KR20070034212A

KR20070034212A - 유청단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유한 면역강화 또는 항산화용 건강기능식품

Info

Publication number: KR20070034212A
Application number: KR1020050088631A
Authority: KR
Inventors: 윤영호
Original assignee: 윤영호
Priority date: 2005-09-23
Filing date: 2005-09-23
Publication date: 2007-03-28

Abstract

본 발명은 유청단백질 가수분해물 99.8% 및 아스코르브산 0.2%를 함유하는 면역강화용 또는 항산화용 건강기능식품에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 유청단백질 가수분해물은 세포내 항산화 물질은 글루타치온의 전구물질로 작용하여 세포내의 GSH 함유율을 증가시키는 활성을 가지고 있어 항산화 활성을 나타내며, 또한 면역 글루불린 IgM의 수치를 증가시켜 면역증강활성 또한 가지고 있고, 본 발명의 아스코르브산을 함께 첨가할 경우 세포내 GSH 함유율의 증가는 더욱 탁월하여 본 발명은 세포의 면역강화 또는 항산화용 건강기능식품으로서 유용하게 이용될 수 있다.

유청단백질 가수분해물, 아스코르브산, 면역강화, 항산화

Description

유청단백질 가수분해물 및 아스코르브산을 함유한 면역강화 또는 항산화용 건강기능식품{Health function food comprising whey protein hydrolysate and ascorbic acid having immunity reinforceing and antioxidative acitivy}

도 1은 전립선 세포에 대해 본 발명의 유청단백질 가수분해물이 산화제에 의한 핵손상을 방지시키는 활성을 나타낸 도이며,

도 2는 전립선 세포를 배양할 경우에 유청단백질 가수분해물을 첨가할 경우 세포내 GSH의 함유율이 상승됨을 나타낸 도이며,

도 3은 유청단백질 가수분해물이 산화제 처리에 의한 세포의 생존율을 증가시키는 효과를 나타낸 도이며,

도 4는 유청단백질의 in vivo 상태에서의 항산화 활성을 나타낸 도이며,

도 5a 및 도 5b는 유청단백질의 가공조건에 따른 활성변화를 나타낸 도로서, 간 세포의 GSH 함유율(도 5a) 및 비장 세포의 GSH 함유율(도 5b)을 나타낸 도이며,

도 6은 유청단백질의 IgM 플라크 형성 세포(IgM plaque forming cell)에 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 7은 유청단백질에 아스코르브산을 첨가할 경우 비장세포의 GSH 함유율 증가여부를 나타낸 도이다.

본 발명은 유청단백질 가수분해물 99.8% 및 아스코르브산 0.2%를 함유하는 면역강화용 또는 항산화용 건강기능식품에 관한 것이다.

유청(Whey)은 우유로 치즈를 제조할 때 생기는 부산물이다. 미황색의 액체로 수분이 대부분을 차지하며, 4-5%의 락토오스, 1% 이하의 단백질, 소량의 지방과 회분으로 구성되어 있다. 성분조성과 생산량은 치즈의 종류에 따라 다르며 훼이에는 알부민 등 수용성 단백질이 비교적 많으므로 어린이용 분유의 원료로 많이 사용되고 있다. 또한 훼이치즈, 훼이버터, 훼이분말, 농축훼이 등으로 제조하여 제과원료나 발효원료로 주로 이용되고 있다.

아스코르브산(ascorbic acid)는 수용성 비타민의 하나로서, 비타민 C라고도 한다. 아스코르브산은 괴혈병에 특효가 있는 물질로 발견되었으며, 1928년 헝가리의 A. 센트죄르지가 소의 부신피질로부터 분리하였다. 현재는 소르보오스로부터 케토굴론산을 거쳐 공업적으로 합성되고 있다. 천연에는 녹차, 레몬, 시금치, 양배추 등에 많이 함유되어 있으며, 동물체 내에는 부신피질 속에 특히 많이 함유되어 있다. 대부분의 포유류는 아스코르브산을 글루코오스로부터 합성할 수 있으나, 사람과 원숭이는 체내 합성이 불가능하므로 음식물을 통해 섭취해야만 한다. 사람과 원숭이는 아스코르브산이 결핍되면 괴혈병을 일으킨다. 화학적 성질은 분자속에서 하나의 이중결합에 2개의 수산기가 붙은 구조(엔디올기)를 가지고 있으므로 환원성이 매우 강하다. 생체 내에서는 아스코르브산 산화효소의 작용으로 산화되어 탈수소 아스코르브산이 된다. 이 반응은 가역반응으로 생체내의 산화환원상태를 일정하게 유지하는 역할을 한다. 또, 티로신, 페닐알라닌 등의 대사작용에도 중요한 구실을 하고 있고, 티로신으로부터 생성되는 흑갈색 색소인 멜라닌의 형성에도 아스코르브산이 있는 곳에서는 억제된다.

세포내 산화반응의 주원인이 되는 반응성 산소는 세포에 손상을 나타낼 수 있으며 반응성 산소의 활성을 저지 또는 제거하는 특성을 항산화 활성이라 한다. 생물체의 세포와 조직내부에 과도한 양의 반응성 산소가 존재하게 되면 조직내의 단백질 및 핵산에 산화반응을 야기시켜 단백질 기능의 변화와 단백질 및 핵산의 분해반응이 진행되어 암을 위시한 질병발생 및 노화촉진 등의 유해한 작용이 야기된다.

이에 따라 본 발명자들은 유청단백질의 가수분해물 및 이에 첨가된 아스코르브산이 반응성 산소에 대한 제거작용이 탁월하며, 면역세포생산을 증가시킴을 확인하므로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 유청단백질 가수분해물 98% 및 아스코르브산 0.2%를 함유하는 면역강화용 또는 항산화용 건강기능식품을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유청단백질 가수분해물 99.8% 및 아스코르브산 0.2%를 함유하는 면역강화용 또는 항산화용 건강기능식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 유청단백질에는 락토글루블린 및 락토알부민이 함유되어 있는바, 상기 성분들은 함유황 아미노산이 다량 함유되어 있어 이들이 장내에서 소화과정에 분해되어 라이신, 글루타민산 및 글라이신을 생성하게 되고 이들이 적절한 환경과 효소의 작용에 의하여 합성된 트리펩티드(tripeptide) 상태를 글루타치온이 세포내에 합성하게 되며 세포내에서 합성된 상기 물질은 대사과정을 원활하게 하며 특히 체내에서 생성된 노폐물질을 제거하는 과정에서 항산화 작용을 적절히 하여 세포내에 존재하는 유리기를 제거하는 역할을 한다. 따라서 본 발명에서 이용되는 유청단백질은 세포내 글루타치온 합성의 전구물질로서 작용하는 것으로 확인되었으며 이로 인하여 체내에 나타나는 효과는 면역강화 작용과 생체의 활성강화 및 세포 노화방지 작용 등으로 나타난다. 면역 강화활성결과로 암세포의 발생 및 증식억제 활성이 나타나며 특히 성인병의 예방을 위한 기능이 탁월한 것으로 알려져 있다.

면역강화기능이 촉진되는 것은 세포내 글루타치온이 면역 글로불린 합성의 구성성분으로 이용될 수 있어 면역체 생성을 원활하게 하기 때문인 것으로 이해된다.

또한 본 발명의 아스코르브산(비타민 C)은 체내에서 항산화작용의 기능과 소화를 원활히 하여 대사기능을 활성화하는 비타민으로서 특히 글루타치온과 체내에서 항산화기능을 나타낼 때 그 기능을 크게 활성화하는 시너지 효과를 나타낸다. 근래에 와서 알려진 비타민 C의 기능은 광범하여 항암 및 항노화 활성과 심장과 맥 관계통의 질환에서도 탁월한 효능을 보이며 질병의 면역생성, 골격 및 연골 조직의 재생에도 매우 중요한 기능을 한다.

따라서, 본 발명은 유청단백질 가수분해물 99.8% 및 아스코르브산 0.2%를 함유하는 면역강화용 또는 항산화용 건강기능식품을 제공한다.

상기 본 발명의 건강기능식품은 5-20g단위로, 바람직하게는 10g단위로 포장하여 사용할 수 있다.

상기 본 발명의 복용방법은 본 발명의 건강기능식품은 분말상태로서 그 작용을 원활히 하고 복용의 편의성을 고려하여 일반적으로 시판되고 있는 음료수 60-80㎖, 바람직하게는 70㎖에 상기 본 발명의 건강기능식품을 5-15g을 혼합하여 음용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.

다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 의하여 한정되지는 않는다.

실시예 1. 유청 단백질 가수분해물의 준비

유청 단백질(NZMP, Newzealand) 5% 수용액 상태에서 단백질 분해효소 플라보자임(Flavozyme Novozyme, Netherland) 0.08%로 첨가한 후 50℃를 유지하면서 3시간동안 반응시켜 유청단백질의 가수분해물을 준비하였다.

참조예 1. 통계분석

분석을 통해 얻어진 결과의 통계처리는 SAS(Window V 8.07)를 이용하여 분석하였으며 처리평균간의 유의성은 Duncan`s multiple range test에 의하여 검정하였다.

실험예 1. 유청 단백질의 산화제에 의한 핵 손상 방지

단세포 전기영동(Single cell electrophoresis, Commet assay) 실험에 있어서, 상기 실시예 1에서 제조한 유청 단백질의 가수분해물이 산화제에 의한 DNA 손상을 방지할 수 있는지 여부를 실험하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

코멧 어세이(Commet assay)는 코멧 어세이 키트(Commet assay kit, TRIVIGEN, U.S.A. Cat#4250-050-k)를 이용하여 수행하였다.

전립선 세포 PC-3M-MM2(1×10⁵cells/㎖)(KCLB, 한국세포주 은행)에 음성 대조구로서 어떤 처리를 하지 않고, 양성 대조구로서 카제인을 처리(500ug/ml)하고, 실험구로서 유청 단백질의 가수분해물을 처리(500ug/ml)한 후에 산화제 TBHP(tributyl hydroperoxide)를 1mM농도로 처리한 후 37℃에서 1시간 동안 정치시킨 후 세포와 용해된 저융점 아가로스(agarose)를 42℃를 유지하면서 1:10의 비율로 혼합한 후, 즉시 코멧 슬라이드(comet slide)의 써클(circle)위에 75㎕를 채우고 4℃의 어두운 곳에서 겔을 형성시켰다.

겔이 형성된 슬라이드를 세포막 용해 용액(lysis solution)에 4℃에서 1시간 동안 담구어 세포막을 용해하였다. 그 후 상기 슬라이드들을 버퍼(300mM NaOH, 1mM EDTA, pH13)로 슬라이드 포면 위 0.7cm까지 가득 채운 후 20분 동안 수평상태에서 25V/300mA로 20분 동안 전기영동을 실시하였다. 전기영동을 실시한 후에 70% 에탄올에 5분 동안 담근 후 공기 중에서 자연건조하였다. 희석된 SYBR Green(1:10,000) 50㎕로 염색한 후 건조시켜 염색된 슬라이드를 250배의 형광현미경으로 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 정상 전립선 세포 핵의 사진의 경우에는 핵에 어떠한 손상이 보이지 않는데 반하여(도 1(a)), 음성 대조구로서 전립선 세포에 산화제 TBHB를 처리한 경우에는 핵이 손상되었음을 확인할 수 있었으며(도 1(b)), 양성 대조구로서 전립선 세포에 카제인을 처리한 후 산화제를 처리한 경우에는 핵의 손상이 방지됨을 볼 수 있었으나 그 효과는 아주 미약하였으며(도 1(c)), 본 발명의 유청 단백질의 가수분해물을 처리한 후 산화제를 처리한 경우에는 정상세포와 유사한 수준의 핵을 관찰할 수 있었는바(도 1(d)), 본 발명의 유청 단백질의 가수분해물은 산화제로부터 핵의 손상을 현저히 탁월하게 방지함을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 항산화 물질 GSH ( glutathione sulphydryl ) 함유율 상승활성

전립선 세포를 상피세포용 성장인자와 소 갑상선 추출물이 첨가된 배지에서 37℃, 5%의 탄산가스가 함유된 배양기에서 배양하였다.

세포를 96 웰 플레이트에 한 웰당 10⁶cells/㎖의 농도로 투입한 후 24시간 동안 배양하고 상기 실시예 1에서 준비한 유청 단백질 가수분해물(WPI) 500ug/㎖, 카제인 500ug/㎖, 글루타치온 합성 억제제인 BSO(Buthioneine sulfoximine) 500uM 를 각각 배지로 대치한 후 다시 24시간 동안 재배양하였다. 글루타치온의 농도는 글루타치온 어세이 키트(Cal Biochem, USA)를 이용하여 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 유청 단백질 가수분해물을 처리한 구는 대조구, 카제인 처리구, BSO 처리구에 비하여 세포배양 체계에서 현저히 높은 GSH의 농도를 나타남으로서 본원발명의 유청 단백질 가수분해물은 세포내 항산화 물질인 GSH 함유율을 상승시키는데 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 유청 단백질 가수분해물의 세포생존율에 미치는 영향

전립선 세포를 96 웰 플레이트의 한 웰 당 10⁶ cells/㎖의 농도로 씨딩한 후 24시간동안 배양하였다. 그 후 유청 단백질 가수분해물, 카제인, TBHP(t-butyl hydroperoxide)를 각각 100mM 처리, 유청 단백질 가수분해물(500uM) 및 BSO(500uM)을 처리하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 색소를 첨가한 후 4시간을 추가로 정치하여 세포의 생존율을 MTT 어세이를 통해 확인하였다. 배지를 제거하고 MTT 색소의 산화에 의해 생성된 포마잔(formazan) 결정을 0.04M 염산을 함유한 이소프로판올 100ul에 용해한 후 620nm에서 흡광도를 측정하여 생존세포수를 측정하 고 생존율을 계산하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 산화제 TBHP만을 처리한 경우에 세포의 38.1%가 사멸하여 세포생존율이 61.9%로 저하되었으며, 글루타치온 합성억제제인 BSO가 처리된 경우에는 그 생존율이 33.7%까지로 현저히 저하되었으며, 카제인 처리시엔 63.6%까지 저하되었으나 본 발명의 유청 단백질의 가수분해물을 처리한 경우에는 86.7%의 높은 세포 생존율을 보임을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 마우스에서의 항산화 활성 증강 작용

항산화 활성을 나타내는 성분 중 세포내에서 중요한 기능을 나타내는 분자로 GSH(glutathione sulphydryl)의 중요성은 널리 인정되고 있으며 GSH를 형성하는 전구물질 중에서 중요한 것은 아미노산인 시스테인이 있다. 함 유황 아미노산인 시스테인이 풍부하게 함유되어 이루어진 우유 단백질 중에는 유청 단백질이 있으며 유청 단백질을 순수하게 분말화한 물질로서 유청 단백질 분말(whey protein isolate)이 있다.

유청 단백질 분말이 세포내에서 GSH의 농도를 상승시키는 효과를 나타내는지, 지방산의 산화반응에서 산화억제활성을 나타내는지 확인하기 위하여 전립선 세포배양법에 의한 실험과 마우스를 이용한 생체실험 및 linoleic acid 산화과정에서 억제활성측정법을 이용하여 하기와 같은 실험을 하였다.

28±1g의 6주령의 수컷 ICR 마우스를 온도는 22-23℃, 습도는 40-50%, 12시간/day 명암주기의 사육조건하에서 protein free mouse 분말사료(80%)와 함께 실험 에 이용되는 분무건조된 유청단백질 , 카제인을 각각 20% 혼합된 사료를 3주 동안 급여한 후 실험동물의 간장 및 비장 세포내의 글루타치온 농도를 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 마우스에 카제인을 급여하는 경우보다 분무건조된 유청 단백질이 급여되었을 경우에 비장의 글루타치온 함유율이 현저히 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

유청단백질을 분말화 하는 방법에 의한 효과상의 차이 유무가 있는지를 알아보기 위하여 하기 실험예 5에서 실험하였다.

실험예 5. 유청단백질의 가공조건에 따른 활성변화

유청단백질의 순수유청단백질의 농도별로 85% 분무건조 유청단백질 분말(WPI), 90% 분무건조 유청단백질 분말(Pure WPI), 동결건조 유청단백질 분말(FZWPI), 가수분해처리된 유청단백질 분말(hydroly WPI)을 준비하였다.

28±1g의 6주령의 수컷 ICR 마우스를 온도는 22-23℃, 습도는 40-50%, 12시간/day 명암주기의 사육조건하에서 protein free mouse 분말사료(80%)와 함께 실험에 이용되는 상기에서 준비한 유청단백질 4종 , 카제인을 각각 20% 혼합된 사료를 3주 동안 급여한 후 실험동물의 간장 및 비장 세포내의 글루타치온 농도를 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 5a 및 도 5b에서 보는 바와 같이 카제인에 비하여 유청단백질의 경우 간(도 5a) 및 비장(도 5b) 세포내의 GSH의 농도가 높은수준으로 나타났으며, 분무건조 유청단백질과 동결건조 유청단백질의 경우에는 그 활성 차이에 유의성이 없어 유청단백질의 분말화하는 방법에 의한 활성차이는 없었으나, 유청단백질 중에서도 가수분해처리된 유청단백질 분말의 경우 가장 탁월한 GSH 농도를 나타남을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 면역글로부린 ( IgM ) 생성증가활성

상기 실험예 5에서 준비한 마우스에 protein free mouse 분말사료(80%)와 함께 분무건조된 유청단백질, 동결건조된 유청단백질 분말 및 카제인을 각각 20% 혼합된 사료를 3주 동안 급여하여 사육한 후, PBS로 2회 세척하여 농축한 5×10⁶면양 적혈구세포를 상기 마우스에 정맥주사하였다. 면양혈액으로부터 적혈구만을 분리하여 사용하였으며, IgM 플라크 형성 세포는 Cunningham(1968)의 방법에 준하여 실시하였다.

면역화 5일째, 마우스로부터 비장을 적출한 후 pastle로 50-메쉬 스테인레스 스틸 스크린을 이용하여 세포를 염류 평형용액(BSS)에 채집을 하였다. 10% 가열에 의해 불활성화시킨 송아지 혈청을 함께 첨가하여 비장세포를 세척한 후에 BSS와 함께 15㎖로 만들었다. 면양 적혈구는 PBS로 2회 세척하여 20%로 농축하였다. 보체 성분으로서 BSS에 1/10으로 희석한 Guinea pig serum을 사용하였으며, 사용할 때까지 모든 용액은 얼음물에 보관하였다.

0.05㎖ 비장세포용액과 0.15㎖의 면양 적혈구, 0.75㎖의 보체용액을 혼합하였다. 미리 준비된 슬라이드 챔버에 혼합액을 넣고 파라핀 왁스 또는 바세린으로 밀봉하였다. 37℃에서 47-60분 동안 배양한 다음 각각의 샘플에 플라크가 형성되면 이를 카운트하였다.

비장에 대한 총 플라크 형성 세포에 대한 측정은 각 샘플에 형성된 플라크 형성 세포에 PFC를 측정하기 위해 만든 혼합액과 실제 챔버에 들어간 양만큼의 비율을 곱하고 여기에 300을 곱하여 나타내었다(Cunningham and Szenberg, 1968).

상기 실험 수행의 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 동결건조된 유청단백질(FDWPI)이 분무건조된 유청단백질(SDWPI) 보다 통계적인 유의차가 인정되는 수준의 면역증강 반응을 보였으며 분무건조된 유청단백질(SDWPI)은 sodium caseinate 보다 통계적으로 유의성이 인정되는 수준의 면역증강 반응이 있음을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 7. 아스코르브산 첨가에 의한 유청단백질의 세포내 GSH 상승효과

유청단백질에 아스코르브산을 청가할 경우 세포내 GSH 상승에 효과를 미치는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

마우스의 사료로서 protein free mouse 분말사료(80%)와 함께 분무건조된 유청단백질(SDWPI), 동결건조된 유청단백질(FDWPI) , L-아스코르브산 50㎎/d(A-1) 및 L-아스코르브산 100㎎/d(A-2)을 각각 20% 혼합된 사료를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 4와 동일한 방법으로 수행하여 GSH 상승효과를 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 L-아스코르브산을 첨가하였을 경우에 분무건조된 유청단백질 또는 동결건조된 유청단백질을 첨가하였을 경우보다 비장의 GSH 함유률이 상승되었음을 확인할 수 있었으며, 특히 L-아스코르브산 100㎎/d을 첨가하였을 경우 가장 탁월하였음을 확인할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 유청단백질 가수분해물 99.8% 및 아스코르브산 0.2%를 함유하는 면역강화용 또는 항산화용 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 유청단백질 가수분해물은 세포내 항산화 물질은 글루타치온의 전구물질로 작용하여 세포내의 GSH 함유율을 증가시키는 활성을 가지고 있어 항산화 활성을 나타내며, 또한 면역 글루불린 IgM의 수치를 증가시켜 면역증강활성을 가지고 있다. 또한 본 발명의 아스코르브산을 함께 첨가할 경우 세포내 GSH 함유율이 더욱 탁월하게 증가되는 효과를 가지므로 본 발명은 세포의 면역강화 또는 항산화용 건강기능식품으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

유청단백질 가수분해물 99.8% 및 아스코르브산 0.2%를 함유하는 면역강화용 또는 항산화용 건강기능식품.
제 1항에 있어서, 상기 건강기능식품은 5-15g을 시중에서 시판되고 있는 음료수 60-80㎖에 혼합하여 음용하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.