KR101649201B1

KR101649201B1 - 오만둥이 유래 황산다당을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101649201B1
Application number: KR1020140007947A
Authority: KR
Inventors: 홍주헌; 이대훈; 박혜미
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2016-08-18
Also published as: KR20150087711A

Abstract

본 발명은 오만둥이(Styela plicata) 유래 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 피부 미백 및 주름 개선 효과가 우수한 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

오만둥이 유래 황산다당을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin whitening effect and improving wrinkle comprising sulfated polysaccharide from Styela plicata}

본 발명은 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 오만둥이(Styela plicata) 유래 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 피부 미백 및 주름 개선 효과가 우수한 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

과학과 의학의 발전으로 평균수명이 길어지고 생활수준의 향상으로 정신적, 육체적으로 건강과 아름다운 행복한 삶에 대한 관심이 급증하고 있다. 이로 인해 경기침체에도 사회 전반에 걸쳐 친환경, 순식물성을 내세운 제품들의 시장수요가 기하급수적으로 증가하고 있다. 피부는 자외선의 영향을 가장 받기 쉬운 기관이다. 자외선의 영향으로 피부에 활성산소가 생성되고 이에 따라 생성된 활성 산소종은 피부 세포를 손상시키며 손상받은 세포는 식세포에 의해 제거된다. 자외선을 받으면 피부에서 색소 침착이 증가되는데, 이는 자외선 흡수에 의한 피부 세포의 손상을 억제할 목적으로 멜라닌 생성이 증가된 결과이다. 자외선에 의한 피부의 노화가 진행되면 멜라닌 증식이 항시적으로 되고 그 결과 기미가 나타난다. 또한 피부노화는 그 요인에 따라 내인적 노화(intrinsic aging)와 외인적 노화(extrinsic aging)로 구분할 수 있다. 내인적 노화는 피부의 구조와 생리적 기능이 나이를 먹으면서 쇠퇴하는 것이며, 외인적 노화는 태양광선 등 누적된 외부 스트레스에 의해 노화 현상이 나타나는 것이다. 특히 각종 오염물질과 자외선 노출 등 외인적 노화에 의해 피부가 얇아지며, 주름이 증가되고 탄력이 감소될 뿐만 아니라, 기미, 주근깨 및 검버섯이 증가하게 된다.

해양생물은 육상생물에 비해 서식환경이 전혀 다름에 따라 생리적 대사과정과 성분이 육상생물과는 상이한 점이 많고, 그 구성성분 및 이들이 생산하는 대사산물에는 전혀 새로운 물질이 많을 것으로 기대되어 관심이 집중되고 있다. 대표적인 천연물 유래 소재 중 하나인 다당류(polysaccharide)가 비교적 널리 알려져 있는데, 다당류는 당의 복합체로써 복수의 단당(monosaccharide)이 결합한 것이다. 특히 해조류에는 카라기난(carrageenan)이나 후코이단(fucoidan)의 형태로 존재하여 갈락토스(galactose)나 푸코스(fucose)가 황산이온을 함유하는 구조로 되어 있으며, 척추동물은 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose) 등이 결합된 구조를 가지며 황산이온을 함유하는 구조로 되어있다. 다당류는 수천에서 수백만까지 분자량이 다양하고, 생물계에 널리 존재하며 일반적으로 생물체의 구성성분 및 에너지 저장체로 존재한다. 이들 다당류는 각각 고유의 기능을 갖고 있지만 대체로 미용이나 관절염, 혈류개선, 눈의 피로 완화, 면역력 강화, 자양강장에 대한 효과와 관계가 있다고 알려져 있으며, 천연물 소재를 기반으로 하는 건강 보조제품, 화장품 등에 대한 일반인들의 인식이 높아지고 있는데 그 이유는 무엇보다도 천연물 유래 소재는 인간이 오랫동안 인체에 직접적으로 섭취해왔기 때문이다.

다양한 해양생물 중 흰멍게 또는 주름미더덕이라고도 불리는 오만둥이(Styela plicata)는 척색동물문의 미생동물아문, 해초강, 측성해초목에 속하는 해양생물로서 자웅동체이고 패각이나 바위 등에 부착하여 생장하며, 이와 비슷한 생물로는 미더덕, 멍게 등이 잘 알려져 있다. 오만둥이는 미더덕과 비교하여 다소 둥그스름하며 꼬리가 없고, 껍질표면의 돌기가 굵고 다소 옅은 빛깔을 띄고 있으며 독특한 향과 맛을 가지고 있어 주로 찜이나 찌개 등의 재료로 식품에 널리 이용되고 있다. 오만둥이에는 헤파린(heparin)과 데르마탄황산염(dermatan sulfate)이 함유되어 항응고 효능을 보이며, 항균 펩타이드로서 플리카타미드(plicatamide)라는 옥타펩티드(octapeptide)가 존재하는 것이 보고되어 있고, 혈액 세포(hemocyte)는 사람의 K-562 종양 세포주에 대해 저해효과가 있다고 보고하였으나, 오만둥이 다당류의 미백, 항노화 및 면역활성에 관한 연구는 전무한 실정이다.

한국등록특허 제0525815호에는 와송 유래의 다당류 추출물을 포함하는 항균성 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2003-0072417호에는 버섯 균사체의 배양액 유래의 기능성 다당류 추출물을 이용한 기능성 식품의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 오만둥이 유래 황산다당을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 오만둥이를 이용하여 다당류를 추출하는 데 있어서, 기존의 추출법의 문제점인 인체 독성, 낮은 추출 수율, 고비용 등의 문제점을 해결하고, 다당류 중 미백 및 주름 개선 활성이 증진된 오만둥이(Styela plicata) 유래 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물을 함유하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물을 유효성분으로 함유한 화장료 조성물은 미백 또는 주름 개선 효과가 현저하게 우수하며, 천연물로부터 얻어진 생리활성물질을 함유하기 때문에 그 효과가 뛰어나고 부작용을 유발하지 않은 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본원 발명의 방법으로 황산다당을 분리함으로써, 활성성분의 함량을 극대화시키고 안정도가 향상되어 화장품으로 제조하여도 쉽게 변색 및 변취가 발생하지 않아 영양화장수, 크림, 에센스 등 다양한 화장품 개발에 이용될 수 있는 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 오만둥이 유래 황산다당을 함유하는 크림의 제조공정을 나타낸 것이다.
도 2는 오만둥이 다당류의 3개의 분획물(F1, F2, F3)의 흡수스펙트럼, 당, 단백질 및 우론산(uronic acid) 함량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 이온-크로마토그래피에 의해 분획된 분획물(F1, F2, F3)을 표준품과 함께 아가로스 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. (A): 오만둥이 다당류, (B): 오만둥이 황산 다당류
CSA: 콘드로이틴 4-황산, DS: 데르마탄 황산, CSC: 콘드로이틴 6-황산, HP: 헤파린, HE: 열수 추출에 의한 오만둥이 유래 다당류, AE: 가압 추출에 의한 오만둥이 유래 다당류, EE: 효소 추출에 의한 오만둥이 유래 다당류, F1, F2, F3: 오만둥이 유래 황산다당 분획물
도 4는 오만둥이 다당류 및 황산 다당류의 농도별 처리에 따른 마우스 대식 세포인 RAW 264.7 세포주의 세포 생존률을 비교한 그래프이다.
(A): 오만둥이 다당류, (B): 오만둥이 황산 다당류
도 5는 오만둥이 다당류 및 황산 다당류의 농도별 처리에 따른 NO 생성량을 비교한 그래프이다.
S: 효소 추출에 의한 오만둥이 유래 다당류, F1, F2, F3: 오만둥이 유래 황산다당 분획물
도 6은 오만둥이 다당류 및 황산 다당류의 농도별 처리에 따른 멜라노마 세포주인 B16F10에 대한 세포 생존률을 비교한 그래프이다.
(A): 오만둥이 다당류, (B): 오만둥이 황산 다당류
도 7은 오만둥이 다당류 및 황산 다당류의 농도별 처리에 따른 티로시나아제 활성을 비교한 그래프이다.
(A): 오만둥이 다당류, (B): 오만둥이 황산 다당류
도 8은 오만둥이 다당류 및 황산 다당류의 농도별 처리에 따른 인간 섬유아세포주인 HS68 세포주에 대한 세포 생존률을 비교한 그래프이다.
(A): 오만둥이 다당류, (B): 오만둥이 황산 다당류
도 9는 오만둥이 다당류 및 황산 다당류의 농도별 처리에 따른 UVB 처리를 이용한 MMP-1 발현율을 비교한 그래프이다.
(A): 오만둥이 다당류, (B): 오만둥이 황산 다당류

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 황산다당은 오만둥이(Styela plicata) 유래 황산다당일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 오만둥이(Styela plicata) 유래 황산다당은 보다 구체적으로는 오만둥이(Styela plicata)에 증류수 및 단백질 가수분해 효소를 첨가한 후 추출한 추출물을 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하여 제조된 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 오만둥이(Styela plicata)에 증류수와 단백질 가수분해 효소를 첨가한 혼합물을 50~70℃에서 12~18시간 동안 추출한 추출물을 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하여 제조된 것일 수 있으며, 가장 구체적으로는 오만둥이(Styela plicata)에 증류수와 단백질 가수분해 효소를 첨가한 혼합물을 60℃에서 15시간 동안 추출한 추출물을 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하여 제조된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물을 0.0001~30 중량% 함유할 수 있으며, 바람직하게는 0.001~25 중량% 함유할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01~20 중량% 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물은 미백 및 주름 개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는데, 상기 미백은 멜라닌 색소의 침착으로 야기되는 피부의 흑화를 방지하는 피부 트러블을 개선하는 작용을 의미하는데, 본 발명의 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물은 다른 다당류에 비해 세포 내 티로시나아제 활성을 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제하는 우수한 미백 효과를 나타낸다. 또한, 상기 주름 개선은 MMP-1 생성을 억제함으로써 콜라겐의 분해를 방지하여 피부 탄력이 저하되지 않도록 하여 주름이 생기지 않도록 하는 것을 특징으로 한다.

결과적으로, 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물은 다른 다당류에 비해 높은 미백 및 주름 개선 효과를 가지므로, 기존의 다당류를 이용한 화장료 조성물에 비해 현저하게 높은 피부 미백 및 주름개선 효과를 가질 뿐만 아니라, 안정성이 높고, 시간 경과에 따른 성분 변화가 거의 없으며 피부 자극 유발 등의 부작용이 없다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 화장료는 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이 크림, 아이 에센스, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 화장료는 본 발명의 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

1. 재료 및 제조방법

(1) 실험재료

본 실험에 사용된 오만둥이는 경상남도 마산시 소재 수산업협동조합 공판장에서 구입하여 이물질을 제거하고 물로 깨끗이 씻어 물기를 제거한 후 분쇄한 다음 동결건조 하여 -70℃의 냉동고에 보관하면서 시료로 사용하였다. 단백질 분해효소는 상업적으로 많이 사용되고 있는 뉴트라제(neutrase)를 부산소재 (주)바이오시스에서 구입하여 실험에 사용하였다.

(2) 황산 다당류 추출물의 제조

(a) 오만둥이 다당류 추출물의 제조

오만둥이(Styela plicata) 유래 다당류를 추출하기 위해 동결 건조시료 10 g에 200 mL 증류수를 첨가하고, 기질에 대하여 단백질 농도비가 1/50이 되도록 뉴트라제(neutrase)를 첨가하여 진탕배양기(BS-31, Jeio Tech., Daejeon, Korea)를 이용하여 160 rpm으로 60℃에서 15시간 동안 교반 추출하였다. 추출물은 원심분리(3,000×g, 30분)하였으며 회수한 상등액에 최종농도가 3%가 되도록 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)을 첨가하여 실온에서 30분간 방치한 후, 원심분리(3,000×g, 30분)하여 침전된 단백질을 제거한 다음 감압농축기(Model N-1N, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 60 brix가 될 때까지 농축하였다. 농축액은 5배량의 에탄올을 첨가하여 24시간 동안 교반하고 원심분리(3,000×g, 30분)하여 다당류를 회수하였고 동결건조(Freezone 2.5,, Labconco Co., USA)하여 -70℃ 이하에 보관하면서 황산다당 분리용 시료로 사용하였다.

(b) 황산 다당류의 분리

오만둥이에서 추출 및 침전을 통해 분리한 물질에서 황산다당을 분리하기 위하여 DEAE-Sepharose CL-6B 컬럼을 충진제로 이용하여 레진(resin)의 기포를 제거한 다음 2.5×30 cm인 컬럼에 충진시키고 50 mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.0)로 평형화한 후 0~1 M로 농도 구배를 주어 유속 1 mL/min로 10 mL씩 분취하여 당의 경우 페놀-황산(phenol-sulfuric acid) 방법으로, 단백질의 경우 Lowry 등의 방법으로, 우론산(uronic acid)의 경우 Cesaretti 등의 방법으로, 각각 490 nm, 540 nm, 550 nm에서 흡광도를 측정한 후 용출양상에 따라 분획을 수집하고 D.I.W로 투석하여 농축 후 동결건조하여 -70℃에 보관하며 사용하였다.

(c) 흡수스펙트럼

다당으로부터 분리된 모든 분획물을 UV 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Sweden)를 사용하여 254 nm 영역에서 스캐닝하여 최대흡수파장을 조사하였다.

(d) 아가로스 전기영동

크로마토그래피에서 정제된 황산다당은 0.6% 아가로스 겔(w/v)에서 확인되었다. 0.05 M 1,3-디아미노프로판/아세테이트 버퍼(pH 9.0)를 사용하여 60분간 전개 후 아세트산/에탄올/D.I.W.(0.1:5:5, v/v/v)에 용해된 0.1% 톨루이딘 블루로 착색하고, 0.1% 아세트산으로 탈색하여 확인하였다. 사용된 표준품은 콘드로이틴황산 A, 콘드로이틴황산 B, 콘드로이틴황산 C, 헤파린(Sigma Co., St Louis, Mo, USA)을 사용하였다.

2. 실험방법

(1) 세포 및 배양 방법

실험에 이용한 마우스 대식세포(RAW264.7), 멜라노마 세포주(B16F10)는 한국 세포주 은행(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 진피섬유아세포주(HS68)는 ATCC(american type culture collection)에서 분양받아 실험에 사용하였다. 세포배양은 마우스대식세포 및 진피섬유아세포주는 DMEM(dulbecco's modified eagle's medium) 배지(Welgene, Daegu, Korea)를, 멜라노마 세포주는 MEM(minimum essential medium eagles) 배지에 각각 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하여 배양하였다. 세포는 모두 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(MCO-18AIC, SANYO Co., Japan)에서 배양하여 본 실험에 이용하였다.

(2) 세포독성

배양된 세포주를 1.5×10⁴ cell/mL로 96 웰 플레이트에 각각 100 ㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하고 시료를 농도별로 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS 완충용액에 5000 ㎍/mL 녹인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma Co., St Louis, Mo, USA) 용액을 각 웰에 10 ㎕씩 첨가하고 다시 4시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 배양종료 후 생성된 포르마잔(formazan) 결정이 흐트러지지 않게 배양액을 완전히 제거하고 제거된 각 웰에 100 ㎕씩의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 가하여 10분간 반응시켜 포르마잔 결정을 용해한 후 ELISA reader(Asys UVM340, Biochrom, Eugendorf, Austria)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(3) 일산화질소( nitric oxide ) 함량

RAW 264.7 세포로부터 생성되는 NO(nitric oxide)의 양을 그리스(griess) 시약을 이용하여 아래와 같이 측정하였다. 배양된 세포주를 2×10⁴ cell/mL로 96 웰 플레이트에 각각 100 ㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하고 H₂0로 녹인 각각의 농도 및 LPS(1 ㎍/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 상등액 50 ㎕에 동량의 그리스(griess) 시약을 혼합하여 10분간 암반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며 NO의 함량은 아질산나트륨(sodium nitrite)의 농도별 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

(4) α- MSH 유도에 의한 티로시나아제 활성

배양된 세포주를 4.0×10⁴ cell/well로 24 웰 플레이트에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하고 α-MSH(20 nM)와 시료를 농도별로 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 두 번 세척한 다음 세포에 1% Triton X-100이 함유된 PBS를 첨가하여 용해하였다. 12,000×g, 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 시료 50 ㎕에 0.1 M 인산나트륨 버퍼와 0.05% L-DOPA를 첨가하여 37℃에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(5) MMP -1 저해활성 측정

배양된 세포주를 5.0×10⁴ cell/well로 24 웰 플레이트에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하고 시료를 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 두번 세척한 다음 세포에 1 mL PBS를 첨가하고 UV 램프를 이용하여 UVB(280~320 nm)를 조사한 후 다시 시료를 처리하고 48시간 추가 배양하였다. 배양 후 13,000×g, 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) Human ELISA kit(abcam, Japan)를 사용하여 측정하였다. UVB 조사는 UV-라디오미터를 이용하여 조사량을 측정하여 80 mJ/cm²의 양을 조사하였으며, 이때 UVB 조사량은 세포생존율에 영향을 주지 않으면서 MMPs(matrix metalloproteinase) 유도가 일어나도록 설정하였다.

3. 오만둥이 유래 황산다당 추출물을 함유하는 크림의 평가

(1) 오만둥이 유래 황산다당 추출물을 첨가한 크림 제조

크림 제조는 표 1의 배합비에 따라 제조하였으며, 제조과정은 도 1과 같다. 즉, 지용성 물질인 파트 A를 75℃에서 완전히 녹인 다음 수용성 물질인 파트 B를 서서히 넣어주면서 75℃에서 완전히 용해시켰다. 그리고 파트 A와 B 혼합액에 추출방법에 따른 오만둥이 유래 다당류 추출물이 함유되어 있는 파트 C를 서서히 넣어주면서 균질화 하였다.

오만둥이 유래 황산 다당류 추출물을 첨가한 크림 배합비

Part	성분	오만둥이 유래 다당류 추출물 함유 크림
A	로즈힙 오일	5 g
	호호바 오일	10 g
	올리브 버진	5 g
	디메치콘	1 g
	올리브유화왁스	4 g
	세틸알콜	1 g
B	증류수	50 g
	글리세린	2 g
	알란토인	0.5 g
C	오만둥이 유래 황산 다당류 추출물	15 g
	비타민 E	0.5 g
	라벤더트루 E.O	10 drops
	프랑킨센스 E.O	5 drops
	카보머프리젤	5 g

(2) 화장품 안정도 및 기간설정

오만둥이 유래 분리된 황산 다당류 추출물을 첨가한 미백크림을 화장품 보관 용기에 넣은 후, 0℃, 25℃, 35℃, 45℃에서 온도에 따른 안정도를 드라이 오븐, 자외선 측정기 및 빛을 쐬며 크림의 안정성을 측정하였다.

안정도 기간설정은 160일간 드라이 오븐 30℃, 37℃, 45℃에서 보관하면서 기간별 미생물 검사를 실시하였으며, 경상북도 경산 소재 D 대학 대학원생 20명이 성상, 색상, 향취에 대한 관능평가를 기간별로 확인하여 평가하였다.

4. 통계처리

실험결과는 SPSS(Statistical package for the social science for window rel. 19.0)로 통계처리 하였으며, 각 시료에 대한 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료에 대한 유의성 검정은 분산분석한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test에 따라 분석하였다.

실시예 1: 오만둥이 황산 다당류 추출물의 분리 및 정제물의 생리활성

1-1. 황산 다당류 추출물의 분리

최적 추출 조건에서 분리한 다당류를 DEAE-sepharose 컬럼에 로딩한 다음 이온교환 크로마토그래피한 결과는 도 2와 같다. 크로마토그램에서 오만둥이가 농도구배에 의해 3개의 분획(F1, F2, F3)을 확인할 수 있었고, 흡수스펙트럼, 당, 단백질 및 우론산(uronic acid) 함량이 높게 나타난 분획물은 투석한 후 동결건조하여 구성성분의 함량에 대해 분석한 결과는 표 2와 같다.

오만둥이 F1, F2, F3 분획물의 당 함량은 각각 38.01, 37.18, 28.06%로 흡착되지 않은 중성당 분획물인 F1에서 가장 많이 함유되어 있었다. 아미노당의 유도체로 작용하는 총 우론산 함량은 17.57, 18.13, 24.66 g/100 g으로 다른 분획물에 비해 F3에서 가장 많았으며, 황산다당의 또 다른 지표물질인 헥소사민 함량은 18.58, 26.79, 23.07 g/100 g으로 F2에서 가장 높게 나타났다. 이는 다당류 추출물의 우론산 10.86 g/100 g 함량에 비해 2배 정도 증가하는 경향을 보였으며, 헥소사민의 경우 다당류 추출물과 유사한 경향을 보였다.

오만둥이 황산 다당류 추출물의 당, 단백질 및 우론산 함량

샘플		당(%)	우론산(g/100 g)	헥소사민(g/100 g)
오만둥이	F1	38.01±2.10	17.57±5.56	18.58±3.58
	F2	37.18±3.38	18.13±3.32	26.79±0.60
	F3	28.06±0.23	24.64±4.04	23.07±1.39

1-2. 아가로스 전기영동에 의한 황산다당의 확인

다당 추출물 및 이온-크로마토그래피에 의해 분획된 시료를 표준품과 함께 아가로스 겔 전기영동한 결과는 도 3과 같다. 오만둥이 다당류 추출물의 이동도를 확인한 (A)에서는 표준물질인 콘드로이틴황산 및 헤파린 황산염(heparin sulfate)과 비교하였을 때, 오만둥이 다당류의 경우 콘드로이틴황산 및 헤파린 황산염(heparin sulfate)에 걸쳐서 밴드가 나타나 모두 함유되어 있는 것으로 사료되며, (B)에서는 표준품과의 비교를 통해 오만둥이 분획물 F1, F2의 경우 NaCl 농도가 낮은 곳에서 용출되는 헤파린 황산염(heperan sulfate)으로 추정되며, F3은 데르마탄 황산(dermatan sulfate)으로 추정된다. 밴드 농도가 낮게 나타난 이유는 이온 농도가 낮은 곳에서 분리되었으며, 황산다당의 농도가 낮고 여러 종류의 황산다당이 존재한다는 것을 알 수 있다.

실시예 2: 오만둥이 황산 다당류의 면역활성 분석

마우스 대식 세포인 RAW 264.7에 대한 세포독성 측정 결과를 도 4에 나타내었다. 오만둥이에서 추출한 다당류는 10, 25, 50, 100 및 250 ㎍/mL로 처리하였고, 정제된 황산다당의 농도는 5, 10, 25, 50 및 100 ㎍/mL로 처리하였다. 다당 추출물과 정제 황산다당은 모든 농도 구간에서 독성을 나타내지 않았으며, 농도가 증가 할수록 세포 증식률이 증가하였다. 다당 추출물은 250 ㎍/mL 농도에서 대조군에 비해 12.58%의 대식세포 증식률을 보여 주었으며, 황산다당 분획물은 100 ㎍/mL 농도에서 18.29~21.15%의 증식률을 보였다. 이와 같은 결과는 오만둥이 다당 추출물 및 황산다당이 대식세포의 증식률을 증가시켜 면역조절 효과가 있을 것으로 사료된다.

실시예 3: 오만둥이 황산 다당류의 일산화질소( nitric oxide ) 함량에 대한 영향 분석

NO는 인체 내에서 혈관이완작용, 신경정보전달작용, 세포성장조절작용, 항종양작용, 항바이러스작용 등의 효과를 가진다고 보고되어 있다. NO 생성량은 RAW 264.7 세포의 배양액 중에 NO 함량을 측정하는 것으로 결과는 도 5와 같다. 무처리 대조군(Con)에 비하여 오만둥이 다당 추출물 및 정제 황산다당에서 모든 시료들이 농도가 증가함에 따라 아질산염(nitrite) 생성량이 증가하였으며, 25 ㎍/mL 농도에서 다당 추출물은 9.05 μM, 정제 황산다당은 19.86~24.35 μM로 나타나 대조군에 비해 다당 추출물은 2배, 정제된 황산다당은 4배가 넘는 증가량을 보여 정제도가 증가함에 따라 NO 생성량이 증가함을 확인하였다. 이와 같은 결과는 오만둥이에서 대식세포를 활성화시킴을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 오만둥이 다당류의 피부 미백 활성

멜라노마 세포주인 B16F10에 대한 독성 측정 결과를 도 6에 나타내었다. 오만둥이에서 추출한 다당류는 5, 10, 25, 50, 및 100 ㎍/mL로 처리하였고, 정제된 황산다당의 농도는 1, 2.5, 5 및 10 ㎍/mL로 처리하였다. 다당 추출물과 정제 황산다당은 모든 농도 구간에서 독성을 나타내지 않았다. 이와 같은 결과를 통해 시료를 저농도로 처리하면 세포에 영향을 나타내지 않는 것으로 사료된다.

오만둥이에서 분리한 다당류 추출물의 다당의 α-MSH 유도에 의한 티로시나아제 활성 측정을 도 7에 나타내었다. 오만둥이 유래 다당류의 경우 α-MSH 유도 시 168.69%로 티로시나아제로 활성이 증가하였지만, 다당류 처리 시 100 ㎍/mL 농도에서 77.49%로 티로시나아제의 활성이 감소하였으며, 분리된 황산다당의 경우 F1 분획물 10 ㎍/mL 농도에서 72.05%의 활성이 감소하여 활성이 우수하게 나타났고 F2, F3 분획물에서도 농도 유의적으로 활성이 감소하였다. 티로시나아제는 티로신을 기질로 하여 DOPA로 전환시키는 DOPA 산화효소로서 멜라닌 합성의 처음 두 단계 반응을 촉매하는데, DOPA 염색을 이용하여 멜라닌 세포의 티로시나아제의 활성을 관찰할 수 있다. α-MSH 처리 시 대조군에 비하여 티로시나아제 활성이 현저히 증가하였으며, α-MSH와 시료군의 동시 처리 시 티로시나아제 활성이 감소하였음을 확인하였다. 또한, 오만둥이 다당류에 비해 황산다당이 적은 농도에서도 티로시나아제 활성이 더 감소함을 확인하였다.

실시예 5: 오만둥이 다당류의 항노화 활성

인간 섬유아세포주인 HS68 세포주에 대한 독성 측정 결과를 도 8에 나타내었다. 오만둥이에서 추출한 다당류는 5, 10, 25 및 50 ㎍/mL로 처리하였고, 정제된 황산다당의 농도는 1, 2.5, 5 및 10 ㎍/mL로 처리하였다. 다당 추출물과 정제 황산다당은 모든 농도 구간에서 독성을 나타내지 않았다. 이와 같은 결과를 통해 시료를 저농도로 처리하면 세포에 영향을 나타내지 않는 것으로 사료된다.

오만둥이에서 분리한 다당 추출물 및 정제된 황산다당의 UVB 처리를 이용한 MMP-1 발현율 측정을 도 9에 나타내었다. UV에 피부의 광손상에 있어 중요한 역할을 담당하고 있는 MMP-1 발현은 UV에 의해 세포에서 JNK/p38 활성도가 증가하고 전사인자인 AP-1의 활성도가 증가되는 신호전달 경로를 통해 발현이 증가되어 피부에서 교원질의 결핍을 초래한다고 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 HS68 세포주에 다당 추출물 및 정제된 황산다당의 전처리가 UVB 조사된 피부 세포에 미치는 세포 보호효과를 측정하였다. UVB 무처리군은 29%의 저조한 MMP-1 발현을 나타내었으며, UVB 처리에 의해 MMP-1 발현이 증가하였다. 그러나 오만둥이 다당 추출물은 10~50 ㎍/mL 농도 처리에 의해 유의적으로 발현율(60.39~80.11%)이 감소하였다. 정제된 황산다당의 경우 다당 추출물보다 저농도인 1~10 ㎍/mL 농도에서 양성 대조군보다 낮은 발현율을 나타내었다. 따라서, 오만둥이 유래 다당류에 비해 황산다당에서 더 많은 MMP-1 발현 저해활성을 나타내어 피부주름 개선에 영향을 줄 것으로 사료된다.

실시예 6: 오만둥이 유래 황산 다당류 추출물 함유 크림의 안정성

크림의 온도에 따른 화장품 안정도 관찰 결과를 표 3에 나타내었다. 온도에 따른 화장품 안정도 변화 관찰결과 0~45℃ 사이의 온도, 자외선, 폭광 등에 영향을 받지 않는 것으로 나타나 오만둥이 유래 황산다당 함유 조성물의 저장성이 안정함을 확인하였다.

오만둥이 유래 황산 다당류 추출물 함유 크림의 온도에 따른 안정도

기간(일)	온도조건
기간(일)	0℃	25℃	35℃	45℃	자외선	빛
1	o	o	o	o	o	o
3	o	o	o	o	o	o
5	o	o	o	o	o	o
7	o	o	o	o	o	o
15	o	o	o	o	o	o
30	o	o	o	o	o	o

o: 안정, x: 불안정

크림 제조를 통한 화장품 안정도 및 안정기간을 알기 위한 기록서를 표 4에 나타내었다. 온도, 자외선, 빛에 대한 안정도 관찰결과 모두 안정하게 유지되는 것으로 나타났으며, 160일 기간 동안 장기보존에 따른 성상, 색상, 향취, 미생물 관련 가속시험에서 모두 적합하게 나타남에 따라 오만둥이 유래 황산다당 함유 조성물의 화장품 소재로서 적합함을 확인하였다.

안정도 기간 설정(Day)

1

2

3

4

5

6

30

60

90

120

160

성상

항온(45℃)

적합

항온(37℃)

적합

항온(30℃)

적합

색상

항온(45℃)

적합

항온(37℃)

적합

항온(30℃)

적합

향취

항온(45℃)

적합

항온(37℃)

적합

항온(30℃)

적합

미생물

세균/곰팡이
(100cpu/g)

0cpu/g

이하, 상기의 실시예의 결과를 근거로 하여, 황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물을 함유함으로써, 피부 미백 및 주름 개선 효과가 우수한 여러 가지 제형의 화장료의 조성을 제시한다. 그러나 본 발명의 조성물이 하기의 예에만 한정되는 것은 아니다.

제형예 1: 유연화장수(스킨로션)

유연화장수 배합 성분

배합성분	중량%
정제수	To 100
황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물	0.1
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량

제형예 2: 영양화장수( 밀크로션 )

영양화장수 배합 성분

배합성분	중량%
정제수	To 100
황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량

제형예 3: 영양크림

영양크림 배합 성분

배합성분	중량%
정제수	To 100
황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물	0.1
밀납	10.0
폴리솔베이트 60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량

제형예 4: 마사지크림

마사지크림 배합 성분

배합성분	중량%
정제수	To 100
황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물	0.1
밀납	10.0
폴리솔베이트 60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량

제형예 5: 팩

팩 배합 성분

배합성분	중량%
정제수	To 100
황산다당 또는 이를 함유하는 오만둥이 추출물	0.1
폴리비닐알콜	13.0
소듐카르복시메틸셀룰로오스	0.2
글리세린	5.0
알란토인	0.1
에탄올	6.0
핑이지-12 노닐페닐에테르	0.3
폴리솔베이트 60	0.3
방부제, 색소, 향료	적량

Claims

오만둥이(Styela plicata)에 증류수 및 단백질 가수분해 효소를 첨가한 후, 50~70℃에서 12~18시간 동안 추출한 추출물을 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 0~1M 염 농도의 구배를 주어 1 mL/분으로 10 mL씩 분취하여 황산다당을 포함하는 14번째에서 20번째 분획에 해당하는 F1 분획을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 화장료는 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이 크림, 아이 에센스, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.