KR102167748B1

KR102167748B1 - 해방풍잎 열수추출물을 이용한 피부미백과 주름개선 효과를 향상시킬 수 있는 화장품 조성물 제조방법

Info

Publication number: KR102167748B1
Application number: KR1020180149509A
Authority: KR
Inventors: 최소영; 이문중; 류정아; 윤성란; 신용습; 임양숙
Original assignee: 경상북도(농업기술원)
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-10-19
Also published as: KR20200063604A

Abstract

본 발명은 해방풍잎 열수추출물을 이용한 피부미백과 주름개선 효과를 향상시킬 수 있는 화장품 조성물 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 통상의 해방풍잎을 이용하여 열수추출물을 얻은 후, 상기 열수추출물과 B16-F110 및 HS68 세포주를 이용하여 화장품 조성물을 제조하게 됨으로써, 피부미백효과 및 주름개선효과와, 세포보호효과를 가질 수 있는 유용한 발명이다.

Description

해방풍잎 열수추출물을 이용한 피부미백과 주름개선 효과를 향상시킬 수 있는 화장품 조성물 제조방법{Method for manufacturing cosmetic composition that can improve skin whitening and wrinkle improvement effect using liberated leaf hot water extract}

본 발명은 해방풍잎 열수추출물을 이용한 피부미백과 주름개선 효과를 향상시킬 수 있는 화장품 조성물 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해독, 항균작용 및 진정작용의 기능성이 있는 해방풍을 신소재를 이용한 해방풍잎 열수추출물을 이용한 피부미백과 주름개선 효과를 향상시킬 수 있는 화장품 조성물 제조방법에 관한 것이다.

해방풍은 동해안에서 가장 긴 112km의 해안선으로 울진군이 해방풍 재배에 최적지로 알려져 있고, 울진군 해방풍은 해안가 모래땅에서 자생하는 맛이 좋은 고기능성 채소로서 중풍 예방, 해독, 항균작용 및 진정작용 등 다양한 기능성과 가공특성의 우수함을 보유한 것으로 알러져 있다.

한편, 이러한 해방풍의 효과 등에 따라 해방풍을 이용 또는 함유하는 다양한 선행기술들이 있는데,

등록번호 제10-1900407호(특) “미세먼지에 의한 피부 염증을 완화하는 안티-폴루션 효과를 가지는 화장품 조성물”, 등록번호 제10-1413363호(특) “PGE2 활성을 조절하는 해방풍 추출물의 용도”, 등록번호 제10-1207214호(특) “해방풍 추출물로부터 제조된 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물”, 등록번호 제10-1164083호(특) “해방풍 추출물을 유효성분으로 함유하는 숙취해소용 조성물”등록번호 제10-1812258호(특) “해방풍을 이용한 약주 및 탁주 제조방법”, 등록번호 제10-1629706호(특) “황사와 미세먼지에 의해 유발된 염증을 완화시키는 천연식물 추출물을 포함하는 조성물” 등이 개시되어 있다.

상기한 바와 같이 해방풍을 이용한 다양한 분야에 사용되는 조성물들이 공지되어 있으나, 상기 화장품 조성물 중에 미백효과 및 주름개선효과를 갖는 조성물에 대한 기술은 전무하다.

이에 본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출해낸 것으로,

먼저, 해방풍잎 열수추출물의 이화학적 품질 특성 평가를 위해, 총 폴리페놀 함량 : Folin-Denis법으로 tannic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산, 총 플라보노이드 함량 : Davis법으로 rutin을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산, 총 당 함량 : 페놀-황산법을 이용하여 glucose를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산, 페놀성 화합물 함량 : High-performance liquid chromatography(HPLC)를 이용한 페놀성 화합물 함량은 HPLC system 2695와 C18 column과 photo diode detector(PDA)을 사용하여 유속 0.8 mL/min, 컬럼 온도 20℃, 주입량 20μL, 이동상은 0.1% acetic acid가 포함된 증류수(A)와 0.1% acetic acid가 포함된 acetonitrile(B)로 A: 92% B: 8% to A: 0% B: 100% gradient 및 detection wavelength 범위는 280 nm 조건으로 측정하고,

해방풍잎 열수추출물의 항산화활성을 평가를 위해, 전자공여능 : 각 시료의 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH)에 대한 전자공여 효과로서 시료의 환원력을 측정, Ferric reducing antoxidant power(FRAP) 활성: Colored ferrous TPTZ 복합체에 의해 ferric ion이 ferrous로 전환되어지는 과정을 측정하여 항산화력 측정, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfornic acid)(ABTS) radical 소거활성 : ABTS radical이 항산화 물질과 만나 radical이 소거되는 과정으로 시료의 항산화력을 확인, Superoxide radical 소거활성 : Nishikimi M 등의 방법에 따라 비효소적으로 PMS/NADH로 유발된 superoxide radical의 formazan 측정을 위해 560 nm에서 흡광도를 측정, Tyrosinase 저해활성 : Tyrosine이 tyrosinase 효소에 의해 DOPA로 hydroxylation 되는 과정을 시료가 저해하는 능력을 측정, Elastase 저해활성:Porcine pancreas elastase 저해활성 측정은 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitoanilide를 사용하여 37℃에서 20분간 p-nitoanilide의 생성량을 405 nm에서 측정하며,

B16-F10 세포주를 이용한 해방풍잎 열수추출물의 피부미백효과 평가를 위해, in vitro상 미백활성 측정을 위해 마우스 melanoma 세포인 B16-F10 cell을 이용하여 melanin 생성 저해효과 측정하되, 배양된 세포주를 4.0×

cell/well로 24 well plate에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5%

incubator에서 24시간 배양하고 α-MSH (100 nM)와 시료를 농도별로 처리한 후 3일 동안 배양 후 배지를 제거하고 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 두 번 세척한 다음 세포에 1% Triton X-100이 함유된 PBS를 첨가하여 용해함. 12,000 ×g, 10 분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 시료 50 μL에 0.1 M sodium phosphate buffer와 0.05% L-DOPA를 첨가하여 37℃에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하고,

HS68 세포주를 이용한 해방풍잎 열수추출물의 피부주름개선 효과 평가를 위해, 세포주를 5.0×

cell/well로 24 well plate에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5%

incubator에서 24시간 배양하고 시료를 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양함. 배양 후 배지를 제거하고 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 두 번 세척한 다음 세포에 1 mL PBS를 첨가하고 UV 램프를 이용하여 UVB (280∼320 nm)를 조사한 후 다시 시료를 처리하고 48시간 추가 배양 후 MTT assay를 통해 control- 대비 세포 생존율로 주름개선 효과를 측정하도록 하여, 해방풍을 함유하는 조성물을 위해 상기 해방풍과 B16-F10 세포주 및 HS68 세포주를 이용하여 해방풍잎 열수추출물을 이용한 피부미백과 주름개선 효과를 향상시킬 수 있는 화장품 조성물 제조방법을 제공함에 주안점을 두고 그 기술적 과제로 완성해낸 것이다.

이에 본 발명은, 해방풍 열수추출물과, 배양된 B16-F10 세포주를 4.0×

cell/well로 24 well plate에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5%

incubator에서 24시간 배양하고 α-MSH (100 nM)와 시료를 농도별로 처리한 후 3일 동안 배양 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)로 두 번 세척한 다음 세포에 1% Triton X-100이 함유된 PBS를 첨가하여 용해한 다음, 12,000 ×g, 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 시료 50 μL에 0.1 M sodium phosphate buffer와 0.05% L-DOPA를 첨가하여 37℃에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하며, 배양된 HS68 세포주를 5.0×

cell/well로 24 well plate에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5%

incubator에서 24시간 배양하고 시료를 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)로 두 번 세척한 다음 세포에 1 mL PBS를 첨가하고 UV 램프를 이용하여 UVB (280∼320 nm)를 조사한 후 다시 시료를 처리하고 48시간 추가 배양 후 MTT assay를 통해 control- 대비 세포 생존율로 주름개선 효과를 측정하도록 하여 제조하는 해방풍을 이용한 피부미백과 주름개선 효과를 향상시킬 수 있는 화장품 조성물 제조방법에 있어서, 상기 해방풍 열수추출물은 해방풍잎을 70℃에서 건조시킨 후, 후드믹스를 이용하여 3분간 분쇄하고, 상기 분쇄된 해방풍잎 분말을 100mesh 체에 거른 후, 걸러진 해방풍잎 분말과 물이 구비된 용기에 투입시킨 다음, 100℃에서 3시간간 추출하여 상등액을 제조하되, 해방풍잎 1g에 물 30m가 혼합을 상등액을 제조하는 것을 기술적 특징으로 한다.

삭제

본 발명의 해방풍잎 열수추출물을 이용한 피부미백과 주름개선 효과를 향상시킬 수 있는 화장품 조성물 제조방법에 의하면, B16-F10 세포주내 Tyrosinase 저해활성 및 세포내 Melanin 생성 억제율을 통한 피부미백효과가 있고, 자외선으로부터 HS68 세포의 세포보호효과를 통해 주름개선효과를 가질 수 있는 유용한 발명인 것이다.

실시예 1. 피부미백과 주름개선 효과를 가지는 화장품 조성물 제조방법

해방풍잎을 70℃에서 건조시킨 후, 후드믹스를 이용하여 3분간 분쇄하고, 상기 분쇄된 해방풍잎 분말을 100mesh 체에 거른 후, 걸러진 해방풍잎 분말과 물과 구비된 용기에 투입시킨 후 100℃에서 3시간간 추출하여 상등액을 제조하되, 해방풍 1g에 물 30m가 혼합을 상등액을 제조하고, 배양된 B16-F10 세포주를 4.0×

cell/well로 24 well plate에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5%

incubator에서 24시간 배양하고 α-MSH (100 nM)와 시료를 농도별로 처리한 후 3일 동안 배양 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)로 두 번 세척한 다음 세포에 1% Triton X-100이 함유된 PBS를 첨가하여 용해한 다음, 12,000 ×g, 10 분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 시료 50 μL에 0.1 M sodium phosphate buffer와 0.05% L-DOPA를 첨가하여 37℃에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하며, 배양된 HS68 세포주를 5.0×104 cell/well로 24 well plate에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5%

incubator에서 24시간 배양하고 시료를 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)로 두 번 세척한 다음 세포에 1 mL PBS를 첨가하고 UV 램프를 이용하여 UVB (280∼320 nm)를 조사한 후 다시 시료를 처리하고 48시간 추가 배양 후 MTT assay를 통해 control- 대비 세포 생존율로 주름개선 효과를 측정한다.

실험1) 해방풍잎 열수추출물의 이화학적 품질특성.

총 폴리페놀 함량 : Folin-Denis법으로 tannic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산.

총 플라보노이드 함량 : Davis법으로 rutin을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산.

총 당 함량 : 페놀-황산법을 이용하여 glucose를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산.

페놀성 화합물 함량 : High-performance liquid chromatography(HPLC)를 이용한 페놀성 화합물 함량은 HPLC system 2695와 C18 column과 photo diode detector(PDA)을 사용하여 유속 0.8 mL/min, 컬럼 온도 20℃, 주입량 20?瑜?L, 이동상은 0.1% acetic acid가 포함된 증류수(A)와 0.1% acetic acid가 포함된 acetonitrile(B)로 A: 92% B: 8% to A: 0% B: 100% gradient 및 detection wavelength 범위는 280 nm 조건으로 측정함.

실험2) 해방풍잎 열수추출물의 항산화활성.

전자공여능 : 각 시료의 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH)에 대한 전자공여 효과로서 시료의 환원력을 측정.

Ferric reducing antoxidant power(FRAP) 활성: Colored ferrous TPTZ 복합체에 의해 ferric ion이 ferrous로 전환되어지는 과정을 측정하여 항산화력 측정.

2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfornic acid)(ABTS) radical 소거활성 : ABTS radical이 항산화 물질과 만나 radical이 소거되는 과정으로 시료의 항산화력을 확인.

Superoxide radical 소거활성 : Nishikimi M 등의 방법에 따라 비효소적으로 PMS/NADH로 유발된 superoxide radical의 formazan 측정을 위해 560 nm에서 흡광도를 측정.

Tyrosinase 저해활성 : Tyrosine이 tyrosinase 효소에 의해 DOPA로 hydroxylation 되는 과정을 시료가 저해하는 능력을 측정.

Elastase 저해활성 : Porcine pancreas elastase 저해활성 측정은 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitoanilide를 사용하여 37℃에서 20분간 p-nitoanilide의 생성량을 405 nm에서 측정함.

실험3) B16-F10 세포주를 이용한 해방풍잎 열수추출물의 피부미백효과.

in vitro상 미백활성 측정을 위해 마우스 melanoma 세포인 B16-F10 cell을 이용하여 melanin 생성 저해효과 측정.

배양된 세포주를 4.0×

cell/well로 24 well plate에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5%

incubator에서 24시간 배양하고 α-MSH (100 nM)와 시료를 농도별로 처리한 후 3일 동안 배양함. 배양 후 배지를 제거하고 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 두 번 세척한 다음 세포에 1% Triton X-100이 함유된 PBS를 첨가하여 용해함. 12,000 ×g, 10 분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 시료 50 μL에 0.1 M sodium phosphate buffer와 0.05% L-DOPA를 첨가하여 37℃에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정함.

실험예4) HS68 세포주를 이용한 해방풍잎 열수추출물의 피부주름개선 효과.

배양된 세포주를 5.0×

cell/well로 24 well plate에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5%

incubator에서 24시간 배양하고 시료를 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양함. 배양 후 배지를 제거하고 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 두 번 세척한 다음 세포에 1 mL PBS를 첨가하고 UV 램프를 이용하여 UVB (280∼320 nm)를 조사한 후 다시 시료를 처리하고 48시간 추가 배양함. 배양 후 MTT assay를 통해 control- 대비 세포 생존율로 주름개선 효과를 측정함.

실험결과.

가. 해방풍잎 열수추출물의 이화학적 품질특성 평가

1)총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 총 당 함량

- 해방풍잎 열수추출물의 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 총 당 함량은 각각 2.77 g/100 g, 1.28 g/100 g 및 49.61 g/100 g으로 나타났음.

1) 해방풍잎 열수추출물의 페놀성 화합물 확인

-페놀성 화합물의 standard는 chlorogenic aicd, caffeic acid 및 rutin을 사용하였음. Chlorogenic acid는 피부 미백 및 피부 노화 방지 등이 있으며, caffeic acid는 피부 부기 완화, 피부 주름 예방, 피부트러블 진정효과, 가려움증 완화 및 항산화 효능 등의 기능성이 있음. 또한 rutin은 콜라겐 파괴 억제 및 항염 효능 등의 기능성이 있어 화장품소재로서 중요한 생리활성물질질HPLC 분석은 시료 1 mg을 증류수에 용해한 다음 0.45 μm membrane filter(Waters Co.)로 여과하여 분석용 시료로 사용하였음. Alliance HPLC system(2965; Waters Co.) 및 photodiode array detector(2996; Waters Co.)을 사용하였으며, 분석용 컬럼은 Acclaim PolarAdvangageⅡ C18(particle size 5 μm, 4.6×250 mm, Thermo Scientific Co., Boston, Massachusetts, USA)을 사용하였음. 유속은 0.5 mL/min, 주입량은 10 μL로 하였으며, 컬럼 및 시료 온도는 각각 30℃ 및 25℃로 하였음. 분석 파장은 322∼393 nm로 설정하였으며, 분석용 용매는 1% formic acid in water(A) 및 acetonitrile(B)를 사용하여 (A)를 기준으로 100%(0분), 87%(10분), 58.5%(20분), 30%(25분) 및 90%(35분)과 같이 gradient로 분석하였음. 페놀화합물 함량은 표준물질을 이용하여 작성한 표준곡선으로 정량하였고, 표준물질은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였음.

-해방풍잎 열수추출물의 chlorogenic acid는 3.46 mg/100 g, caffeic acid는 1.37 mg/100 g으로 나타났으며, rutin은 11.23 mg/100 g으로 rutin의 함량이 가장 높게 나타났음. 해방풍에는 피부 및 생리활성 기능성을 나타내는 페놀성 화합물 3종이 모두 검출되어 화장품소재로서의 가능성을 확인하였음.

나. 해방풍잎 열수추출물의 항산화활성

1) 전자공여능

- 양성대조군인 ascorbic acid 250 μg/mL 농도에서 전자공여능이 94.96%로 나타났으며, 해방풍 추출물은 1.0∼10.0%의 농도로 실험하였음. 해방풍잎 열수추출물은 23.57∼82.86%로 시료 농도가 증가함에 따라 전자공여능 또한 증가하는 것을 확인하였음.

2) ABTS radical 소거활성

- 양성대조군인 ascorbic acid 250 μg/mL 농도에서 ABTS radical 소거활성이 75.48%로 나타났으며, 해방풍잎 열수추출물은 1.0∼10.0%의 농도로 실험하였음. 해방풍 추출물은 14.47∼58.34%로 시료 농도가 증가함에 따라 ABTS radical 소거활성 또한 증가하는 것을 확인하였음.

3) Superoxide radical 소거활성

- 양성대조군인 ascorbic acid 250 μg/mL 농도에서 superoxide radical 소거활성이 52.21%로 나타났으며, 해방풍잎 열수추출물은 1.0∼10.0%의 농도로 실험하였음. 해방풍 추출물은 12.95∼56.12%로 시료 농도가 증가함에 따라 superoxide radical 소거활성 또한 증가하는 것을 확인하였음

4) FRAP 활성

-양성대조군인 ascorbic acid 250 μg/mL 농도에서 FRAP 활성은 1.32 mM로 나타났으며, 해방풍잎 열수추출물은 1.0∼10.0%의 농도로 실험하였음. 해방풍잎 열수추출물은 0.39∼1.33 mM로 시료 농도가 증가함에 따라 FRAP 활성 또한 증가하는 것을 확인하였음.

5) Tyrosinase 저해활성

-Tyrosinase는 피부의 표피 기정층에 존재하는 멜라노 사이트에서 tyrosine을 산화시켜 멜라닌의 생성을 촉진시키는 효소로서 이들의 활성 억제는 피부 미백과 노화 방지에 매우 중요하며, 본 실험은 비세포 tyrosinase 저해활성을 측정하였음. 양성대조군인 ascorbic acid는 250 μg/mL 농도에서 84.83%의 tyrosinase 저해활성을 나타내었으며, 해방풍잎 열수추출물은 1.0∼10.0% 농도에서 24.79∼57.69%로 나타났음.

6) Elastase 저해활성

-피부탄력 단백질인 elastin은 elastase에 의해 분해되어 피부의 그물망 구조 결합이 끊어짐으로 elastase가 주름생성의 주원인 효소로 알려져 있으며, 본 실험은 비세포 elastase 저해활성을 측정하였음. 양성대조군인 ursolic acid는 250 μg/mL 농도에서 63.35%의 elastase 저해활성을 나타내었으며, 해방풍잎 열수추출물은 1.0∼10.0% 농도에서 10.65∼45.28%로 나타났음. 앞선 항산화활성 측정 실험에서 우수한 항산화 활성을 나타내었으며, elastase 저해활성과 유사한 경향을 나타내어 항산화 활성은 피부 주름 및 노화와 관련 있음을 확인하였음

다. 해방풍잎 열수추출물의 in vitro 기능성 평가

1) B16-F10 세포주를 이용한 피부미백 효과

- 과도한 멜라닌 생성은 색소가 침착되어 기미, 주근깨 및 피부반점을 형성하고 피부노화 및 피부암 등을 유발함. 색소침착은 자외선에 의해 피부세포에서 α-MSH가 멜라닌 생성을 유도하는 원리를 이용하여 B16-F10 세포 내 tyrosinase 저해활성과 melanin 생성 억제율을 측정하였음. B16-F10 세포 내 tyrosinase 저해활성은 세포내에 존재하는 tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA를 비색법에 의해 측정하였으며, 배양된 세포주를 회수하여 상층액으로 활성을 측정하였음. B16-F10 세포 내 melanin 생성 억제율은 배양된 세포주를 회수하여 상층액을 제거하고 침전물로 활성을 측정하였음.

- B16-F10 세포주를 이용한 실험에 앞서 해방풍 추출물을 1.0∼10.0% 농도로 처리하였을 때 세포 생존율에 영향을 미치지 않는지 MTT 측정을 통해 확인한 결과, 해방풍잎 열수추출물의 모든 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내어 세포독성이 없음을 확인하였음.

- 증류수를 처리한 control-의 tyrosinase 생성률 100% 대비 계산하였으며, 멜라닌 생합성 유도물질인 α-MSH를 100 nM 처리한 control+의 tyrosinase 생성률이 140.46%로 melanogensis가 성공적으로 유도되었음. 양성대조군으로 100 μg/mL 농도의 ascorbic acid를 사용하였으며, tyrosinase 생성률이 73.32%로 나타났음. 해방풍잎 열수추출물의 농도가 증가함에 따라 세포 내 tyrosinase 생성률이 감소하였으며, 10.0% 농도에서 세포 내 tyrosinase 생성률이 75.38%로 가장 낮은 값을 나타내어 tyrosinase 저해활성을 확인하였음.

- 해방풍잎 열수추출물의 B16-F10 세포 내 melanin 생성 억제율은 증류수를 처리한 control-의 melanin 생성률 100% 대비 계산하였으며, 멜라닌 생합성 유도물질인 α-MSH를 100 nM 처리한 control+의 melanin 생성률은 131.51%로 나타났음. 양성대조군으로 100 μg/mL 농도의 ascorbic acid를 사용하였으며 melanin 생성률은 63.67%로 나타났음. 해방풍잎 열수추출물의 농도가 증가함에 따라 B16-F10 세포에 대한 멜라닌 생성률이 감소하였으며, 특히 10.0% 농도에서 멜라닌 생성률이 62.86%로 나타나 세포 내 melanin 생성이 억제되는 것을 확인하였음.

2) HS68 세포주를 이용한 주름개선 효과

-지속적인 자외선 노출은 인체 피부에서 세포외기질 구성성분을 분해시키는 기질 분해효소인 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현을 활성화시키고, 콜라겐 합성은 감소시킴으로써 피부의 탄력과 구조적 치밀도를 약화시켜 궁극적인 피부주름을 생성하는 원리를 이용하였음. HS68 세포의 주름개선 효과는 배양된 HS68 세포에 80 mJ/cm2의 자외선을 조사하고 동시에 시료를 각 농도별로 처리한 후 48시간 배양하고 이에 TBTB 시약을 처리하여 control- 대비 세포 생존율로 주름개선 효과를 측정하였음.

-HS68 세포주를 이용한 실험에 앞서 해방풍잎 열수추출물을 1.0∼10.0% 농도로 처리하였을 때 세포 생존율에 영향을 미치지 않는지 MTT 측정을 통해 확인한 결과, 각 추출물의 모든 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내어 세포독성이 없음을 확인하였음.

-해방풍잎 열수추출물의 HS68 세포의 주름개선 효과는 증류수를 처리한 control-의 세포 생존율 100% 대비 세포 생존율을 계산하였으며, 증류수에 80 mJ/cm2의 자외선을 조사한 control+의 세포 생존율은 44.51%로 나타났음. 양성대조군으로 100 μg/mL 농도의 ascorbic acid을 사용하였으며 생존율은 76.14%로 나타났음. 해방풍잎 열수추출물의 농도가 증가함에 따라 HS68 세포 생존율이 유의적으로 증가하였으며 특히 10.0% 농도에서 87.08%로 나타나 앞서 tyrosinase 저해활성 및 melanin 생성 억제율과 유사한 경향을 보여 미백 효과와 더불어 주름개선 효과가 있는 것으로 판단됨.

Claims

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해방풍 열수추출물과, 배양된 B16-F10 세포주를 4.0×
cell/well로 24 well plate에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5%
incubator에서 24시간 배양하고 α-MSH (100 nM)와 시료를 농도별로 처리한 후 3일 동안 배양 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)로 두 번 세척한 다음 세포에 1% Triton X-100이 함유된 PBS를 첨가하여 용해한 다음, 12,000 ×g, 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 시료 50 μL에 0.1 M sodium phosphate buffer와 0.05% L-DOPA를 첨가하여 37℃에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하며, 배양된 HS68 세포주를 5.0×
cell/well로 24 well plate에 각각 1 mL씩 첨가하여 37℃, 5%
incubator에서 24시간 배양하고 시료를 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)로 두 번 세척한 다음 세포에 1 mL PBS를 첨가하고 UV 램프를 이용하여 UVB (280∼320 nm)를 조사한 후 다시 시료를 처리하고 48시간 추가 배양 후 MTT assay를 통해 control- 대비 세포 생존율로 주름개선 효과를 측정하도록 하여 제조하는 해방풍을 이용한 피부미백과 주름개선 효과를 향상시킬 수 있는 화장품 조성물 제조방법에 있어서,
상기 해방풍 열수추출물은 해방풍잎을 70℃에서 건조시킨 후, 후드믹스를 이용하여 3분간 분쇄하고, 상기 분쇄된 해방풍잎 분말을 100mesh 체에 거른 후, 걸러진 해방풍잎 분말과 물이 구비된 용기에 투입시킨 다음, 100℃에서 3시간간 추출하여 상등액을 제조하되, 해방풍잎 1g에 물 30m가 혼합을 상등액을 제조하는 것을 특징으로 하는 해방풍잎 열수추출물을 이용한 피부미백과 주름개선 효과를 향상시킬 수 있는 화장품 조성물 제조방법.