CN105294879B - 一种桑枝抗肿瘤活性多糖rmpw‑2的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW‑2的制备方法。桑枝粉经石油醚回流脱脂、经乙醇回流除去苷类和生物碱等小分子物质后，用双蒸馏水提取出粗多糖，经Sevag法除去蛋白质后，依次用乙醇两次沉淀，再用DEAE琼脂糖凝胶离子交换层析分离出酸性多糖组分，接着经丙烯葡聚糖凝胶S‑100层析脱盐后，经丙烯葡聚糖凝胶S‑300层析纯化，收集第2个洗脱峰对应的洗脱液，减压浓缩，冷冻真空干燥得到所述产物。本发明制备的产物，纯度均一，分子量约为5.06×103Da，对人宫颈癌细胞Hela和人胃癌细胞SGC‑7901的生长有明显抑制作用，对人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响，可用于抗肿瘤产品开发。
Description
技术领域
本发明涉及了一种多糖的制备方法，尤其是涉及了一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2的制备方法。
背景技术
多糖(polysaccharide)又称多聚糖，是由单糖聚合而成并且聚合度大于10的极性复杂大分子，分子量一般为数万甚至数百万。多糖是继蛋白质、核酸之后，又一携带大量生物信息的生物大分子，来源于真菌、藻类地衣、植物、细菌、动物等。大量的药理和临床研究表明，天然多糖具有有效的抗癌作用，而且毒副作用较小，展现出广阔的研究和应用前景。
桑枝(Ramulus mori)是桑科植物桑(Morus alba)的干燥枝条，性平味苦，入肝、脾、肺、肾经，一直是民间常用中药。研究表明，桑枝多糖具有降血糖、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种药理活性，但药用机理尚不清楚，这阻碍了桑枝药用水平提高及药用范围扩大。分离纯化制备桑枝抗肿瘤活性成分，对于推进桑枝药用开发具有积极的现实意义。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2的制备方法，是采用回流提取、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离和Sephacryl S-100、S-300层析柱纯化的方法，制备桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1)采集桑树春季新生嫩桑枝或春季老桑枝，太阳光下自然晒干，切片，于40℃烘箱中烘干至恒重，高速粉碎机粉碎后过80-100目筛，得到桑枝粉；
2)将桑枝粉经石油醚回流脱脂、经乙醇回流除去苷类和生物碱等小分子物质后获得桑枝粉残渣；
3)将桑枝粉残渣加入双蒸馏水从桑枝中提取出粗多糖；
4)将粗多糖用Sevag法除去蛋白质，并用乙醇进行两次沉淀；
5)接着依次通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离洗脱、通过Sephacryl S-100层析柱除盐洗脱、通过Sephacryl S-300层析柱纯化洗脱后，收集第2个洗脱峰的洗脱液，得到多糖组分RMPW-2。
所述步骤2)将桑枝粉进行脱脂、除苷类和生物碱具体为：
2.1)取桑枝粉，按质量体积比(W：V)为1:10加入石油醚溶液，在90℃下回流脱脂1h后抽滤；
2.2)取残渣用10倍体积质量浓度为80％乙醇在100℃下回流1h后抽滤；
2.3)重复上述步骤2.2)一次，然后取残渣于40℃烘箱中烘干。
所述步骤3)加入双蒸馏水从桑枝中提取出粗多糖具体为：
3.1)将烘干桑枝粉残渣按质量体积比(W：V)为1：10加入双蒸馏水，超声波处理40min后，于100℃下提取2h抽滤，获得残渣和滤液；
3.2)取步骤3.1)得到的残渣再重复上述步骤3.1)一次，获得残渣和滤液；
3.3)合并步骤3.1)和步骤3.2)得到的滤液，在50℃减压浓缩至原体积的1/3，从而从桑枝中提取出粗多糖。
所述步骤4)将粗多糖用Sevag法除去蛋白质具体为：将粗多糖液用Sevage溶液反复除蛋白多次直到碘颜色反应和茚三酮反应均检测不到蛋白质，Sevage溶液中氯仿:正丁醇的质量比为4:1，然后于50℃下减压浓缩并除去氯仿和正丁醇。
所述步骤4)第一次用乙醇进行沉淀具体为：将除去蛋白质的粗多糖液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，获得第一次沉淀后的多糖。
所述步骤4)第二次用乙醇进行沉淀具体为：将第一次沉淀后的多糖按质量体积比(W：V)为1:5加入双蒸馏水溶解，加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到60％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，得到沉淀多糖。
所述步骤5)通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱洗脱分离具体为：将沉淀多糖用双蒸馏水溶解配制成20mg/mL溶液，8000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱用0.1M NaCl液以3.0-3.4mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分，取名为RMPW。
所述步骤5)通过Sephacryl S-100层析柱除盐洗脱具体为：将酸性多糖组分RMPW用双蒸馏水溶解配制成10mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，上Sephacryl S-100层析柱用双蒸馏水以0.5-0.7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩成浓度为10mg/mL。
所述步骤5)通过Sephacryl S-300层析柱洗脱纯化具体为：将所述Sephacryl S-100层析柱除盐洗脱后得到的浓缩液上Sephacryl S-300层析柱用双蒸馏水以0.5-0.7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集第2个洗脱峰的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到均一的多糖组分，取名为RMPW-2。
本发明制备得到的多糖组分RMPW-2采用配有TOSOH BIOSEP G4000SWXL糖类分析柱的Waters525型高效液相色谱系统，以Waters 2410示差折光检测器检测RMPW-2，如图1所示，呈现单一对称峰，对照标准曲线计算分子量为为5.06×103Da。
另一方面，采用MTT法检测RMPW-1对人宫颈癌细胞Hela和人胃癌细胞SGC-7901的生长均表现出明显的抑制作用(如表1所示)，在浓度1.6mg/mL时的抑制率分别为44.06％和32.57％，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响(如表2所示)，在浓度1.6mg/mL时，相对于对照组细胞活力分别为100.58％和110.98％。
表1
表2
所述的减压均通过减压泵进行减压。
本发明涉及的质量体积比的单位均为g：mL。
本发明具有的有益效果是：
本发明制备的桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2，纯度均一，分子量为5.06×105Da，对人宫颈癌细胞Hela和人胃癌细胞SGC-7901的生长均表现出明显的抑制作用，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响，可用于抗肿瘤产品的开发，这对于提升桑枝的药用价值，具有积极的社会效益和经济效益。
附图说明
图1是RMPW-2纯度检测的凝胶色谱图。
表1是RMPW-2对肿瘤细胞生长的影响。
表2是RMPW-2正常细胞生长的影响。
具体实施方式
下面结合附图表和实施例对本发明作进一步说明。
本发明以下各个实施例均采用以下方式先获得桑枝原料：
实施之前，先将春季新生嫩桑枝或春季老桑枝，太阳光下自然晒干，切片，于40℃烘箱中烘干至恒重，高速粉碎机粉碎后过80-100目筛，得到桑枝粉；
取桑枝粉，按W：V为1:10加入石油醚溶液，在90℃下回流脱脂1h，抽滤，残渣用10倍体积质量浓度为80％乙醇在100℃下回流1h，除去苷类和生物碱，重复1次，抽滤，残渣于40℃烘干，获得桑枝粉残渣。
实施例1：
取过100目筛的春季新生嫩桑枝粉按上述方法脱脂、除苷类和生物碱后获得桑枝粉残渣，按1g：10mL料液比加入双蒸馏水，超声波处理40min后，于100℃下提取2h再抽滤，重复1次，合并两次抽滤得到的滤液，在50℃减压浓缩至原体积的1/3，提取出粗多糖；
将粗多糖液用Sevage溶液反复除蛋白多次直到碘颜色反应和茚三酮反应均检测不到蛋白质，Sevage溶液中氯仿:正丁醇的质量比为4:1，然后于50℃下减压浓缩并除去氯仿和正丁醇；将除去蛋白质的粗多糖液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，获得第一次沉淀后的多糖；接着按质量体积比(W：V)为1:5加入双蒸馏水溶解，加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到60％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，得到沉淀多糖。
将沉淀多糖用双蒸馏水溶解配制成20mg/mL溶液，8000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱用0.1M NaCl液以3.2mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分RMPW。
将酸性多糖组分RMPW用双蒸馏水溶解配制成10mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，上Sephacryl S-100层析柱用双蒸馏水以0.6mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩成浓度为10mg/mL。
将Sephacryl S-100层析柱除盐洗脱后得到的浓缩液上Sephacryl S-300层析柱用双蒸馏水以0.6mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集第2个洗脱峰的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到均一的多糖组分RMPW-2。
RMPW-2纯度均一(图1)，分子量5.06×103Da，在浓度1.6mg/mL时，对人宫颈癌细胞Hela和人胃癌细胞SGC-7901生长的抑制率分别为43.86％和33.27％，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响。
实施例2：
取过80目筛的春季老桑枝粉按上述方法脱脂、除苷类和生物碱后获得桑枝粉残渣，按1g：10mL料液比加入双蒸馏水，超声波处理40min后，于100℃下提取2h再抽滤，重复1次，合并两次抽滤得到的滤液，在50℃减压浓缩至原体积的1/3，提取出粗多糖；
将粗多糖液用Sevage溶液反复除蛋白多次直到碘颜色反应和茚三酮反应均检测不到蛋白质，Sevage溶液中氯仿:正丁醇的质量比为4:1，然后于50℃下减压浓缩并除去氯仿和正丁醇；将除去蛋白质的粗多糖液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，获得第一次沉淀后的多糖；接着按质量体积比(W：V)为1:5加入双蒸馏水溶解，加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到60％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，得到沉淀多糖。
将沉淀多糖用双蒸馏水溶解配制成20mg/mL溶液，8000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱用0.1M NaCl液以3.4mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分RMPW。
将酸性多糖组分RMPW用双蒸馏水溶解配制成10mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，上Sephacryl S-100层析柱用双蒸馏水以0.5mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩成浓度为10mg/mL。
将Sephacryl S-100层析柱除盐洗脱后得到的浓缩液上Sephacryl S-300层析柱用双蒸馏水以0.7mL/min流速洗脱，洗脱后用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集第2个洗脱峰的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到均一的多糖组分RMPW-2。
RMPW-2纯度均一(与实施例1中的图1相似)，分子量5.06×103Da，在浓度1.6mg/mL时，对人宫颈癌细胞Hela和人胃癌细胞SGC-7901生长的抑制率分别为44.38％和32.21％，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响。
实施例3：
取过90目筛的春季老桑枝粉按上述方法脱脂、除苷类和生物碱后获得桑枝粉残渣，按1g：10mL料液比加入双蒸馏水，超声波处理40min后，于100℃下提取2h再抽滤，重复1次，合并两次抽滤得到的滤液，在50℃减压浓缩至原体积的1/3，提取出粗多糖；
将粗多糖液用Sevage溶液反复除蛋白多次直到碘颜色反应和茚三酮反应均检测不到蛋白质，Sevage溶液中氯仿:正丁醇的质量比为4:1，然后于50℃下减压浓缩并除去氯仿和正丁醇；将除去蛋白质的粗多糖液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，获得第一次沉淀后的多糖；接着按质量体积比(W：V)为1:5加入双蒸馏水溶解，加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到60％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，得到沉淀多糖。
将沉淀多糖用双蒸馏水溶解配制成20mg/mL溶液，8000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱用0.1M NaCl液以3.0mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分RMPW。
将酸性多糖组分RMPW用双蒸馏水溶解配制成10mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，上Sephacryl S-100层析柱用双蒸馏水以0.7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩成浓度为10mg/mL。
将Sephacryl S-100层析柱除盐洗脱后得到的浓缩液上Sephacryl S-300层析柱用双蒸馏水以0.5mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集第2个洗脱峰的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到均一的多糖组分RMPW-2。
RMPW-2纯度均一(与实施例1中的图1相似)，分子量5.06×103Da，在浓度1.6mg/mL时，对人宫颈癌细胞Hela和人胃癌细胞SGC-7901生长的抑制率分别为44.46％和32.78％，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响。
由上述实施例可见，本发明制备的桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2具有其突出显著的技术效果，并具有积极的社会效益和经济效益。
Claims (6)
1.一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2的制备方法，其特征在于：
1)采集桑树春季新生嫩桑枝或春季老桑枝，太阳光下自然晒干，切片，于40℃烘箱中烘干至恒重，高速粉碎机粉碎后过80-100目筛，得到桑枝粉；
2)将桑枝粉用石油醚溶液和乙醇进行脱脂、除苷类和生物碱后获得桑枝粉残渣；
3)将桑枝粉残渣加入双蒸馏水从桑枝中提取出粗多糖；
4)将粗多糖用Sevag法除去蛋白质，并用乙醇进行两次沉淀；
5)接着依次通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离洗脱、通过Sephacryl S-100层析柱除盐洗脱、通过Sephacryl S-300层析柱纯化洗脱后，收集第2个洗脱峰的洗脱液，得到多糖组分RMPW-2；
所述步骤5)通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱洗脱分离具体为：将沉淀多糖用双蒸馏水溶解配制成20mg/mL溶液，8000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱用0.1M NaCl液以3.0-3.4mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分，取名为RMPW；
所述步骤5)通过Sephacryl S-100层析柱除盐洗脱具体为：将酸性多糖组分RMPW用双蒸馏水溶解配制成10mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，上Sephacryl S-100层析柱用双蒸馏水以0.5-0.7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩成浓度为10mg/mL；
所述步骤5)通过Sephacryl S-300层析柱洗脱纯化具体为：将所述Sephacryl S-100层析柱除盐洗脱后得到的浓缩液上Sephacryl S-300层析柱用双蒸馏水以0.5-0.7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集第2个洗脱峰的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到均一的多糖组分，取名为RMPW-2。
2.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2的制备方法，其特征在于：
所述步骤2)将桑枝粉进行脱脂、除苷类和生物碱具体为：
2.1)取桑枝粉，按质量体积比(W：V)为1:10加入石油醚溶液，在90℃下回流脱脂1h后抽滤；
2.2)取残渣用10倍体积质量浓度为80％乙醇在100℃下回流1h后抽滤；
2.3)重复上述步骤2.2)一次，然后取残渣于40℃烘箱中烘干。
3.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2的制备方法，其特征在于：
所述步骤3)加入双蒸馏水从桑枝中提取出粗多糖具体为：
3.1)将烘干桑枝粉残渣按质量体积比(W：V)为1：10加入双蒸馏水，超声波处理40min后，于100℃下提取2h抽滤，获得残渣和滤液；
3.2)取步骤3.1)得到的残渣再重复上述步骤3.1)一次，获得残渣和滤液；
3.3)合并步骤3.1)和步骤3.2)得到的滤液，在50℃减压浓缩至原体积的1/3，从而从桑枝中提取出粗多糖。
4.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2的制备方法，其特征在于：所述步骤4)将粗多糖用Sevag法除去蛋白质具体为：
将粗多糖液用Sevage溶液反复除蛋白多次直到碘颜色反应和茚三酮反应均检测不到蛋白质，Sevage溶液中氯仿:正丁醇的质量比为4:1，然后于50℃下减压浓缩并除去氯仿和正丁醇。
5.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2的制备方法，其特征在于：所述步骤4)第一次用乙醇进行沉淀具体为：
将除去蛋白质的粗多糖液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，获得第一次沉淀后的多糖。
6.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-2的制备方法，其特征在于：所述步骤4)第二次用乙醇进行沉淀具体为：
将第一次沉淀后的多糖按质量体积比(W：V)为1:5加入双蒸馏水溶解，加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到60％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，得到沉淀多糖。
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