CN106319012A - 一种利用文蛤蛋白制备α‑葡萄糖糖苷酶抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用文蛤蛋白制备α‑葡萄糖糖苷酶抑制剂的方法，属于天然活性物质制备技术领域。本发明方法以文蛤蛋白为原料，经过烘干、粉碎，加一定量筛选出的蛋白酶进行可控酶解，经过灭酶、离心等处理，得到α‑葡萄糖糖苷酶抑制剂的酶解液。本发明为开发基于食品原料海洋动物蛋白可控酶解后肽类的α‑葡萄糖糖苷酶抑制剂以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定基础。

Description

一种利用文蛤蛋白制备α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的方法
技术领域
本发明涉及一种利用文蛤蛋白制备α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的方法，属于天然活性物质制备技术领域。
背景技术
糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，其基本病理特点为胰岛素分泌绝对或者相对不足，或者外周组织对胰岛素不敏感，引起以糖代谢紊乱为主，并包括脂肪、蛋白质代谢紊乱的一种全身综合性疾病。治疗糖尿病的作用机理是直接或者间接增加胰岛素的分泌量，抑制胰高血糖素分泌，改善胰岛素抵抗，刺激胰腺导管前体细胞分化再生胰岛β细胞，抑制胰岛β细胞过度凋亡；糖分解过程中的各种酶抑制剂也是糖尿病的治疗思路。
α-葡萄糖苷酶是一类主要分布于小肠上皮绒毛膜刷状沿上，可降解蔗糖、麦芽糖、乳糖在内的一系列低聚糖的糖苷酶。α-葡萄糖苷酶抑制剂可竞争性抑制葡萄糖苷水解酶，进而抑制多糖及蔗糖的分解，抑制碳水化合物在小肠上部的吸收，缓解餐后血糖的升高，预防因血糖波动引发的心血管疾病等。目前抑制α-糖苷酶水解的药物主要是阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇、乙格列酯，都属于化学合成类药物，主要依靠进口，价格昂贵、产率低、活性低及生产过程中存在的安全性和设备要求高等问题。
我国拥有丰富的海洋动物资源，如果能利用现代生物技术对海洋动物蛋白质资源进行深加工，合理的选用靶酶类用以制备相对应的天然抑制剂等产物，将使海洋动物生物活性产物的研究具有更广阔的前景。天然海洋蛋白原料可控酶解法制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂还可以作为一种合适的辅助降血糖类保健功能食品的生产原料。
发明内容
为了解决目前关于α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的低产率、低活性和高成本，以及生产过程中存在的安全性和设备要求高等问题，本发明提供了一种利用海洋动物蛋白制备α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的方法，采用绿色生物转化的理念，重点创新基于生物酶定点催化可控酶解制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的高效生产技术，实现了海洋动物蛋白资源的高值化利用。
本发明的制备α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的方法，包括：以高蛋白海洋动物为原料，原料经脱水、烘干、粉碎得到文蛤蛋白粉后，加入蛋白酶进行第一次酶解，在酶解后的上清液中加入蛋白酶进行第二次酶解，煮沸灭酶，收集第二次酶解的上清液，即为富含α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的酶解液。
在本发明的一种实施方式中，所述高蛋白海洋动物为文蛤。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次酶解所用的蛋白酶优选为碱性蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，所述第二次酶解所用的蛋白酶为复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、氨肽酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶中的任意一种或者多种，并最终选出其中效果最佳的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述复合蛋白酶为购自诺维信公司的型号为Protamex的复合蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次酶解的反应条件如下：文蛤蛋白粉：缓冲液＝1:70～1:100(质量体积比，单位g/mL)，蛋白酶添加量6-10KU/g干基质，反应温度45～55℃，反应时间4～8h。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次酶解和第二次酶解的酶解反应是在pH 8～10下进行。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次酶解的反应条件如下：文蛤蛋白粉：缓冲液＝1:100(m/v，单位g/mL)，蛋白酶添加量8KU/g干基质，反应温50℃，反应时间6h。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为NaHPO4-NaH2PO4(0.02mol/L，pH9.0)缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述的第二次酶解的反应条件如下：按照1.5×104U/mL～2.5×104U/mL的量添加蛋白酶，酶解时间为2-4h，反应温度45～55℃。
在本发明的一种实施方式中，所述的第二次酶解的反应条件如下：按照2×104U/mL的量添加蛋白酶，酶解时间为3h，反应温度50℃。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括将富含α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的酶解液进行干燥得到α-葡萄糖糖苷酶抑制剂产品。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
(1)新鲜的文蛤蛋白经脱水，烘干至2～10％含水量，然后粉碎至0.025～0.1mm；
(2)于步骤(1)粉碎后物料中加入一定量碱性蛋白酶，混合均匀，置于反应器中45～55℃反应一段时间，离心后，收集上清液；
(3)取步骤(2)中上清液重新以1.5×104U/mL～2.5×104U/mL的量加入蛋白酶，混合均匀，45～55℃下反应2-4h，灭酶，收集滤液，即为富含α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的酶解液，保藏备用；
(4)将收集步骤(3)中的滤液混匀后，经干燥得到α-葡萄糖糖苷酶抑制剂。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述蛋白酶主要是指复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、氨肽酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶中的任意一种，并最终优选出复合蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中的干燥是指空气喷雾干燥和/或冷冻干燥，目的产物为粉末状固体，得率为30–60％，即1g文蛤蛋白粉可得到粉末状固体0.3-0.6g。
本发明还要求保护按照上述所述的方法得到的α-葡萄糖糖苷酶抑制剂，及其在制备药物方面的应用。
所述药物，是指治疗和/或抑制和/或缓解糖尿病或者心脑血管疾病的药物。
本发明的有益效果：
(1)我国拥有丰富的海洋动物资源，本发明利用现代生物技术对蛋白质资源进行深加工，合理的选用酶类等用以制备蛋白酶抑制剂等天然产物，使海洋动物生物活性的研究具有更广阔的前景。
(2)以文蛤蛋白为原料，用蛋白酶对文蛤中蛋白进行组合可控酶解获得具备α-葡萄糖糖苷酶抑制活性的酶解液。该酶解液主要成分为多肽类，具有良好的热稳定性、一定的抗氧化性及对个别蛋白酶表现出一定的抑制性。所得天然食物来源的肽类有药食两用的保健治疗作用。对未来的医药保健与食品的健康发展具有推动与促进意义。
(3)按照本发明方法得到的富含α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的文蛤酶解液，多肽浓度为3.75mg/ml，对0.5mg/ml的α-糖苷酶抑制率为56.44％，文蛤蛋白酶解液中相对分子质量占1000Da以下的要占95.18％；对α-葡萄糖苷酶、木瓜蛋白酶都有抑制效果，而且还具有一定的抗氧化性。
(4)按照本发明方法，利用1g文蛤蛋白粉可得到粉末状α-葡萄糖糖苷酶抑制剂0.3-0.6g。
附图说明
图1为文蛤蛋白制备α-葡萄糖糖苷酶抑制剂流程图；
图2为文蛤酶解液多肽分子量分布图；
图3为文蛤酶解液的温度稳定性；
图4为文蛤酶解液抑制糖苷酶活性的“量-效”关系曲线；
图5为文蛤酶解液抑制木瓜蛋白酶活性的“量-效”关系曲线。
具体实施方式
α-葡萄糖糖苷酶抑制率的测定：
采用PNPG法，首先取1mL待测样品加入离心管中，接着加入1ml的0.5mg·mL-1α-葡萄糖苷酶，混合均匀后于37℃水浴保温100min，再加入1mL的10mmol·L-1PNPG反应1h后加入1mL的1mol·L-1Nα2CO3终止反应，在405nm处测定吸光度Αi；1mL待测样品加入离心管中，接着加入1mL的0.5mg·mL-1α-葡萄糖苷酶，混合均匀后于37℃水浴保温10min，加入1mL的磷酸钠缓冲液反应1h，操作同上，吸光值为Αj；取1mL缓冲液加入离心管中，操作同上，吸光值为Αo，样品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率的公式：
实施例1：文蛤蛋白的制备与第一次酶解
以文蛤蛋白粉为原料，溶于质量体积比为1:100的NaHPO4-NaH2PO4(0.02mol/L，pH9.0)缓冲液中，碱性蛋白酶加入量E/S＝8000U/g文蛤蛋白粉，充分混合后50℃酶解6h。酶解结束后煮沸灭酶15min，静止冷却后离心(8000r/min)，弃去沉淀得到含有α-糖苷酶抑制剂的文蛤酶解液。酶解液中多肽浓度约为2.89mg/ml，酶解原液对α-葡萄糖糖苷酶抑制率达到50％左右。
此外，发明人还尝试过分别采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶酶解文蛤粉，测定酶解液酶解前后α-葡萄糖葡萄糖糖苷酶抑制率的变化。结果发现，未酶解的文蛤蛋白粉缓冲液对α-葡萄糖糖苷酶没有抑制作用，胰蛋白酶酶解前后原液α-葡萄糖糖苷酶抑制率只增加了30％左右，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶酶解文蛤蛋白粉，α-葡萄糖糖苷酶抑制率几乎没有变化或者降低。
由此可见，碱性蛋白酶酶解文蛤产物的前后α-葡萄糖糖苷酶抑制性效果要显著好于其他酶的酶解效果。
实施例2：二次酶解文蛤蛋白粉制备α-糖苷酶抑制剂
第一次酶解：新鲜的文蛤蛋白经脱水，烘干至5％含水量，然后粉碎得到文蛤蛋白粉，以文蛤蛋白粉为原料，溶于质量体积比为1:100的NaHPO4-NaH2PO4(0.02mol/L，pH9.0)缓冲液中，碱性蛋白酶加入量E/S＝8000U/g文蛤蛋白粉，充分混合后50℃酶解6h，离心、取上清液，即得到第一次酶解液。
第二次酶解：向第一次酶解液中重新加入2×104U/mL蛋白酶，混合均匀，置于50℃的反应器中反应3h，灭酶，离心后，收集滤液，即为富含α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的文蛤酶解液，保藏备用。
发明人尝试了分别使用复合蛋白酶(购买自诺维信公司，型号为Protamex)、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶进行第二次酶解，并比较了最终酶解液分子量的差异及对α-糖苷酶抑制率的变化。结果显示，(1)二次酶解后酶解液一千以上的分子量含量均有降低，说明一次酶解所获得的α-糖苷酶抑制剂为混合肽类，它可以被蛋白酶继续降解发生分子量的变化；(2)除了复合蛋白酶外，酶解液中α-糖苷酶抑制率均降低；中性蛋白酶酶解液α-糖苷酶抑制活性下降5％左右，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的继续降解酶解液α-糖苷酶抑制活性下降超过10％；复合蛋白酶酶解液α-糖苷酶抑制活性不降反而提高，酶解液抑制活性提高到55％以上。这可能是因为复合蛋白酶具有内切与外切两种蛋白酶活性，通过它进一步对一次酶解液的协同水解作用后所获得的特定水解肽产物区段的活性有提高，二次酶解也同时考察了一次酶解产物对几种蛋白酶的敏感性，最终优选出复合蛋白酶为二次可控酶解的最佳酶类。
经复合蛋白酶处理得到的文蛤酶解液的多肽浓度为3.75mg/ml，酶解原液对0.5mg/ml的α-糖苷酶抑制率为56.44％。
将富含α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的文蛤酶解液，经空气喷雾干燥和/或冷冻干燥得到粉末状固体，得率为30–60％，即1g文蛤蛋白粉可得到粉末状固体0.3-0.6g。
实施例3：肽分子量分布
将细胞色素(MW 12500)，乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸(MW 451)，杆菌酶(MW1450)，乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸(MW 189)标准品用0.22μm滤膜处理后，经过以下色谱条件上样：液相色谱柱TSKgel 2000SWxl(300mm×7.8mm，5μm)；柱温30℃，流动相：水：三氯乙酸：乙腈＝550:450:1(V:V)，流速为1mL·min-1，进样量5μL，检测波长为220nm，根据出峰图绘制相对分子质量校正曲线。
取实施例2得到的文蛤酶解液5mL与10％的三氯乙酸5mL混合均匀，静止10min，10000r·min-1离心10min，上清液用0.22μm滤膜处理，相同色谱条件下上样测量α-糖苷酶抑制剂的分子量分布，结果表明文蛤蛋白酶解液中相对分子质量占1000Da以下的要占95.18％。
实施例4：文蛤蛋白二次酶解所得α-糖苷酶抑制剂特性分析鉴定
将实施例2得到的经二次酶解的富含α-糖苷酶抑制剂的文蛤酶解液进行生物活性及性质的表征，主要包括热稳定性、糖苷酶抑制率、蛋白酶抑制率及抗氧化性等。
(1)温度稳定性
将文蛤酶解液37℃、40℃、50℃、60℃和70℃下保温5h，测定酶解液的α-糖苷酶活性抑制率。结果如图3所示，由图3可知，37℃下对α-糖苷酶活性抑制率达56.5％左右，在50℃抑制率保持在53％左右，70℃下抑制率也能维持在47％左右。以上数据表明，按照本发明方法得到的文蛤酶解液具有良好的温度稳定性。
(2)糖苷酶抑制率的测定
首先取1mL待测样品(调整文蛤酶解液浓度，配置多肽浓度不同的样品)加入离心管中，接着加入1mL的0.5mg·mL-1α-葡萄糖苷酶，混合均匀后于37℃水浴保温100min，再加入1mL的10mmol·L-1PNPG反应1h后加入1mL的1mol·L-1Nα2CO3终止反应，在405nm处测定吸光度Αi；1mL待测样品加入离心管中，接着加入1mL的0.5mg·mL-1α-葡萄糖苷酶，混合均匀后于37℃水浴保温10min，加入1mL的磷酸钠缓冲液反应1h，操作同上，吸光值为Αj；取1mL缓冲液加入离心管中，操作同上，吸光值为Αo，样品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制量效曲线如图4所示。在一定范围内抑制率随着样液的含量增加而增加，其IC50为2.16mg/ml。
(3)蛋白酶抑制率的测定
蛋白酶抑制剂可以通过调节生物体内蛋白质的降解达到一定的保健与治疗疾病的目的，用天然活性物质酶解后提取制备的蛋白酶抑制剂可以克服传统生化蛋白酶抑制剂在食品、医药上的弊端，具有广泛应用前景。
采用福林酚测蛋白法：准确吸取酶液1mL，缓冲液1mL，在40℃恒水浴中预热l～2min，加入0.4mol/L三氯醋酸2mL摇匀使酶变性失活，2％酪蛋白溶液lmL，40℃反应10min，静置10min，吸取滤液1ml加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂1mL，40℃恒温水浴内保温20min显色。吸光值Αj(680nm)；准确吸取酶液1mL，样液1mL，(样液指本发明的文蛤酶解液配置的不同浓度的多肽溶液)在40℃恒水浴中预热l～2min，加入2％酪蛋白溶液1mL，40℃反应10min，0.4mol/L三氯醋酸2mL摇匀使酶变性失活，吸取滤液1ml加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂1mL，40℃恒温水浴内保温20min显色，吸光值Αi。以缓冲液代替上述样液，吸光值Α0以缓冲液代替酪蛋白操作同上，吸光值为Αj。
测定对于1mg/ml木瓜蛋白酶抑制率为12％。
(4)抗氧化活性的测定
a.DPPH自由基清除率测定
DPPH自由基清除率(％)＝Α0-(Αs-Αc)/Α0×100％
公式中，Α0—2.0ml蒸馏水+2.0mlDPPH溶液的吸光度值
Αs—2.0ml样品溶液+2.0mlDPPH溶液的吸光度值
Αc—2.0ml样品溶液+2.0ml蒸馏水的吸光度
通过计算可得文蛤酶解液DPPH清除率为23％。
b.羟自由基(OH-)清除能力测定
采用邻氮二菲法。取0.5mL样品加入1mL 0.15mol L-1磷酸盐缓冲液(pH7.4)，接着加入0.5mL用缓冲液溶解的1.8mmol·L-1邻二氮菲溶液和0.5mL 1.8mmol L-1FeSO4水溶液，迅速混匀，最后加入0.5mL 0.02％(V/V)的H2O2，在37℃下水浴60min，于536nm下测其吸光值(Αs)。用水代替样品作为对照(Αc)。用水代替样品和H2O2作为空白(Α0)。
清除率(％)＝[(Αs-Αc)/(Α0-Αc)]×100。
通过计算可得文蛤酶解液羟自由基清除率为15.58％。
实施例5：α-糖苷酶抑制剂的制备
第一次酶解：以文蛤蛋白粉为原料，溶于质量体积比为1:70的NaHPO4-NaH2PO4(0.02mol/L，pH9.0)缓冲液中，碱性蛋白酶加入量E/S＝6000U/g文蛤蛋白粉，充分混合后55℃酶解8h，离心、取上清液，即得到第一次酶解液。
第二次酶解：向第一次酶解液中重新加入2.5×104U/mL复合蛋白酶，混合均匀，置于55℃的反应器中反应2h，灭酶，离心后，收集滤液，即为富含α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的文蛤酶解液。
得到的文蛤酶解液的多肽浓度为3.55mg/ml左右，对0.5mg/ml的α-糖苷酶抑制率为53.12％，相对分子质量占1000Da以下的占93.38％。
酶解液经干燥得到α-葡萄糖糖苷酶抑制剂。
实施例6：α-糖苷酶抑制剂的制备
第一次酶解：以文蛤蛋白粉为原料，溶于质量体积比为1:90的NaHPO4-NaH2PO4(0.02mol/L，pH9.0)缓冲液中，碱性蛋白酶加入量E/S＝10000U/g文蛤蛋白粉，充分混合后45℃酶解4h，离心、取上清液，即得到第一次酶解液。
第二次酶解：向第一次酶解液中重新加入1.5×104U/mL复合蛋白酶，混合均匀，置于45℃的反应器中反应4h，灭酶，离心后，收集滤液，即为富含α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的文蛤酶解液，得到的文蛤酶解液的多肽浓度为3.62mg/ml左右，对0.5mg/ml的α-糖苷酶抑制率为54.09％，相对分子质量占1000Da以下的占94.52％。
酶解液经干燥得到α-葡萄糖糖苷酶抑制剂。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，所述方法包括：以高蛋白海洋动物为原料，原料经脱水、烘干、粉碎后，加入碱性蛋白酶进行第一次酶解，在酶解后的上清液中加入蛋白酶进行第二次酶解，灭酶，收集第二次酶解的上清液，即为富含α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的酶解液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高蛋白海洋动物为文蛤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二次酶解所用的蛋白酶为复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、氨肽酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶中的任意一种或者多种，并最终选出其中效果最佳的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次酶解的反应条件如下：文蛤蛋白粉:缓冲液＝1:70～1:100(v/m)，碱性蛋白酶添加量6～10KU/g干基质，反应温度45～55℃，反应时间4～8h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二次酶解的反应条件如下：按照1.5×104U/mL～2.5×104U/mL的量添加蛋白酶，酶解时间为2～4h，反应温度45～55℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将富含α-葡萄糖糖苷酶抑制剂的酶解液进行干燥得到α-葡萄糖糖苷酶抑制剂产品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)新鲜的文蛤蛋白经脱水，烘干至2～10％含水量，然后粉碎至0.025～0.1mm；
(2)于步骤(1)粉碎后物料中加入一定量碱性蛋白酶，混合均匀，置于反应器中45～55℃反应一段时间，离心后，收集上清液；
(3)取步骤(2)中上清液重新以1.5×104U/mL～2.5×104U/mL的量加入蛋白酶，45～55℃下反应2-4h，灭酶，收集滤液，即为富含α-糖苷酶抑制剂的酶解液，保藏备用；
(4)将收集步骤(3)中的滤液混匀后，经干燥得到α-葡萄糖糖苷酶抑制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的干燥是指空气喷雾干燥和/或冷冻干燥。
9.根据权利要求1～8任一所述的方法得到的α-葡萄糖糖苷酶抑制剂。
10.权利要求9所述的α-葡萄糖糖苷酶抑制剂在制备药物方面的应用。
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CN101323640A (zh) * 2007-06-13 2008-12-17 中国科学院大连化学物理研究所 具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的酶解产物及其应用
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