KR20100020606A

KR20100020606A - 피부 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20100020606A
Application number: KR1020080079279A
Authority: KR
Inventors: 최상윤; 이평재; 이영철; 노정해; 김영찬; 조장원; 이영경
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2008-08-13
Filing date: 2008-08-13
Publication date: 2010-02-23
Also published as: KR101049166B1

Abstract

본 발명은 포도가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 포도가지 추출물 성분은 티로시나제 활성을 억제하고 멜라닌 생성을 저해하며, 자외선을 차단하여 미백효과가 우수하다. 미백효과가 우수할뿐더러, 세포 독성이 적어 부작용이 적은 피부 미백용 화장품을 제조할 수 있다. 자외선중 특히 UV-B이 차단효과가 강하며 자외선 차단용 화장품으로도 이용가능하다. 또한, 활용도가 적어 버려지는 포도가지를 활용하여 경제적 잇점이 크다.

포도가지, 추출물, 티로시나제, 멜라닌, 미백, 자외선 차단

Description

피부 미백용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for a skin whitening}

본 발명은 티로시나제 활성 및 멜라닌 형성을 저해하며, 자외선 차단효과가 있을 뿐 아니라 세포독성이 적어 부작용이 없는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한, 버려지는 천연 자원인 포도 가지를 활용한 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

멜라닌은 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 가지는 페놀류의 고분자 물질이다. 멜라닌이 과잉 생산되는 경우 피부에 기미, 주근깨 등이 형성되고 피부암도 유발될 수 있다.

멜라닌은 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌 세포에서 티로신(tyrosine)의 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 생성된다. 멜라닌은 티로신이 3,4-디하이드록시-페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)으로 hydroxylation되는 과정을 시작으로 도파퀴논(dopaquinone), 도파크롬(dopachrome)의 과정을 거쳐 멜라닌으로 합성되는데 도파크롬은 자연히 decarboxylation되어 DHI(dihydroxyindole)가 되며, 빠르게 산화되어 indole-5,6-quinone이 된다. 이러한 멜라닌 생합성에 관여하는 가장 주요한 효소로는 티로시나아제(tyrosinase)가 알려져 있다.

지금까지 멜라닌 생성 저해제의 연구는 주로 티로시나제 저해제를 개발하는 방향으로 집중되어 왔고, 이미 미백효과제로 파라-메톡시페놀, 하이드로퀴논, 코지산, 알부틴등이 사용되고 있으나, 이들은 활성이 약하거나 세포의 변성 또는 치사를 일으켜 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 유발하는 단점이 있다.

따라서, 부작용을 줄이기 위해 천연 추출물을 이용한 기능성 미백화장품에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 그 효능이나 독성에 대한 검증이 충분하지 못하다.

상기의 문제점을 해결하고자, 본 발명의 목적은 피부 미백 효능이 우수하면서도 천연 추출물을 이용하여 피부에 대한 독성이 작고, 버려지는 자원을 활용하여 비용도 저렴하고 경제적 부가가치가 큰 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하고자, 본 발명은 포도가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포도가지 추출물은 총 조성물 100중량부에 대하여 0.001 내지 10중량부로 함유될 수 있다. 바람직하게는 0.05 내지 5중량부로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포도가지 추출물의 재료로는 캠벨 또는 네오 마스캇품종이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면 상기 포도가지 추출물은 프로시아니딘 B2를 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포도가지 추출물은 증류슈, 탄소수 1 내지 20의 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출될 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

포도가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선 차단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 티로시나제 활성을 억제하고 멜라닌 생성을 저해하며, 자외선중 일광화상 및 지연형 색소침착을 일으키는 UV-B를 흡수하는 효과가 있어 피부 미백 효능이 우수하다. 또한, 피부 미백 효과가 우수하면서도 세포 독성이 작아 세포의 사멸로 생길 수 있는 부작용이 감소된다. 따라서 부작용이 적은 화장품을 제조할 수 있으며 부작용이 감소되므로 상대적으로 많은 양을 화장품이나 약제에 함유할 수 있어 미백효능을 더 향상시킬 수 있다. 자외선 차단 효과가 있으므로 자외선 차단용 화장품에 사용될 수도 있다.

게다가, 포도 부산물로 포도씨등에 비해 생성되는 양이 많고 활용도가 많지 않은 포도가지를 활용함으로써, 버려지는 자원을 활용하여 경제적 부가가치를 창출할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 포도가지 추출물을 유효성분으로 함유한다.

상기 포도가지 추출물은 티로시나제 활성을 억제하고 멜라닌 합성을 저해하며, 자외선 차단효과가 있어 미백효과가 우수하면서도, 세포독성이 적어 화장품에 사용시 부작용이 작다. 또한 활용도가 크지 않아 버려지는 포도가지를 활용하므로 제조 비용이 저렴하고, 자원절약, 쓰레기양의 감소등으로 경제적 파급효과가 클 것으로 기대된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포도가지 추출물은 총 조성물 100중량 부에 대하여 0.001 내지 10중량부로 포함될 수 있다. 바람직하게는 0.05 내지 5중량부로 포함될 수 있다. 상기 범위 미만으로 포도가지 추출물이 함유되면 피부미백 효과가 미미하며,상기 범위를 초과하여 첨가되면 화장료의 색이나 향을 해칠 수 있고, 부작용의 우려가 있다.

상기 포도가지 추출물은 초음파 추출, 유기용매 추출, 열수 추출, 환류 추출 및 교반등 당업계에 공지된 추출법을 사용하여 얻을 수 있다. 상기 추출과정중에 증류수, 탄소수 1 내지 20의 유기용매 또는 이들의 혼합용매가 사용될 수 있다. 상기 유기용매는 당업계에 공지된 것이면 제한없이 사용가능하나, 구체적으로 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 에테르, 메틸렌 클로라이드, 에틸렌 클로라이드, 헥산 및 디에틸 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 화장품에 적용되기 위해서는 인체에 대한 독성이 없어야 하므로 바람직하게는 증류수, 에탄올 또는 이들의 혼합용매가 사용될 수 있다.

본 발명의 포도가지 추출물은 초음파 추출방법으로 얻었다. 용매로 물로 희석된 80%의 에탄올을 사용하여 상온에서 1시간씩 3회 반복하여 초음파 추출하여 추출액을 얻고, 얻어진 추출액은 여과지로 여과하고 회전 감압 농축기를 이용하여 완전 농축시켜, -20℃에 보관하였다.

상기 포도가지 추출물은 티로시나제의 활성을 억제하고 멜라닌 생성을 저해 하므로 피부 미백에 효과적이다. 또한, 멜라닌 생성 세포인 멜라노사이트(melanocyte)를 사멸시키지 않으므로 세포 독성이 적다. 세포 독성이 적으므로 미백제로 사용시 부작용이 적을 것으로 판단된다.

상기와 같이 초음파 추출하여 얻은 포도 품종별(Campbell early, Neo Muscat, Muscat Bailey A), 포도가지, 포도씨, 포도껍질 및 포도과육등 각 부위별 추출물을 기질인 L-Dopa, 티로시나제와 함께 반응시켜 포도 추출물의 티로시나제 활성 억제도를 측정하였다. 도 1을 참조하면, 포도 가지 추출물은 모든 품종에서 티로시나제 활성 억제도를 보이며 특히 네오 마스캇(Neo Muscat) 품종에서 높은 억제활성을 나타내었다.

상기 포도가지 추출물의 세포 독성 정도 및 멜라닌 생성 억제 정도를 포도씨 추출물 및 포도껍질 추출물등과 비교하여 보았다. 멜라닌 생성 세포를 10% fetal bovine serum 과 1% penicillin-streptomycin, 200 nM의 phorbol-12 myristate 13-acetate 가 함유된 RPMI 1640 배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 포도 부위별 추출물을 EtOH/H₂O(6/4 부피비)용액에 녹여 농도를 조절하고, 상기 멜라닌 생성 세포 배양액을 농도를 달리한 포도 부위별 추출물로 3 일간 처리하였다.

도 2 내지 4는 멜라닌 생성 세포 배양액을 농도를 달리한 포도 부위별 추출물로 3 일간 처리후, 세포 생존률 및 멜라닌 함량비를 나타낸 결과이다. 도 2는 캠벨 품종, 도 3은 네오 마스캇 품종, 그리고 도 4는 MBA품종의 추출물로 처리한 것이다. 추출물이 첨가되지 않은 EtOH/H₂O(6/4 부피비)용액만으로 처리한 군의 3일 후 세포 생존률 및 멜라닌 함량을 100%로 하여 결과를 나타내었다. 도 2 내지 4를 참조하면, 500 ppm 농도의 Neo Muscat 가지, campbell 가지 추출물은 멜라닌 생성 세포의 사멸을 일으키지 않으면서 멜라닌 생성량을 20% 이상 감소시켰다. 한편, 500 ppm농도의 포도씨 추출물은 세가지 품종 모두에서 세포생존율 대비 9 ~ 20.4%의 멜라닌 생성 억제 활성을 나타내었으나, 높은 세포 독성을 나타내었다.

도 5는 상기 멜라닌 생성 세포를 3일간 포도 가지 및 포도 씨 추출물로 처리시 멜라닌 생성 세포의 형태를 광학 현미경으로 살펴본 결과이다. 도 5를 참조하면 100ppm농도의 포도씨 추출물과 포도가지 추출물로 처리시 모두 멜라닌 생성량을 농도 의존적으로 감소시켜 검은 색소가 사라지는 것을 볼 수 있다. 그러나, 500ppm농도의 포도씨 추출물으로 처리시에는 세포 사멸이 관찰되었으며 같은 농도의 포도가지 추출물로 처리시에는 큰 세포사멸 없이 검은 색소가 억제되는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 포도 가지 추출물은 멜라닌 생성 억제 효과가 우수하면서도 포도씨 추출물보다 세포 독성이 작으므로 미백제로 사용시 세포 독성이나 자극으로 인한 피부트러블이나 피부병 유발등의 부작용이 작을 것으로 기대된다.

본 발명은 상기 포도가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선 차단용 조성물을 제공한다.

상기 포도가지 추출물은 자외선, 특히 UV-B영역의 자외선을 차단하여 피부에 사용시 일광화상 및 지연형 색소 침착을 막는 효과를 가진다.

자외선은 피부의 색소 과생성에 가장 주요한 원인으로 알려져 있다. 자외선은 320~400nm 의 UV-A, 280~320nm의 UV-B, 100~280nm의 UV-C 영역으로 구분할 수 있다. UV-A 는 파장이 길어 피부 진피층까지 침투할 수 있으며 즉시형 색소침착을 일으킨다. UV-B 는 UV-A에 비해 파장이 짧아 피부 깊숙이 침투하지 않지만 에너지가 높아 일광화상을 유발시키며 노출 후 72시간 이후부터 색소침착이 나타나는 지연형 색소침착을 일으킨다.

상기 티로시나제 활성 억제도 측정 결과에서 우수한 미백 활성을 보인 네오마스캇 가지, 켐벨가지 추출물을 메탄올에 녹여 200-500 nm 영역의 흡수도를 측정한 결과, 280~320nm의 UV-B 영역에서 특징적인 흡수를 나타내었다(도 6). 따라서 이들 포도가지 추출물은 피부에 도포시 UV-B 영역의 자외선을 차단하여 일광화상 및 지연형 색소침착을 막는 효과를 기대할 수 있는 것으로 판단된다.

본 발명의 포도가지 추출물은 프로시아니딘 B2(procyanidin B2)성분을 포함한다.

상기 프로시아니딘 B2는 하기 화학식 1 로 표현된다 :

[화학식 1]

포도가지 추출물의 성분을 HPLC(Jasco Co. Bondapak C18 column)로 분석하였다. 도 7을 참조하면, 포도가지 추출물에는 다양한 종류의 폴리페놀 성분이 함유되어 있는 것으로 나타났다. 포도가지 추출물에 함유되어 있는 폴리페놀 성분은 catechin, epicatechin, kaempferol, quercetin, gallic acid, myricetin 및 resveratrol등이다. 상기 폴리페놀 성분의 티로시나제 활성 억제 정도를 측정한 결과, 도 8을 참조하면, 7 종의 폴리페놀 성분중 resveratrol, gallic acid가 가장 높은 tyrosinase 억제활성을 나타내었으며 myricetin, quercetin, kaemperol 은 200 ppm 이상에서 약 40% 정도의 억제활성을 나타내었고, catechin과 epicatechin은 활성을 나타내지 않았다. 또한, 상기 폴리페놀 성분이 멜라닌 생성 세포와 멜라닌 생성량에 미치는 영향을 측정한 결과(도 10), 100 ppm 농도에서 resveratrol, quercetin 등이 세포생존율 대비 13 ~ 15%의 멜라닌 억제활성을 나타내었다.

상기 기재한 바와 같이 폴리페놀 성분들은 포도가지 추출물의 티로시나제 활성 및 멜라닌 생성 억제에 영향을 미치나, 포도가지 추출물이 우수한 티로시나제 활성 및 멜라닌 생성 억제 효과를 가지면서도 세포 독성이 적으므로 이러한 효과를 나타내는 다른 성분을 활성 추적법을 통하여 규명하였다. 포도가지 추출물을 open column chromatography를 행하여 정제물을 얻고 이중 멜라닌 생성억제 활성이 우수한 단일 spot을 선별하였다. 이를 Mass및 HPLC로 확인 결과, 프로시아니딘 B2임이 밝혀졌다. 프로시아니딘 B2의 농도별로 티로시나제 활성 억제도 및 세포에 미치는 영향을 측정한 결과, 티로시나제 활성 억제 및 멜라닌 생성 저해 효과는 우수한 반면, 세포 독성이 거의 없는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 프로시아니딘 B2를 함유하는 미백제는 미백효과가 우수하면서도 세포 독성으로 인한 부작용이 거의 없을 것으로 판단된다. 또한, 세포 독성이 작으므로 사용량을 증가시킬 수 있어 미백 효과를 더욱 증대시킬 수 있다.

본 발명의 포도 가지 추출물의 재료로 네오 마스캇 또는 켐벨품종을 사용할 수 있다.

상기 포도가지 추출물의 재료로 사용되는 포도의 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 네오 마스캇 또는 켐벨을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 우리나라에서 많이 생산되는 품종인 켐벨(Campbell early), 네오 마스캇(Neo Muscat, 청포도), MBA(Muscat Bailey A, 머루포도)의 3 가지 품종의 포도를 선발하여 실험에 사용하였다. 상기 3가지 품종의 포도 가지 추출물의 티로시나제 활성 억제도, 세포 생존률 및 멜라닌 생성량에 미치는 영향을 측정한 결과 네오 마스캇 및 켐벨에서 결과가 좋았다. 네오 마스캇과 켐벨 가지 추출물의 프 로시아니딘 B2함량을 측정한 결과 80%에탄올 추출물내에 각각 약 0.2중량% 와 0.09중량%가 함유되어 있었다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물의 바람직한 제형으로는, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 맛사지 크림, 엣센스, 팩등을 들 수 있다. 어느 제형이든 각 업계에서 통상 이용될 수 있는 성분들과 배합될 수 있다.

이하 실시예와 비교예를 통하여 본 발명을 설명한다. 이는 본 발명을 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.

< 실시예 1> 포도가지 추출물의 제조

캠벨(Campbell early), 네오 마스캇(Neo Muscat, 청포도), MBA(Muscat Bailey A, 머루포도)의 3가지 품종의 포도를 준비하였다. 시료는 증류수로 세척 후, 가지부분을 분리하여 물기를 제거하고 분쇄한 후, 추출용매로 80%에탄올을 사용하여 초음파 추출하였고, 얻어진 추출액은 여과지로 여과한 후, 회전 감압 농축기를 이용하여 완전 농축시켜 추출물을 제조하였고, -20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

< 실시예 2> 포도가지 추출물을 함유하는 화장수의 제조

상기 실시예 1에 의해 제조된 포도가지 추출물 1.0중량부, 글리세린 3.0중량부, 부틸렌 글리콜 2.0중량부, 프로필렌 글리콜 2.0중량부, 디메치콘 오일 0.2중량부, 에탄올 10중량부, pH조정제 0.1중량부, 방부제 0.1중량부, 색소 0.1중량부, 향료 0.1중량부 및 총 100중량부가 되도록 정제수를 첨가하여 포도가지 추출물을 함유하는 화장수를 제조하였다.

< 비교예1 > 포도씨 추출물의 제조

상기 실시예 1과 같은 방법으로 각 품종별 포도씨의 추출물을 제조하였다.

< 비교예2 > 포도껍질 추출물의 제조

상기 실시예 1과 같은 방법으로 각 품종별 포도껍질의 추출물을 제조하였다.

< 비교예3 > 포도과육 추출물의 제조

상기 실시예 1과 같은 방법으로 각 품종별 포도과육의 추출물을 제조하였다.

< 실험예 1> 티로시나제 활성 억제도 측정

상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 포도 각 부위 추출물의 티로시나제 활성 억제도를 측정하였다. 8.0 mM L-dopa (67 mM phosphate buffer, pH 6.8 에 녹임) 120 μl 와 메탄올에 녹인 여러 농도의 포도 추출물 시료 40 μl 를 96-well microplate에 넣고 mushroom tyrosinase(125 U/ml) 40μl를 가한 후 생성된 dopachrome의 양을 492 nm 에서의 흡수도를 측정하여 검정하였다. 각 포도 추출물 시료의 티로시나제 억제도 측정 결과는 도 1과 같다.

도 1을 참조하면, 캠벨과 네오 마스캇에서는 가지와 씨의 추출물이 200ppm이하의 농도에서 티로시나제 활성 억제도가 좋았고, 특히 네오 마스캇은 가지 추출물이 200 ppm에서 60.3% 의 억제활성을 나타내었고 이것은 모든 품종 및 부위별 포도 추출물중 가장 우수하였다. 또한, MBA 품종은 모든 부위에서 유사한 억제도를 나타내었다.

< 실험예 2> 세포 독성 및 멜라닌 생성 억제도 측정

멜라닌 생성세포를 10% fetal bovine serum 과 1% penicillin-streptomycin, 200nM의 phorbol-12 myristate 13-acetate 가 함유된 RPMI 1640 배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 각 부위별 추출물을 에탄올/증류수(6/4부피비)용액에 녹여 10 ug/ml, 100 ug/ml, 500 ug/ml농도의 시료를 제조하였다. 상기 시료로 배양된 멜라닌 생성 세포를 3일간 처리한 후 세포생존률 및 멜라닌 생성비를 측정하여 도 2~4에 나타내었다.

도 2~4를 참조하면 500 ppm농도의 네오마스캇 가지, 캠벨 가지 추출물로 처리시 큰 세포사멸을 일으키지 않으면서 세포생존률 대비 20% 이상의 멜라닌 생성량을 감소 시켰다. 또한 비교예 1의 포도씨 추출물은 세가지 품종 모두에서 500 ppm으로 처리시 9 ~ 20.4%의 멜라닌생성억제 활성을 나타내었으나 동일 농도에서 높은 세포 독성을 나타내었다.

< 실험예 3> MSH 로 인한 멜라닌 생성 억제도 측정

상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 3에서 제조한 품종별 포도 추출물의 멜라닌 세포 자극 호르몬(MSH)으로 인한 멜라닌 생합성 증가에 대한 억제효과를 살펴보기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

B-16 흑색종 세포는 MSH등의 외부 자극에 의해 tyrosinase의 발현이 늘어나며 따라서 melanin 합성을 증가시킨다. B-16 흑색종 세포를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지에 10% FBS와 1% antibiotics를 첨가하여 37℃에서 5% CO₂ 조건에서 배양한 후, 24 well plate에 1 x 10⁵ cell/well 농도로 분주하였다. 24시간동 안 안정화시킨 후에, 상기 24 well plate에 분주한 B-16 흑색종 세포를 α-MSH 와 실시예 1 및 비교예 1 내지 3에서 제조한 포도 품종별, 각 부위 추출물로 3일 동안 하루에 한번씩 처리하였다. α-MSH는 최종 농도가 10 nM이 되도록 하였고, 포도 품종별, 부위별 추출물의 농도는 각각 10, 50, 100 μg/ml 이 되도록 하였다. 세포 생존률(Cell viability)은 MTT assay 방법을 이용하였으며, melanin 생성량은 배지를 제거하고 PBS로 washing 하여준 후, 1 N NaOH 1 ml를 가하여서 melanin을 녹인 후에 400 nm에서 UV 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

sample		농도 (μg/ml)	멜라닌 함량비 (% of control)	세포 생존률 (% of control)
Skin (비교예2)	캠벨	10	90.23 ± 1.57	102.95 ± 2.77
		50	100.16 ± 2.23	99.88 ± 4.14
		100	103.74 ± 0.61	92.23 ± 3.33
	MBA	10	96.86 ± 1.76	102.38 ± 1.06
		50	99.09 ± 0.71	103.13 ± 2.60
		100	102.87 ± 2.72	101.24 ± 1.57
	네오 마스캇	10	95.20 ± 1.90	97.95 ± 4.38
		50	95.92 ± 2.59	97.61 ± 4.23
		100	100.66 ± 1.94	98.18 ± 6.88
Seed (비교예1)	캠벨	10	93.57 ± 2.54	98.19 ± 6.20
		50	15.45 ± 8.16	48.80 ± 9.30
		100	18.75 ± 3.06	22.97 ± 3.92
	MBA	10	98.79 ± 2.41	100.93 ± 2.23
		50	51.62 ± 20.47	90.43 ± 11.27
		100	32.17 ± 15.91	62.26 ± 15.47
	네오 마스캇	10	79.48 ± 5.91	100.86 ± 0.96
		50	9.38 ± 3.99	39.65 ± 10.93
		100	2.54 ± 0.83	15.41 ± 0.07
Branch (실시예1)	캠벨	10	112.64 ± 4.99	105.67 ± 5.70
		50	119.18 ± 4.29	103.92 ± 2.87
		100	51.21 ± 16.26	96.23 ± 12.15
	MBA	10	105.89 ± 3.40	102.64 ± 1.07
		50	108.31 ± 7.80	100.58 ± 5.14
		100	81.86 ± 24.60	91.45 ± 15.85
	네오 마스캇	10	101.09 ± 3.87	104.89 ± 6.80
		50	93.64 ± 5.53	105.28 ± 7.98
		100	60.84 ± 4.16	93.62 ± 10.29

상기 표 1을 참조하면, 3종의 포도껍질 추출물은 세포 독성을 보이지 않았으나, Melanin 생성 억제 효과 또한 보이지 않았다. 3종의 포도씨 추출물은 50μg/ml부터 세포 독성이 나타나기 시작했으며, 100 μg/ml에서 큰 독성을 보였다. 포도가지 추출물은 켐벨과 네오 마스캇이 멜라닌 생성억제활성을 나타내었는데 100 μg/ml에서 캠벨가지 추출물은 90% 이상의 생존률을 보이면서 50%정도 멜라닌 생성을 감소시켰고, 네오 마스캇 가지 추출물도 100 μg/ml에서 90%이상의 세포 생존률 및 40%정도 멜라닌 생성이 감소를 보였다. 따라서, 가지 추출물이 MSH로 인한 멜라닌 형성을 억제하는 효과를 가지고 있으면서 세포독성은 작음을 알 수 있다.

< 실험예 4> 자외선 차단효과 측정

포도가지 추출물의 자외선 차단 효과를 확인하기 위하여 상기에서 멜라닌 생성 억제 효과가 우수했던 실시예 1에 의해 제조된 100ppm농도의 캠벨가지 추출물과 네오 마스캇 가지 추출물의 UV 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 포도가지 추출물은 UV-B영역인 280~320 nm 사이에 속하는 영역에서 특징적인 흡수를 보였다. 따라서, UV-B를 차단하여 일광화상 및 지연형 색소침작을 막는 효과를 기재할 수 있다. 너무 강한 흡수는 추출물 성분이 자외선과 반응하여 광독성을 일으킬 수도 있는 바, 포도가지 추출물은 적당한 흡수도를 나타낸다고 할 수 있다.

< 실험예 5> 포도추출물내의 성분분석

상기 실험예에서 티로시나제 활성 억제도 및 멜라닌 생성 억제도가 높았던 실시예 1의 캠벨 및 네오 마스캇 가지 추출물과 비교예 1의 캠벨 씨 추출물의 성분을 HPLC(Jasco Co.,Japan)를 이용하여 분석하였다. Column은 Bondapack C18 (4 um, 300 × 3.9 mm)을, 이동상은 2% acetic acid가 함유된 water 와 0.5% acetic acid 가 함유된 50% acetonitrile을 사용하였다. 용출 속도는 0.8 ㎖/min이고, Column의 온도는 40℃로 유지 하였으며, 280 nm에서 UV-detector로 검출하였다. 상기 포도 추출물은 10 mg/㎖로 메탄올에 녹인 후 0.45 μm syringe filter (Millipore)로 여과하여 사용하였다. 그 결과는 도 7 및 표 2에 나타내었다.

(단위:80%에탄올 추출물내의 중량%)

	gallic acid	catechin	epicatechin	myricetin	resveratrol	quercetin	kaemperol
campbell branch	0.025%	0.282%	0.787%	0.010%	0.020%	0.015%	0.184%
neo muscat branch	0.040%	0.182%	0.527%	0.014%	0.002%	0.018%	0.026%
campbell seed	0.384%	2.055%	4.642%	-	0.020%	0.016%	-

상기 표 2와 도 7을 참조하면, 캠벨 품종의 포도씨 추출물에는 높은 함량의 gallic acid, catechin, epicatechin이 집중적으로 함유되어 있었으며, 가지에는 여러 종류의 폴리페놀 성분이 고루 함유되어 있었다.

< 실험예 6> 포도 추출물 성분의 티로시나제 활성 억제도

상기 실험예 5에서 분석된 포도 추출물 성분의 티로시나제 활성 억제도를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하여 그 결과를 도 8에 나타냈다. 코직산(kojic acid)은 종래 미백제로 상용화되었던 물질로 티로시나제 활성 억제도를 비교하기 위해 사용하였다.

도 8을 참조하면, 7종의 폴리페놀 성분중 resveratrol, gallic acid가 가장 높은 tyrosinase 억제활성을 나타내었으며 myricetin, quercetin, kaemperol 은 200 ppm 이상에서 약 40% 정도의 억제활성을 나타내었고 catechin과 epicatechin은 활성을 나타내지 않았다.

< 실험예 7> Procyanidin B2의 티로시나제 활성 억제도

Procyanidin B2의 티로시나제 활성 억제도를 상기 실험예 1과 같은 방법으로 측정하여 이를 도 9에 나타내었다. 또한, 상기 실험예 2와 같은 방법으로 Procyanidin B2 및 7종의 폴리페놀 성분을 멜라닌 생성세포에 처리후, 세포 생존률 및 멜라닌 함량비를 구하여 도 10에 나타내었다. 비교물질로 코직산(kojic acid)의 세포 생존률 및 멜라닌 함량비도 구하였다.

도 9 및 10을 참조하면 프로시아니딘 B2는 티로시나제 활성을 농도의존적으로 억제하였고 특히 큰 세포독성 없이 멜라닌 생성량을 세포 생존율 대비 30% 이상 감소시키는 결과를 나타내어 코직산 및 7종의 폴리페놀 성분 보다 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었다.

< 실험예 8> 포도가지 추출물내의 procyanidin B2의 함량측정

캠벨 가지 및 네오 마스캇 가지 추출물내 procyanidin B2의 함량을 HPLC(Jasco Co., Japan)를 이용하여 정량하였다. Bondapack C18 (4 um, 300 × 3.9 mm) Column 을 사용하였고, 이동상은 2% acetic acid가 함유된 water 와 0.5% acetic acid 가 함유된 50% acetonitrile을 사용하였다. Column의 온도는 40℃로 유지 하였으며 시료의 검출은 280 nm에서 UV-detector를 사용하였다. 그 결과는 도 11 및 하기 표 3에 나타내었다. 하기 함량은 80% 에탄올 추출물 내에 함유되어 있는 Procyanidin B2의 중량비를 의미한다.

	procyanidin B2 함량
켐벨 가지 추출물	0.088%
네오 마스캇 가지 추출물	0.201%

도 1은 포도 품종별 각 부위 추출물의 티로시나제 활성 억제도를 나타낸 그래프이다.

도 2는 멜라닌 생성 세포를 캠벨 품종의 각 부위별 추출물로 3일간 처리후 세포 생존률 및 멜라닌 함량비를 나타낸 그래프이다.

도 3은 멜라닌 생성 세포를 네오 마스캇 품종의 각 부위별 추출물로 3일간 처리후 세포생존률 및 멜라닌 함량비를 나타낸 그래프이다.

도 4는멜라닌 생성 세포를 MBA 품종의 각 부위별 추출물로 3일간 처리후 세포생존률 및 멜라닌 함량비를 나타낸 그래프이다.

도 5은 멜라닌 생성 세포를 실시예 1의 켐벨 및 네오마스캇 가지 추출물과 비교예 1의 켐벨 씨 추출물로 3일간 처리후 멜라닌 생성 세포의 morphology를 관찰한 결과이다.

도 6은 캠벨 가지 추출물과 네오 마스캇 가지 추출물의 UV 흡수도를 나타낸 결과이다.

도 7은 캠벨 가지, 네오 마스캇 가지 및 캠벨 씨 추출물의 폴리페놀 성분을 HPLC로 분석한 결과이다.

도 8은 폴리페놀 성분들의 티로시나제 활성 억제도를 나타낸 결과이다.

도 9는 Procyanidin B2의 티로시나제 활성 억제도를 나타낸 그림이다.

도 10은 멜라닌 생성 세포를 폴리페놀 성분 및 Procyanidine B2로 처리시 세포 생존률 및 멜라닌 함량비를 나타낸 결과이다.

도 11은 캠벨 가지 및 네오 마스캇 가지 추출물의 procyanidine B2 함량을 측정한 HPLC결과이다.

Claims

포도가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 포도가지 추출물이 총 조성물 100중량부에 대하여 0.001 내지 10중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 포도가지 추출물이 총 조성물 100중량부에 대하여 0.05 내지 5중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 포도가지 추출물의 재료가 캠벨 또는 네오 마스캇 품종인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 포도가지 추출물이 유효성분으로 프로시아니딘 B2(procyanidin B2)를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 포도가지 추출물이 증류수, 탄소수 1 내지 20의 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제6항에 있어서,

상기 유기 용매가 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 에테르, 메틸렌 클로라이드, 에틸렌 클로라이드, 헥산 및 디에틸 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
포도가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 자외선 차단용 조성물.