多糖溶解，用活性炭脱色，Sevage试剂脱除蛋白质，采用超滤技术进行分离纯化，筛选得到分子量较小的灰兜巴多糖2，其峰位分子量Mp为6277Da，重均分子量Mw为9703Da，数均分子量Mn为7144Da。本发明制备方法可高效地分离制备灰兜巴多糖2，所涉及的灰兜巴多糖2能显著降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的血糖、血脂和糖化血红蛋白，改善葡萄糖耐量，改善糖脂代谢，具有体外抗氧化作用，适用于制备具有降血糖作用灰兜巴多糖的保健食品和药品。

Description

一种灰兜巴多糖及其制备方法
技术领域
本发明属于保健食品和药品领域，涉及一种具有降血糖作用的灰兜巴多糖及其制备方法。
背景技术
糖尿病是一种由多病因引起的严重威胁人类健康的代谢疾病，具有慢性高血糖这一显著特征，伴随胰岛素分泌及/或作用缺陷引起的碳水化合物、蛋白质、脂肪代谢紊乱，而造成全身性多器官的慢性损害、功能障碍，甚至衰竭。根据统计，全球范围内有10％的人口遭受糖尿病折磨，而且国际糖尿病联盟预测，如不采取措施，到2040年全球将有6.42亿人患有糖尿病。中国是糖尿病第一大国，目前20岁以上的成年患者超过1亿人，发病率高达11.6％。糖尿病长期持续的高血糖状态可产生葡萄糖毒性，导致全身性的慢性并发症，甚至危及生命。毫无疑问，糖尿病已严重威胁人类的健康，对糖尿病的防治刻不容缓。
当前治疗糖尿病以西药为主，西药治疗糖尿病见效快，降低血糖作用明显，但疗效有限，对机体有明显的毒副作用，不能消除糖尿病并发症，而且有些西药价格昂贵，因此寻找具有降血糖作用的天然活性成分日益引起世界各国学者的重视。
灰兜巴是一种寄生在海拔800～1500m的峨眉山茶树上的红蜘蛛吐丝筑的巢(也有称其为老茶树根部生长出来的菌科植物)，亦称其为灰蔸巴、灰蔸芭、闭口袋。灰兜巴外观形成一个长长的袋子，上端依附于老茶树根部树干上，下端约有三分之一藏于泥土下洞穴里，其表面附着泥土和少量枯枝败叶。在四川峨眉山地区，灰兜巴的水煎液用于治疗糖尿病已有悠久的历史，而且效果良好，是峨眉山民间数百年来世代相传的秘方，因而拥有“仙山灵药”、“糖尿病克星”和“天然纯绿色的大自然珍宝”的美誉。近年来，灰兜巴治疗糖尿病的作用逐渐引起了广大糖尿病工作者和保健食品研究者的关注，然而对于灰兜巴的研究尚处于起步阶段，未见灰兜巴多糖的分子量对降血糖作用的影响方面的报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种灰兜巴多糖。
本发明的第二个目的在于提供一种灰兜巴多糖的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供灰兜巴多糖在降血糖保健食品和药品领域中的应用。
为实现上述目的，本发明提供一种具有降血糖作用的灰兜巴多糖，其峰位分子量Mp为5000～15000Da，重均分子量Mw为7000～90000Da，数均分子量Mn为5000～30000Da。
本发明目的可以通过以下技术方案实现：
一种灰兜巴多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将灰兜巴除杂洗净并干燥，粉碎得灰兜巴粉；
(2)向灰兜巴粉中加入去离子水进行多糖提取，离心得上清液；
(3)上清液脱色脱蛋白后，再将溶液经过超滤膜分离纯化，收集截留端和透过端流出的溶液分别得到灰兜巴多糖1和分子量较小的灰兜巴多糖2；其中，用活性炭脱色，用Sevag法脱蛋白；
(4)向灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2中加入无水乙醇，使最终的乙醇体积分数为80～90％，静置离心，收集沉淀；
(5)将沉淀物冷冻干燥，得粉末状的灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2。
步骤(1)中干燥温度为40～50℃。
步骤(2)中加入的去离子水的体积为灰兜巴的重量的25～30倍，即灰兜巴的重量与去离子水的体积之比为1:25～1:30g/ml。
步骤(2)中提取温度为90～95℃，提取时间2.5～3.0h，提取次数为2～3次。
步骤(3)中所述脱色脱蛋白为：向上清液中加入2％～5％的活性炭，55～60℃下振荡2～3h，离心去除沉淀；向清液中加入Sevag试剂，磁力搅拌，分液收集上层清液，再加入Sevag试剂，重复操作5～10次；静置，去除中层和下层，保留上层。
所述Sevag试剂的体积与灰兜巴多糖溶液体积之比为1:4。
所述Sevag试剂包括氯仿和正丁醇，其中，氯仿与正丁醇的体积之比为4:1。
步骤(2)所述离心为4000～5000rmp/min的转速离心10～15min。
步骤(3)中使用10kDa的超滤膜。
步骤(4)中静置的温度为0～4℃，时间为12～24h。
步骤(4)中离心速度为4000～5000rmp/min。
上述方法制备的灰兜巴多糖的峰位分子量Mp为5000～15000Da，重均分子量Mw为7000～90000Da，数均分子量Mn为5000～30000Da。
本发明具有如下的优点和有益效果：
(1)本发明制备方法安全无毒，绿色环保，能耗低，生产成本低，且对设备要求不高，非常有利于工业化生产。
(2)本发明制备方法可高效地分离得降血糖活性更高的灰兜巴多糖，筛选得到灰兜巴多糖2，其峰位分子量Mp为6277Da，重均分子量Mw为9703Da，数均分子量Mn为7144Da。本发明所涉及的灰兜巴多糖2能显著降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的血糖、血脂和糖化血红蛋白，改善葡萄糖耐量，改善糖脂代谢，具有体外抗氧化作用，适用于制备具有降血糖作用的保健食品和药品。
附图说明
图1为灰兜巴多糖1的凝胶渗透色谱图。
图2为灰兜巴多糖2的凝胶渗透色谱图。
图3为灰兜巴多糖和Vc对DPPH的清除能力。
图4为灰兜巴多糖和Vc对ABTS的清除能力。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步说明本发明，并不是对本发明的权利要求保护范围的进一步限定。
实施例1：灰兜巴多糖的制备
称取干燥的灰兜巴原料200g，加入6L去离子水，95℃提取3h，经400目纱布过滤，过滤所得残渣在相同操作条件下重复提取2次，合并提取液，4000rmp/min离心10min得上清液；向上清液中加入200g活性炭，55℃振荡2.5h，8000rmp/min的转速离心15min得上清液，呈淡黄色；向上清液中加入1250mL的Sevag试剂，磁力搅拌15min后，在分液漏斗中静置15～20min，去除中层和下层，保留上层，重复操作8次，加入无水乙醇，使最终的乙醇体积分数为80～90％，在0～4℃下静置12～24h；离心，收集沉淀，冷冻干燥即得灰兜巴多糖固体粉末。
实施例2：灰兜巴多糖的制备
称取干燥的灰兜巴原料200g，加入6L去离子水，95℃提取3h，经400目纱布过滤，过滤所得残渣在相同操作条件下重复提取2次，合并提取液，4000rmp/min离心10min得上清液；向上清液中加入200g活性炭，55℃振荡2.5h，8000rmp/min的转速离心15min得上清液，呈淡黄色；向上清液中加入1250mL的Sevag试剂，磁力搅拌15min后，在分液漏斗中静置15～20min，去除中层和下层，保留上层，重复操作8次。将上层清液用10kDa的超滤膜纯化分级，收集截留端和透过端流出的溶液分别得到灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2；向两种溶液中加入无水乙醇，使最终的乙醇体积分数为80～90％，在0～4℃下静置12～24h；离心，收集沉淀，冷冻干燥即得灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2固体粉末。
实施例3：灰兜巴多糖的分子量测定
采用高效凝胶渗透色谱法(GPC)测定灰兜巴多糖的分子量。采用的色谱条件为：TSK-GEL G-5000PWXL column(7.8mm×300mm)色谱柱串联TSK-GEL G-3000PWXLcolumn(7.8mm×300mm)色谱柱；pH6.0的0.02mol/L KH2PO4溶液作为流动相，流速为0.6mL/min；柱温35℃；检测器为waters 2414示差检测器；以Dextran系列葡聚糖为标准品。灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2的GPC凝胶渗透色谱图如图1和图2所示。灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2的平均分子量分别为36571Da和6277Da。
实施例4：灰兜巴多糖的降血糖、降血脂作用的评价
(1)实验样品
本发明提取分离的灰兜巴多糖1、2，为淡黄色固体粉末；利用现有技术提取的灰兜巴粗多糖。
(2)实验动物
SPF级自发性Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠31只，雌性，体重约为30±5g/只，6～8周龄。SPF级C57BL/6J小鼠6只，雌性，体重约为20±5g/只，6～8周龄。KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供。
(3)实验试剂和仪器
盐酸二甲双胍，中美上海施贵宝制药有限公司；生理盐水，广东利泰制药股份有限公司；糖化血红蛋白、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白试剂盒，上海科华生物工程股份有限公司。罗氏卓越型血糖仪，德国罗氏诊断有限公司；高速台式冷冻离心机，湘仪离心机厂；切向流超滤系统，美国Merck Millipore公司；冷冻干燥机；美国VirTis公司；电子天平，德国Sartorious公司；数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；全自动生化分析仪，日本岛津公司。
(4)实验方法
自发性Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠，6～8周龄，体重为30±5g/只，先以普通饲料适应性喂养1周，之后再予高糖高脂饲料喂养2周。禁食不禁水12h，于早晨9时尾尖采血测空腹血糖，空腹血糖大于11.1mmol/L者确定为建模成功的小鼠，可用于实验中。C57BL/6J小鼠，6～8周龄，体重为20±5g/只，以普通饲料喂养3周，禁食不禁水12h，早晨9时断尾法取血测随机血糖，血糖在4.4～7.9mmol/L者确定为血糖正常的小鼠，可用于实验中。
将造模成功的Ⅱ型糖尿病KKAy模型小鼠随机分成5组(n＝6)，分别为糖尿病模型对照组、阳性对照组(灌胃盐酸二甲基双胍)和灰兜巴多糖实验组(灰兜巴粗多糖组、灰兜巴多糖1组、灰兜巴多糖2组，灌胃剂量为200mg/kg)，以C57BL/6J的正常小鼠为正常对照组(灌胃生理盐水)。
各组小鼠每天灌胃给药一次，连续灌胃给药35d。分别于给药前和给药后第7d,14d,21d,28d,35d测定空腹血糖。实验周期结束后，尾静脉取血用血糖仪测定空腹血糖作为0min的血糖值。然后给予2g/kg的葡萄糖溶液灌胃，糖负荷后第30、60、90、120min时尾静脉采血测定血糖值，绘制葡萄糖耐量曲线。然后小鼠眼眶取血，置于用EDTA(抗凝血剂)包被的2mL离心管中，4℃下4000r/min离心10min，小心地将血清和红细胞迅速分离，收集血清，按照糖化血红蛋白、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白试剂盒的说明书所规定的测定方法，利用全自动生化仪测定血清中糖化血红蛋白、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的水平。
(5)实验结果
结果表明：模型组KKAy小鼠的空腹血糖明显高于正常组C57BL/6J小鼠。经连续35d的灌胃给药治疗，灰兜巴多糖1、灰兜巴多糖2和灰兜巴多糖均能降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的空腹血糖，与模型组相比有明显差异。降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠空腹血糖的效果依次为灰兜巴多糖2>灰兜巴多糖1>灰兜巴多糖，其中灰兜巴多糖2的效果最佳。结果见表1。
表1灰兜巴多糖对Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠空腹血糖的影响
注：与正常组比较ap<0.05；与模型组比较bp<0.05
Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠糖化血红蛋白明显升高，显著高于正常组C57BL/6J小鼠。经过连续35d灌胃灰兜巴多糖治疗，灰兜巴多糖1、灰兜巴多糖2和灰兜巴多糖均能降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的糖化血红蛋白，与模型对照组相比有显著差异。其中灰兜巴多糖2降低KKAy小鼠糖化血红蛋白的效果最好，但低于盐酸二甲双胍的作用效果。结果见表2。
表2灰兜巴多糖对Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠糖化血红蛋白的影响
注：与正常组比较ap<0.05；与模型组比较bp<0.05
模型组KKAy小鼠葡萄糖耐量显著低于正常组C57BL/6J小鼠，体现了葡萄糖不耐受的Ⅱ型糖尿病典型特征。经过灰兜巴多糖给药治疗，灰兜巴多糖1、灰兜巴多糖2和灰兜巴多糖均能改善Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的葡萄糖耐量，灰兜巴多糖2对糖尿病KKAy小鼠的糖耐受量具有十分明显的改善作用，但低于阳性药盐酸二甲双胍的作用效果。结果见表3。
表3灰兜巴多糖对Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠葡萄糖耐量的影响
注：与正常组比较ap<0.05；与模型组比较bp<0.05
Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠血清中TC、TG、LDL-c含量显著升高，明显高于正常对照组C57BL/6J小鼠；而HDL/LDL降低，明显低于正常对照组C57BL/6J小鼠，表明KKAy小鼠的脂质代谢紊乱，高血脂症伴随着高血糖症。经过灌胃灰兜巴多糖治疗，灰兜巴多糖、灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2能不同程度地降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的TC、TG和LDL-c，以及不同程度的升高HDL/LDL，但低于阳性药盐酸二甲基双胍的作用效果，证实灰兜巴多糖2具有良好的调节血脂水平，改善脂质代谢异常的作用，预防动脉硬化和血栓形成，防治糖尿病心血管并发症。结果见表4。
表4灰兜巴多糖对Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠血脂水平的影响
注：与正常组比较ap<0.05；与模型组比较bp<0.05
实施例5：灰兜巴多糖的体外抗氧化作用实验
(1)实验样品
本发明提取分离的灰兜巴多糖1、2，为淡黄色固体粉末；利用现有技术提取的灰兜巴多糖，为灰褐色。
(2)实验试剂和仪器
甲醇，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，天津富宇化工试剂有限公司；二氧化锰，天津市科密欧化学试剂有限公司；DPPH、ABTS、Vc，美国Sigma公司。数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；切向流超滤系统，美国Merck Millipore公司；低速离心机，北京时代北利离心机有限公司；冷冻干燥机，美国VirTis公司；酶标仪，瑞士TECAN公司。
(3)实验方法
DPPH清除能力：取一定量的DPPH粉末溶于甲醇中，配制成6mmol/L的DPPH储备液。在使用时，用甲醇稀释将DPPH储备液为60μmol/L的DPPH工作液。称取灰兜巴多糖溶于蒸馏水中，分别配制成浓度为0.01，0.05，0.1，0.15，0.2mg/mL的多糖溶液。再加入150μL新配制的DPPH工作液和150μL的95％乙醇溶液，摇匀后，黑暗下放置30min，在5l7nm下测定吸光度值记为A样品，以乙醇代替DPPH乙醇溶液测定吸光值记为A背景，以去离子水代替样品溶液测定吸光值记为A空白。配制浓度为0.01，0.05，0.1，0.15，0.2mg/mL的Vc溶液，重复以上步骤作为阳性对照。平行测定三次后取平均值。按下式计算DPPH清除率：
ABTS清除能力：用pH 7.4的PBS缓冲液配置成最终浓度为5mmol/L ABTS水溶液，室温下与过量的二氧化锰(MnO2)反应后，经0.2μm的PVDF微孔滤膜过滤，制得ABTS存储液，使用时用pH7.4的PBS缓冲液稀释至734nm处吸光度为0.70±0.02得到ABTS工作液。在96孔板中加入20μL的样品溶液，然后加入180μL的ABTS工作液，振荡混合均匀，室温下后测定其在734nm处的吸光值记为A’样品，以缓冲液代替ABTS工作液测定的吸光值记为A’背景，以缓冲液代替样品溶液作为空白对照A’空白。平行测定三次后取平均值。ABTS自由基清除率根据下式计算：
(4)实验结果
由图3可知，灰兜巴多糖对DPPH自由基的清除能力强弱依次为灰兜巴多糖2>灰兜巴多糖>灰兜巴多糖1，其中灰兜巴多糖2清除DPPH自由基的能力最强。但与阳性对照Vc相比，灰兜巴多糖2的清除DPPH能力明显低于Vc。
由图4可知，在较低浓度下，灰兜巴多糖、灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2对ABTS自由基的清除能力相差不大，随着灰兜巴多糖浓度的升高，其清除ABTS自由基的能力逐渐增强。清除ABTS自由基的能力强弱依次为：灰兜巴多糖2>灰兜巴多糖>灰兜巴多糖1，其中灰兜巴多糖2清除ABTS的能力最强，但均低于抗氧化剂Vc清除ABTS自由基的能力。
以上实验证明，灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2具有降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的空腹血糖和糖化血红蛋白，改善葡萄糖耐量，改善糖脂代谢，以及体外抗氧化作用，其中灰兜巴多糖2的降血糖、降血脂和抗氧化作用最强，提示本发明公开的制备方法能高效地筛选出活性更高的灰兜巴多糖。

Claims (10)

1.一种灰兜巴多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将灰兜巴除杂洗净并干燥，粉碎得灰兜巴粉；
(2)向灰兜巴粉中加入去离子水进行多糖提取，离心得上清液；
(3)上清液经脱色脱蛋白后，再将溶液经过超滤膜分离纯化，收集截留端和透过端流出的溶液分别得到灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2；其中，用活性炭脱色，用Sevag法脱蛋白；
(4)向灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2中加入无水乙醇，使最终的乙醇体积分数为80～90％，静置离心，收集沉淀；
(5)将沉淀物冷冻干燥，得粉末状的灰兜巴多糖1和灰兜巴多糖2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中灰兜巴的重量与去离子水的体积之比为1:25～1:30g/ml。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)提取温度为90～95℃，提取时间2.5～3.0h，提取次数为2～3次。
4.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述脱色脱蛋白为：向上清液中加入2％～5％的活性炭，55～60℃下振荡2～3h，离心去除沉淀；向清液中加入Sevag试剂，Sevag试剂的体积与灰兜巴多糖溶液体积之比为1:4，磁力搅拌，分液收集上层清液，再加入Sevag试剂，重复操作5～10次；静置，去除中层和下层，保留上层。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述Sevag试剂包括氯仿和正丁醇，其中，氯仿与正丁醇的体积之比为4:1。
6.根据权利要求1或2或3的制备方法，其特征在于，步骤(4)中静置的温度为0～4℃，时间为12～24h；离心速度为4000～5000rmp/min。
7.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述离心为4000～5000rmp/min的转速离心10～15min。
8.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中使用10kDa的超滤膜。
9.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中干燥温度为40～50℃。
10.权利要求1～9任意一项所述方法制备的灰兜巴多糖，其特征在于，该灰兜巴多糖的峰位分子量Mp为5000～15000Da，重均分子量Mw为7000～90000Da，数均分子量Mn为5000～30000Da。
CN201610330803.2A 2016-05-17 2016-05-17 一种灰兜巴多糖及其制备方法 Pending CN105906737A (zh)

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