KR20080111787A

KR20080111787A - 염증질환내 vcam 및 cox-2의 발현 억제제

Info

Publication number: KR20080111787A
Application number: KR1020070060162A
Authority: KR
Inventors: 조명행; 최병대; 허성웅; 김화
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단; 경상대학교산학협력단
Priority date: 2007-06-19
Filing date: 2007-06-19
Publication date: 2008-12-24

Abstract

본 발명은 미더덕 또는 멍게의 외피로부터 추출한 글리코사미노글리칸 (Glycosaminoglycans)을 유효성분으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 상기 글리코사미노글리칸에 의하여 NF-κB의 활성을 억제함을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 글리코사미노글리칸은 콘드로이틴 황산 (Chondroitin sulfate)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 글리코사미노글리칸은 면역 및 염증반응과 관련한 nuclear factor κB (NF-κB) 활성을 억제함으로써 혈관세포유착분자(vascular cell adhesion molecule, VCAM)과 싸이클로옥시제나제-2 (cyclooxygenase-2, COX-2) 발현을 억제하는 글리코사미노글리칸의 항-염증 분자 메커니즘을 제공함으로써 항 염증 제재를 제공할 수 있으며 염증진행의 억제를 통한 종양발생의 감소를 도모할 수 있을 것이다.

미더덕, 멍게, 글리코사미노글리칸, GAGs, COX-2, NF-κB, VCAM

Description

미더덕 또는 멍게 외피에서 추출한 글리코사미노글리칸을 함유하는 염증질환 치료용 약학적 조성물{Anti-inflammatory effects by glycosaminoglycans extracted from ascidian tunic}

도 1은 쥐의 피부에서 VCAM, COX-2발현에 대한 GAGs의 억제 효과를 나타낸다. 쥐는 GAGs (1㎎ or 2㎎)가 있거나 없는 상태에서 TPA (200㎕ of 10 nmol TPA dissolved in acetone)를 국소적으로 처리하였고, 대조 동물은 단지 아세톤만 처리하였다. (A)는 쥐의 피부에서 VCAM 발현의 웨스턴블랏 분석이고, (B)는 농도계에 의해 관심있는 밴드에 대해 추가로 분석한 것이다. (C)는 쥐의 피부에서 COX-2의 면역조직화학측정 결과이다. 흑갈색은 COX-2의 발현을 나타낸다. (D)는 쥐의 피부에서 COX-2 표시된 표지의 비교이다. COX-2-양성 염색은 각 섹션 당 무작위로 선택된 영역 5개를 세고, COX-2-양성 염색 400배 확대하여 100개의 세포당 DAB-양성 세포의 백분율을 결정하는 것에 의하여 결정된다.

도 2는 쥐의 피부에서 NF-κB 의 활성화에 대한 GAGs의 억제효과를 나타낸 것이다. 쥐는 국소적으로 GAGs (1㎎ or 2㎎)가 있거나 또는 없는 상태에서 TPA (200㎕ of 10 nmol TPA dissolved in acetone) 처리되었고, 대조 동물은 단지 아세톤만 처리되었다. (A)는 쥐의 피부로부터 핵 추출물에서 p65 단백질 수준의 웨스턴 블랏 분석이다. (B)는 p65의 농도계분석이다. (C)는 IκKα와 p-IκKα발현의 웨스턴 블랏 분석이다. (D)는 관심있는 밴드에 대해 농도계에 의해 추가로 분석한 것이다.

도 3은 쥐의 피부에서 IKK 인산화에 대한 GAGs의 억제효과를 나타낸 것이다. 쥐는 국소적으로 GAGs (1㎎ or 2㎎)가 있거나 또는 없는 상태에서 TPA (10nmol 200㎕ acetone)처리되었고, 대조 동물은 단지 아세톤만 처리되었다. (A)는 쥐의 피부에서 IKKβ과 p-IKKβ발현 수준의 웨스턴 블랏 분석이다. (B)는 농도계에 의하여 관심있는 밴드를 추가로 분석한 것이다.

도 4는 쥐의 피부에서 p38 인산화에 대한 GAGs의 억제효과를 나타낸 것이다. 쥐는 국소적으로 GAGs (1㎎ or 2㎎)가 있거나 또는 없는 상태에서 TPA (10nmol 200㎕ acetone)처리되었고, 대조 동물은 단지 아세톤만 처리되었다. (A)는 쥐의 피부에서 p38 과 p-p38 발현 수준의 웨스턴 블랏 분석이다. (B)는 농도계에 의하여 관심있는 밴드를 추가로 분석한 것이다.

도 5는 쥐의 피부에서 Akt 인산화에 대한 GAGs 의 억제 효과를 나타내는 것이다. 쥐는 국소적으로 GAGs (1㎎ or 2㎎)가 있거나 또는 없는 상태에서 TPA (10nmol 200㎕ acetone)처리되었고, 대조 동물은 단지 아세톤만 처리되었다. (A)는 쥐 피부에서 Akt와 p-Akt 발현 수준의 웨스턴 블랏 분석이다. (B)는 농도계에 의해 관심있는 밴드를 추가로 분석한 것이다.

글리코사미노글리칸 (Glycosaminoglycans, 이하 GAGs라 함)은 생합성 과정에서 부분적인 변화를 통해 구조적으로 다양하고 복잡한 형태를 지니게 된다. GAG 류는 우론산과 글루코사민이 반복되면서 부분적으로 황산화가 이루어져 있는 기본적인 골격을 가지고 있으며, 이러한 복잡한 화학구조에 의해 여러 종류의 생물활성을 나타낼 수 있게 된다. 현재까지 알려진 바에 의하면, 이와 같이 다양한 생물활성은 고유의 특정서열이 존재함에 기인한 것으로 보인다.

동물류의 GAG류로는 하이알우론산 (hyaluronic acid), 콘드로이틴 황산 (chondroitin sulfate), 케라틴 황산 (keratin sulfate), 헤파란 황산 (heparan sulfate), 헤파린(heparin) 등이 알려져 있다. 이들 GAG류 중 헤파린은 간, 허파, 피부 점막내의 동맥을 따라서 있는 마스트 (mast) 세포 내에 고립되어 존재하고 그 외 나머지 GAG류는 연결조직에 분포한다. 의약품으로 사용되는 콘드로이틴 황산은 상어의 척추 연골 및 소의 기관지에서 얻어지고 있다. 또한, 하등동물인 연체동물 에서도 GAG류가 발견되고 있는데, 그 예로서 조개류에서 3-0-황산기를 가지면서 안티트롬빈 (antithrombin) 결합부위가 있는 GAG류의 존재가 보고되었고 (Pejler et al, J. Biol. Chem., 262; 11413-11421, 1986), 해삼, 성게류에서도 황산기가 치환된 콘드로이틴 황산류가 발견되었다 (Mourao et al, TIGG, 7; 235-246, 1995). 그리고 오징어의 각막에서도 콘드로이틴 황산이 존재함이 알려졌으며 (Karamanos et al., Int. J. Biochem., 23; 67-72, 1991), 아카란 황산은 아프리카산 왕달팽이에 풍부하게 존재함이 밝혀졌다 (Kim et al., J. Biol. Chem. ,271; 170-175, 1996).

GAG류는 생체 내에서 프로테오글리칸 (proteoglycan)의 형태로 존재하며, 이러한 프로테오글리칸은 프로테아제 (protease)와 글리코시다아제 (glycosidase)에 의해 분해되어 당부분이 유리된다. GAG류의 생리적 역할에 대해서 아직까지 많이 밝혀져 있지 않으나 생체 내의 단백질들과 결합하여 생리활성을 나타내는 것으로 보인다. 생체 내에서 GAG류와 결합하는 단백질은 프로테아제 저해제 (protease inhibitor), 혈장의 지질단백질 (lipoprotein), 성장인자, 지질분해효소, 외피세포결합체 (extracelluar matrix) 단백질 등 크게 5가지로 나눌 수 있다. 이들 단백질은 GAG류와 결합하여 각각의 특이한 생리활성에 작용한다.

첫번째 GAG류는 프로테아제 저해제와 결합하여 생리 활성을 나타내는데, GAG류와 결합하는 대표적인 프로테아제 저해제로는 안티트롬빈III (antithrombin III) 와 헤파린 보조인자 II (heparin cofactor II)가 있다. 헤파린은 안티트롬빈 III 와 결합하여 혈액인자 Xa와 트롬빈의 작용을 억제하고, 헤파린 보조인자 II와 결합하여 트롬빈의 작용을 저해하여 혈액응고를 막는다.

두번째 GAG류는 혈장의 지질단백질과 결합하는 것으로서, GAG류와 결합하는 대표적인 혈장 지질단백질에는 아포지질단백질E와 아포지질단백질B가 있다. 혈장 지질단백질과 결합하는 GAG류에는 헤파린과 콘드로이틴이 있으며, 이러한 헤파린과 콘드로이틴은 아포지질단백질E와 아포지질단백질B의 산성 및 염기성 아미노산이 몰려 있는 부위와 상호작용을 하여 동맥경화의 발생을 조절한다.

세번째 GAG류는 성장인자와 결합하는데 GAG류와 결합하는 성장인자에는 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF)가 있으며, 성장인자와 결합하는 GAG류에는 헤파린과 헤파란 황산이 있다. 헤파린과 헤파란 황산은 bFGF와 결합하여 bFGF가 분해되는 것을 방지함으로써 세포성장 및 분화에 중요한 역할을 담당한다.

네번째 GAG류는 지질분해 효소와 결합하는 것으로, 헤파린과 헤파란 황산을 정맥으로 주사하면 지질분해 효소인 저밀도 지질 단백질 (low density lipoprotein) 분해효소와 중성지방 분해효소를 혈장세포 내로 유리시키게 되는데, 이와 같이 유리된 지질분해 효소가 혈중의 지방을 분해시키기 때문에 동맥경화 예방에 큰 역할을 한다.

다섯번째 GAG류는 외피세포 결합체와 결합하는데, GAG류와 상호작용을 하는 외피세포 결합체의 단백질로는 피브로넥틴 (fibronectin), 비트로넥틴 (vitronectin), 라미닌 (laminin), 트롬보스폰딘 (thrombospondin)이 있다. 이들 GAG류와 결합하는 단백질은 세포부착, 세포간의 정보전달, 세포분화, 세포성장 등에 주요하다.

전술한 바와 같이, GAG류는 생체내의 단백질과 결합하여 여러 가지 생리활성 을 나타내므로 다양한 용도로 사용될 수있다. GAG류가 약물로 쓰이는 예로서, 특히 콘드로이틴 황산은 점안제, 관절염 치료제, 최근에는 강장 드링크류 등에도 사용되고 있다.

한편, 염증은 종양발생의 중요한 구성성분으로 여겨지나 염증의 기초적인 메커니즘이 대부분 알려져 있지 않은 상태로 남아 있다 (1). 흥미롭게도 양성종양세포는 숙주에서 염증반응을 유도하고 desmoplasia (결합조직형성)라고 부르는 진행을 통하여 종양의 발생을 도울 수 있는 것처럼 보이며 (2), 본질적으로 염증반응을 구성하는 모든 구성요소는 종양세포에 대한 위축 목적의 숙주 반응에 참여하고 있다 (3).

다른 한편으로, nuclear factor κB (NF-κB)는 어디에나 존재하고 복합체현상의 조절을 담당하는 것에 잘 특성화된 단백질이다. 어떤 조건에서 신체의 세포신호를 통제하는 중심적 역할을 하며, 특히 다른 기능 중에서도 NF-κB는 염증의 진행을 통제하는데 중요한 역할을 하는 모든 것, 향 염증 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines) [예를 들면, interlukin 1 (IL-1), tumor necrosis factor α (TNF-α)], 케모카인 (chemokines) [예를 들면, IL-8, macrophage inflammatory protein-1 α (MIP-1α), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP1)], 그리고 세포유착분자 (cell adhesion molecules) [예를 들면, vascular cell adhesion molecule (VCAM)], 유발 효소 (inducible enzymes) [예를 들면, cyclooxygenase-2 (COX-2)]를 통제한다 (4). 따라서 NF-κB는 많은 염증 질환을 치 료하는 약에 있어서 중요하면서도 매우 눈에 띄는 치료 타겟을 대표한다고 할 수 있어 선택적으로 이러한 경로를 방해하는 화합물에 광범위하게 주의가 집중되고 있으며, 최근 아주 많은 천연 물질이 NF-κB 경로의 가능한 억제제로서 평가되고 있다 (5).

또한 COX-2의 활성은 염증에 연관된 발암현상에 중요한 역할을 하는 잘 알려진 전사 NF-κB를 조절하는 것으로 알려져 있으며, 최근 일련의 증거들은 중요인자로서 COX-2가 염증 사이의 인과관계에 관련되어 있다는 것을 증명하고, COX-2를 암예방 및 치료의 잠재적인 타겟으로 제안하였다 (1, 27). 비록 몇몇 COX-2 억제자들이 항염증 제재로서 보고되었으나, US FDA와 같은 관리 기관에 의해 COX-2 억제자의 실질적 경고가 내려졌다.

한편, 세린/트레오닌 키나아제와 산화환원-조절 전사인자를 구성하는 다양한 세포의 신호전달 조성물은 향 염증 (pro-inflammatory) 자극에 반응하는 COX-2 발현의 조절에 관여한다.(6) 종양 프로모터 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA) 국소적용은 쥐 피부에서 COX-2 mRNA 전사와 단백질 발현을 유도한다는 것이 보고되어 있다. COX-2 유전자의 5'-flanking region은 NF-κB를 포함하는 다른 전사인자에 대한 몇몇 결합모티프를 포함하고 있으며, p65 와 p50의 이형이합체로서 주로 NF-κB는 COX-2 단백질 발현을 조절하는 COX-2 유전자 프로모터에 위치하는 κB 공통서열에 결합한다 (8). 자극이 없는 상태에서 NF-κB는 세포질액에 NF-κB 의 핵전위를 차단하는 억제 단백질 IκB 와 함께 비활성 복합체로서 남아있다 (9). IκBα 의 인산화 및 이에 따른 유비퀴틴화와 염증자극에 대한 단백질 분해는 NF-κB를 핵으로 전위시키는 것과 κB 조절 요소에 결합하는 것을 자유롭게 한다 (10). IκBα 인산화는 IκBkinase (IKK) 복합체의 활성화에 의해 유발된다 (11).

최근의 연구는 IKKβ-의존성 NF-κB 활성은 염증과 암 사이의 본질적인 연결을 만들어낸다는 유전적 증거를 제공하고 있으며 (11, 12), 게다가 IKKs, 몇몇 다른 단백질 키나아제는 또한 NF-κB 활성을 조절하는 것으로 보고되었다. 이러한 상류 키나아제 (upstream kinases) 중에서 NF-κB를 조절함에 있어 p38MAPK와 같은 미토겐 활성화 단백질 키나아제 (mitogen-activated protein kinases, MAPKs)의 역할은 잘 보고되어 있다 (13, 14). 또한, 또 다른 세린/트레오닌 키나아제인 세포사멸을 방해함으로써 세포의 생존을 촉진하는 Akt는 NF-κB/IκB 경로를 통하여 COX-2 발현을 조절하는 것으로 보고되어 있다 (16).

그러므로 낮은 독성 및 우수한 효율을 갖는 COX-2 억제자의 개발이 요구된다고 할 것인바, 본 발명자들은 천연의 식이 출처인 미더덕 또는 멍게의 외피로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 하여, NF-κB의 활성을 억제함으로써 VCAM 또는 COX-2의 발현을 억제함을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물을 개발하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 GAGs의 항-염증 효과에 관한 근본적인 분자메커니즘을 제공함으로써 GAGs 를 유효성분으로 포함하는 항 염증 제재의 제공 및 염증진행의 억제를 통한 종양발생의 감소를 도모하는 데 있다.

본 발명에 따르면 쥐 피부의 생체 내에서 TPA에 의하여 염증을 유도하였고, 상기 유도된 염증에서 GAGs를 처리하는 쥐 피부의 염증치료는 p65단백질 (도 2A, B)의 핵전위, IκBα인산화 (도 2C, D), 및 IKKα 인산화 (도 3A, B)를 감소시킨다. 즉, NF-κB의 불활성을 통해 GAGs가 COX-2 단백질 발현을 억제한다.

또한 본 발명에 따르면, 쥐 피부의 생체 내에서 TPA에 의해 염증을 유도하였고, 상기 유도된 염증에서 GAGs의 치료는 p38의 인산화를 상당히 억제하고 (도 4A, B), 이에 따라 COX-2 단백질 발현이 감소된다. 즉 상류 키나아제 p38 (upstream kinase p38)을 조절하는 것을 통해 GAGs가 TPA에 의해 유도된 NF-κB활 성을 제거된다.

또한 본 발명에 따르면 Akt활성화가 GAG처리에 의해 억제되고 (도 5), GAGs는 TPA에 의해 유도된 COX-2발현을 Akt활성을 제거함에 의하여 부분적으로 억제한다. 즉, 본 발명에 의하면 GAGs는 쥐피부 생체 내에서 IKKβ와 Akt/PKB 신호를 차단함에 의하여 TPA-유도된 NF-kB 활성 및 순차적으로 COX-2 발현을 억제하는 항염증 메카니즘을 제공한다.

그러므로 본 발명에 의해 미더덕 또는 멍게 외피에서 추출한 GAGs는 효과적인 천연 항 염증 제재로서 개발될 수 있다.

즉, 본 발명은 미더덕 또는 멍게의 외피로부터 추출한 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 바람직하게는 상기 글리코사미노글리칸이 콘드로이틴 황산 (Chondroitin sulfate)인 것을 특징으로 하는 것을 포함한다. 또한 상기 글리코사미노글리칸이 NF-κB의 활성을 억제함을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것을 더 포함한다. 또한 본 발명은 상기 NF-κB의 활성을 억제함으로써 VCAM (vascular cell adhesion molecule)의 발현을 억제하는 것을 더 포함하고, 상기 NF-κB의 활성을 억제함으로써 COX-2의 발현을 억제함을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물인 것을 더 포함한다.

한편, 본 발명은 상기 글리코사미노글리칸이 IkBα의 인산화 및 IkBα의 분해를 억제함으로써 상기 NF-κB의 활성이 억제됨을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물인 것을 포함하고, 상기 글리코사미노글리칸이 IKKβ의 인산화를 억제함으로써 IKK의 활성을 억제함에 따라 IkB의 인산화 및 분해가 억제되어 NF-κB의 활성이 억제되는 것을 더 포함한다. 또한 본 발명은 상기 글리코사미노글리칸이 Akt/PKB 신호를 차단함에 의하여 NF-κB의 활성이 억제됨을 특징으로 하는 것을 포함하고, 상기 글리코사미노글리칸이 p38 인산화를 억제함으로써 NF-κB의 활성이 억제됨을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물인 것을 더 포함한다.

또한 본 발명은 상기 NF-κB의 활성을 억제함으로써 COX-2의 발현을 억제함을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물인 것을 더 포함한다..

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한하는 것은 아니다.

<실시예 1>

재료의 준비

미더덕 또는 멍게 외피에서 추출한 글리코사미노글리칸은 통영 (한국)에서 입수하였다. 간단히, 재료를 아세톤에 담군 상태로 24시간동안 4 ℃를 유지하였다. 미더덕 또는 멍게로부터 분리된 외피는 작은 조각으로 잘라서 건조시켰다. GAGs는 건조된 조직으로부터 다른 조직에 대해 묘사된 것과 동일한 방법 (19)으로 추출하였다. TPA는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 입수하였다. Thr38에서 Akt1과 phosphor-Akt에 대한 모노클론항체는 통상의 방법을 사용하여 생산하였다. Ser473에서 항-phosph-Akt 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였고 웨스턴블랏과 면역조직화학 (IHC)을 위한 다른 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. Anti-rabbit, anti-mouse 및 anti-goat horseradish peroxidase-결합 2차 항체는 Zymed Laboratories (San Francisco, CA, USA)로부터 구입하였다. 사용된 다른 모든 화학물질은 상업적으로 사용가능한 가장 순수한 형태이다.

<실시예 2>

동물 치료

암컷 ICR 쥐 (~5주령)는 중앙실험동물 (서울, 한국)으로부터 공급되었으며 온도 23ㅁ2℃ 및 상대습도 50ㅁ20%에서 12시간 밤/낮 주기를 유지하여 실험실 동물 시설에 보관되었다. 쥐는 무작위로 4개의 그룹으로 나누었으며, 각각의 그룹은 세마리로 구성되었다. 쥐는 각각 4시간동안 GAGs (1㎎ or 2㎎)을 가지거나 가지지 않은 채로 털이 깎인 등에 국소적으로 TPA (아세톤용매에 10 nmol)가 노출되었다. 실험동물은 아세톤 (200㎕) 단독으로 치료되었다. 최종적으로 쥐를 희생시키고 피부는 분석을 위해 수집되었다. 본 연구에 사용된 모든 방법은 Animal Care and Use Committee at Seoul National University (SNU-061116-2)에 의해 승인되었다.

<실시예 3>

웨스턴 블랏 분석

총 분자 단백질은 피부조직으로부터 Hwang et al. (20)에 의해 개시된 방법으로 준비되었다. 그리고 핵단백질은 Nuclear Extract Kit (Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 준비되었다. Bradford kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 균질화된 용해물의 단백질농도를 측정한 후에 30㎍ 단백질이 SDS-PAGE에 분리되고, 니트로셀룰로오스 (nitrocellulose) 막에 이동되었다. 상기 막은 5% 탈지우유를 포함하는 TTBS에서 1시간동안 차단시키고, 4℃의 5% 탈지우유에 대응하는 1차 항체를 가지고 밤새도록 그리고 horseradish peroxidase 에 결합하는 2차항체를 가지고 3시간동안 실내온도에서 또는 4℃에서 밤새도록 막을 배양함으로써 면역블랏팅을 하였다. 세척 후에 관심있는 이러한 밴드는 발광성 상 분석기 LAS-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan)에 의해 분석되었다. Multi Gauge version 2.02 program (Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 웨스턴 블랏의 정량분석을 하였다.

<실시예 4>

면역조직화학

10% 중성 완충 포르말린에 고정된 파라핀 포매 피부 조직을 4㎛로 절단하였다. IHC를 위해 조직섹션은 자일렌에서 파라핀을 제거하고 알코올 구배 (alcohol gradients)를 통하여 다시 수화시켰다. 조직섹션을 세척하고 내인성 과산화 효소 활성을 억제하기 위하여 3% 과산화수소 (AppliChem, Darmstadt, Germany)에서 30분 간 배양하였다. PBS에서 세척한 후, 비특이적 결합부위를 차단하기 위해 조직 섹션을 PBS내 5% BSA로 상온에서 1시간동안 배양하였다. 1차 항체들은 4℃에서 조직 섹션 상에 밤새 적용하였다. 다음날, 조직섹션들을 세척하고 HRP-결합 2차항체 (1:50)와 상온에서 1시간동안 배양하였다. 조심스럽게 새척한 후 조직 섹션들은 Mayer Hematoxylin (Dako, Caepinteria, CA, USA)으로 대조염색하고 자일렌으로 세척하였다. Permount (Fisher, Pittsburgh, PA, USA)을 사용하여 커버슬라이들을 올리고 광학 현미경 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA)하에서 관찰하였다.

결과

1. COX-2 와 VCAM 발현 억제 효과

쥐의 피부에서 TPA에 의해 염증을 유도하고 GAGs의 잠재적인 효과를 측정한 결과, GAGs에 의해 VCAM발현이 억제되는 것이 농도계 분석에 의해 명확히 관찰되었다 (도 1A, B). GAGs는 또한 GAGs에 의해 COX-2 발현이 상당히 억제되는 것이 쥐 피부에서 COX-2표시된 표지 (도 1D)를 득점하는 것과 IHC (도 1C)에 의해 입증되었다.

2. NF-κB 활성 억제 효과

상기 실험 결과를 통하여 NF-κB (p65) 단백질 발현이 GAGs처리에 의하여 상당히 억제되었다 (도 2A, B). 또한 IkBα발현과 IkBα의 인산화를 분석한 결과 GAGs처리에 의하여 IkBα의 인산화 및 잇따른 IkBα의 분해가 상당히 감소되었다 (도 2C, D). 즉, GAGs에 의하여 NF-κB의 활성이 억제되었다.

3. IkB키나아제 (IKK)의 인산화 억제 효과

IKKβ의 단백질 발현 및 인산화를 분석한 결과, 증가되었된 IKKβ의 인산화가 GAGs처리에 의해 상당히 감소되었다 (도 3).

4. p38의 인산화 억제 효과

웨스턴 블랏 분석에 의하여 p38 MAPK의 인산화에 대한 GAGs의 효과를 조사한 결과, GAGs처리는 p38 인산화를 상당히 억제하였으며 (도 4A), 농도계분석을 통해 GAGs 처리 그룹의 p38 단백질 인산화의 감소를 명확히 재확인할 수 있다 (도 4B).

5. Akt의 인산화 억제 효과

상기 실험의 결과는 GAGs처리가 Ser473 와 Thr308 모두에서 Akt인산화를 상당히 억제하였다 (도 5A, B). 따라서 Akt의 인산화가 억제됨으로써 NF-κB활성이 조절되고 결과적으로 쥐 피부에서 COX-2 발현이 억제되었다.

상기에서 검토한 바와 같이, 본 발명의 미더덕 또는 멍게의 외피에서 추출한 글리코사미노글리칸이 TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)에 의해 유도된 쥐 피부 염증모델에서 nuclear factor κB (NF-κB) 활성 및 이에 따른 vascular cell adhesion molecule (VCAM)과 cyclooxygenase-2 (COX-2) 발현을 억제하는 분자 메커니즘을 제공하여, 글리코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 항염증 제재의 제공 및 염증진행의 억제를 통한 종양발생의 감소를 도모할 수 있다.

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Claims

미더덕 또는 멍게의 외피로부터 추출한 글리코사미노글리칸 (Glycosaminoglycans)을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 글리코사미노글리칸이 콘드로이틴 황산 (Chondroitin sulfate)인 것을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 글리코사미노글리칸이 NF-κB (nuclear factor κB)의 활성을 억제함을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 3항에 있어서,

상기 NF-κB의 활성을 억제함으로써 VCAM (vascular cell adhesion molecule)의 발현을 억제함을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 3항에 있어서,

상기 NF-κB의 활성을 억제함으로써 COX-2 (cyclooxygenase-2)의 발현을 억제함을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 글리코사미노글리칸이 IkBα의 인산화 및 IkBα의 분해를 억제함으로써 상기 NF-κB의 활성이 억제됨을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 글리코사미노글리칸이 IKKβ의 인산화를 억제함으로써 IKK의 활성을 억제함에 따라 IkB의 인산화 및 분해가 억제되어 NF-κB의 활성이 억제됨을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 글리코사미노글리칸이 Akt/PKB 신호를 차단함에 의하여 NF-κB의 활성이 억제됨을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 글리코사미노글리칸이 p38 인산화를 억제함으로써 NF-κB의 활성이 억제됨을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 6항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 NF-κB의 활성을 억제함으로써 COX-2의 발현을 억제함을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.