CN104757252B - 一种具有抗氧化活性的灰树花蛋白酶解物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有抗氧化活性的灰树花蛋白酶解物的制备方法，属于生物酶解技术领域。该方法采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺提取灰树花子实体中的蛋白质，然后通过碱性蛋白酶的可控酶解工艺制备蛋白酶解物，最后采用“离心–超滤–干燥”工艺分离出具有抗氧化活性的蛋白酶解物组分。本发明所制备的灰树花子实体蛋白酶解物具有较强的DPPH自由基和羟自由基清除率及较强的还原力，是潜在的天然抗氧化剂和功能性食品，具有有效地保护人体细胞组织、心脑血管循环系统及抗癌、延缓衰老等生理作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗氧化活性的灰树花蛋白酶解物的制备方法，属于生物酶解技术领域。
背景技术
灰树花（Grifola frondosa）属担子菌亚门层菌纲非褶菌目多孔菌科树花菌属真菌，主要生长在亚热带至温带，在我国主要分布于福建、河北、吉林、广西和四川等地。作为一种珍贵的食、药兼用蕈菌，灰树花的多种营养素和生理功效成分居各种食用菌之首，其药用价值、食用价值远远高于灵芝，素有“食用菌王子”和“华北人参”之美誉。灰树花具有广泛的药理活性，如：抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗辐射、 调节免疫及抗菌等功能活性。近年来，随着现代分离提取与纯化技术的不断发展和完善，灰树花中活性组分的研究取得了一些成果。研究发现，灰树花含有多种生理活性物质，主要包括多糖、蛋白质或肽类、糖蛋白或蛋白聚糖、脂类以及一些小分子化合物，其中灰树花多糖是最主要的也是至今研究得最为透彻的生理活性成分。从灰树花中提取的多糖主要具有抗肿瘤、抗糖尿病、抗肝炎，抗HIV病毒、抗氧化等功效，提取出的多酚具有抗氧化、抗菌及抑制α-淀粉酶等活性。
人体内的氧化损伤与多种疾病如动脉粥样硬化、心血管疾病、糖尿病、肿瘤等的发生密切相关。近年来，食用菌的抗氧化作用开始受到关注，从食用菌中开发天然、高效的、具有医疗保健功能的抗氧化食品或药品具有较高的开发价值和广阔的市场前景，己成为当今一个重要的研究方向。当前，对灰树花抗氧化作用的研究以证明其具备抗氧化性作用为多，也有一些研究涉及灰树花抗氧化活性物质的分离提取工艺及其抗氧化活性的研究。针对灰树花抗氧化活性物质的分离制备，如Zhang等从灰树花菌丝中分离提纯出具有抗氧化和抑制环氧合酶（COX）的作用的小分子化合物物质；陈向东等采用弱极性的大孔吸附树脂从灰树花菌丝体粗提物中分离出具有对氧化酶的抑制和对金属离子的络合作用的抗氧化多酚，经过光谱分析鉴定为一种黄烷醇类物质；冯尚坤等以灰树花菌丝体为原料通过中性蛋白酶酶解制备抗氧化活性多肽，所制得的灰树花多肽具有较强的超氧自由基和羟基自由基的清除率；陈贵堂等人以灰树花子实体为原材料，通过“碱溶酸沉”法提取灰树花蛋白，以胰蛋白酶可控酶解制备灰树花抗氧化酶解物，然而所制得的蛋白酶解产物的抗氧化活性一直达不到人工合成的抗氧化剂活性那么高，必须采用美拉德反应来进一步提高灰树花蛋白酶解物的抗氧化活性。
发明内容
本发明涉及一种具有抗氧化活性的灰树花蛋白酶解物的制备方法，提供一种灰树花子实体蛋白的提取工艺、蛋白酶可控酶解工艺、蛋白酶解物的分离纯化工艺，经“离心–超滤–干燥”分离纯化工艺制备的灰树花子实体蛋白酶解物具有较强的体外抗氧化活性（DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和还原力）。
一种具有抗氧化活性的灰树花蛋白酶解物的制备方法，其制备步骤如下：
1）原料预处理：将灰树花子实体干制品粉碎成粉末，过40～80目筛；
2）蛋白质提取：采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺提取灰树花子实体中的蛋白质；
3）酶解：将提取的灰树花子实体蛋白溶解于蒸馏水后，置于酶解反应器中，加入碱性蛋白酶，调节pH值，搅拌酶解；
4）灭酶：酶解反应结束时，停止搅拌，将蛋白酶解液迅速升温至70～100℃，保持10～30分钟，将蛋白酶灭活；
5）离心分离：酶解液在1000～5000rpm离心5～20分钟，收集上清液；
6）超滤：上清液在0.01～0.25MPa，30～50℃，pH6～8条件下超滤，选用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，超滤后获得具有抗氧化活性的蛋白酶解液；
7）干燥：将超滤后得到的蛋白酶解液干燥至白色粉末，即为具有抗氧化活性的灰树花子实体蛋白酶解物。
所述的灰树花子实体蛋白质的提取包括以下步骤：
1）称取灰树花子实体干粉，按固液质量比1:40～1:80加入蒸馏水，搅拌均匀；
2）通过超声波破碎仪破碎细胞，超声波器输出功率为100～300W，每次工作时间/间歇时间为1～10秒/1～10秒，工作总时间为2～20分钟；
3）调pH值至10.5～13.0，磁力搅拌器搅拌，40～60℃水浴保温1～4小时，3000～4500rpm离心10分钟，获得上清液；
4）调pH值至3.0～4.0，搅拌均匀，3000～4500rpm离心10分钟，弃上清液取沉淀；
5）沉淀经冷冻真空干燥得灰树花子实体蛋白粉。
本发明所述的灰树花子实体蛋白的酶解反应，所用的灰树花蛋白浓度为1%～10%（重量百分比），所用的蛋白酶为碱性蛋白酶，碱性蛋白酶用量为灰树花蛋白用量的0.50%～2.5%，控制反应温度为60～65℃，调整pH 为8.0～12.0，反应0.5～10小时。
本发明所述所述的超滤后得到的蛋白酶解液的干燥，是采用冷冻真空干燥、喷雾干燥、真空干燥或加热干燥。
以DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和还原力为依据，证明了灰树花子实体蛋白酶解物具有较强的体外抗氧化活性，可以制备具有抗氧化活性的食品、食品配料或保健品。
本发明提出以灰树花子实体为原料，采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺提取灰树花子实体中的蛋白质，然后通过碱性蛋白酶的可控酶解工艺制备蛋白酶解物。相比以往采用“碱溶酸沉”的蛋白提取工艺，该发明采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺使得灰树花子实体蛋白提取率显著性提高；与现有的研究报道相比，采用碱性蛋白酶酶解灰树花蛋白所制得的酶解产物的体外抗氧化活性也显著性提高，其中还原力和DPPH自由基清除能力均比等质量浓度（5mg/mL）的抗坏血酸强。此外，本发明所制备的抗氧化蛋白酶解物是经过“离心–超滤–干燥”工艺进一步分离纯化得到的蛋白酶解物组分，其中多肽的质量浓度较高且具有较强的抗氧化活性，既可以作为具有延缓衰老的营养食品直接食用，也可以作为食品配料或保健品。
具体实施方式
下面结合实例，更具体的说明本发明内容。本发明的制备方法，并不局限于以下实例，对本发明的制备方法有任何形式的改变，都将落入本发明的保护范围。
实施例一
原料预处理：将灰树花子实体干制品粉碎成粉末，过40目筛；
蛋白质提取：采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺提取灰树花子实体中的蛋白质，具体提取步骤如下：
称取灰树花子实体干粉5kg，按固液质量比1:40加入蒸馏水，搅拌均匀；
通过超声波破碎仪破碎细胞，超声波器输出功率为150 W，每次工作时间/间歇时间为5秒/5秒，工作总时间为10分钟；
采用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至10.5，磁力搅拌器搅拌，50℃水浴保温2小时，4500rpm离心10分钟，获得上清液；
上清液用1mol/L盐酸溶液调pH值至3.0，搅拌均匀，4500rpm离心10分钟，弃上清液取沉淀；
沉淀经冷冻真空干燥得灰树花子实体蛋白粉；
酶解：将提取的灰树花子实体蛋白（1g）置于250mL酶解反应器中，加入50mL蒸馏水，添加诺维信公司生产的食品级碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，其用量为灰树花蛋白量的1.0%，控制反应温度为60℃，调整pH 为9.0，反应2小时；
灭酶：酶解反应结束时，停止搅拌，将蛋白酶解液迅速升温至95℃，保持20分钟，将蛋白酶灭活；
离心分离：酶解液在4500rpm离心10分钟，收集上清液；
超滤：上清液在0.25MPa，30℃，pH7.0条件下超滤，选用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，超滤后获得具有抗氧化活性的蛋白酶解液（分子量 < 5kD）；
干燥：将超滤后得到的蛋白酶解液加热干燥至白色粉末，即为具有抗氧化活性的灰树花子实体蛋白酶解物。
实施例二
原料预处理：将灰树花子实体干制品粉碎成粉末，过60目筛；
蛋白质提取：采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺提取灰树花子实体中的蛋白质，具体提取步骤如下：
称取灰树花子实体干粉5kg，按固液质量比1:60加入蒸馏水，搅拌均匀；
通过超声波破碎仪破碎细胞，超声波器输出功率为100W，每次工作时间/间歇时间为5秒/5秒，工作总时间为10分钟；
采用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至11.0，磁力搅拌器搅拌，50℃水浴保温4小时，搅拌均匀，4500rpm离心10分钟，获得上清液；
上清液用1mol/L盐酸溶液调pH值至3.5，4500rpm离心10分钟，弃上清液取沉淀；
沉淀经冷冻真空干燥得灰树花子实体蛋白粉；
酶解：将提取的灰树花子实体蛋白（1g）置于250mL酶解反应器中，加入80mL蒸馏水，添加诺维信公司生产的食品级碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，其用量为灰树花蛋白量的1.5%，控制反应温度为60℃，调整pH 为9.0，反应2小时；
灭酶：酶解反应结束时，停止搅拌，将蛋白酶解液迅速升温至95℃，保持20分钟，将蛋白酶灭活；
离心分离：酶解液在4500rpm离心10分钟，收集上清液；
超滤：上清液在0.25MPa，30℃，pH7.0条件下超滤，选用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，超滤后获得具有抗氧化活性的蛋白酶解液（分子量 < 5kD）；
干燥：将超滤后得到的蛋白酶解液真空干燥至白色粉末，即为具有抗氧化活性的灰树花子实体蛋白酶解物。
实施例三
原料预处理：将灰树花子实体干制品粉碎成粉末，过80目筛；
蛋白质提取：采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺提取灰树花子实体中的蛋白质，具体提取步骤如下：
称取灰树花子实体干粉5kg，按固液质量比1:80加入蒸馏水，搅拌均匀；
通过超声波破碎仪破碎细胞，超声波器输出功率为200W，每次工作时间/间歇时间为8秒/5秒，工作总时间为10分钟；
采用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至12.0，磁力搅拌器搅拌，60℃水浴保温4小时，搅拌均匀，4500rpm离心10分钟，获得上清液；
上清液用1mol/L盐酸溶液调pH值至3.5，4500rpm离心10分钟，弃上清液取沉淀；
沉淀经冷冻真空干燥得灰树花子实体蛋白粉；
酶解：将提取的灰树花子实体蛋白（2g）置于250mL酶解反应器中，加入100mL蒸馏水，添加诺维信公司生产的食品级碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，其用量为灰树花蛋白量的2.0%，控制反应温度为60℃，调整pH 为9.0，反应2小时；
灭酶：酶解反应结束时，停止搅拌，将蛋白酶解液迅速升温至100℃，保持10分钟，将蛋白酶灭活；
离心分离：酶解液在4500rpm离心10分钟，收集上清液；
超滤：上清液在0.25MPa，30℃，pH7.0条件下超滤，选用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，超滤后获得具有抗氧化活性的蛋白酶解液（分子量 < 5kD）；
干燥：将超滤后得到的蛋白酶解液喷雾干燥至白色粉末，即为具有抗氧化活性的灰树花子实体蛋白酶解物。
实施例四
原料预处理：将灰树花子实体干制品粉碎成粉末，过60目筛；
蛋白质提取：采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺提取灰树花子实体中的蛋白质，具体提取步骤如下：
称取灰树花子实体干粉5kg，按固液质量比1:60加入蒸馏水，搅拌均匀；
通过超声波破碎仪破碎细胞，超声波器输出功率为200 W，每次工作时间/间歇时间为6秒/3秒，工作总时间为10分钟；
采用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至10.5，磁力搅拌器搅拌，50℃水浴保温2小时，搅拌均匀，4500rpm离心10分钟，获得上清液；
上清液用1mol/L盐酸溶液调pH值至3.5，4500rpm离心10分钟，弃上清液取沉淀；
沉淀经冷冻真空干燥得灰树花子实体蛋白粉；
酶解：将提取的灰树花子实体蛋白（2g）置于250mL酶解反应器中，加入100mL蒸馏水，添加诺维信公司生产的食品级碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，其用量为灰树花蛋白量的2.5%，控制反应温度为60℃，调整pH 为9.0，反应0.5小时；
灭酶：酶解反应结束时，停止搅拌，将蛋白酶解液迅速升温至95℃，保持10分钟，将蛋白酶灭活；
离心分离：酶解液在4500rpm离心10分钟，收集上清液；
超滤：上清液在0.25MPa，30℃，pH7.0条件下超滤，选用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，超滤后获得具有抗氧化活性的蛋白酶解液（分子量 < 5kD）；
干燥：将超滤后得到的蛋白酶解液冷冻真空干燥至白色粉末，即为具有抗氧化活性的灰树花子实体蛋白酶解物。
实施例五
原料预处理：将灰树花子实体干制品粉碎成粉末，过60目筛；
蛋白质提取：采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺提取灰树花子实体中的蛋白质，具体提取步骤如下：
称取灰树花子实体干粉5kg，按固液质量比1:60加入蒸馏水，搅拌均匀；
通过超声波破碎仪破碎细胞，超声波器输出功率为200 W，每次工作时间/间歇时间为6秒/3秒，工作总时间为10分钟；
采用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至10.5，磁力搅拌器搅拌，50℃水浴保温2小时，搅拌均匀，4500rpm离心10分钟，获得上清液；
上清液用1mol/L盐酸溶液调pH值至3.5，4500rpm离心10分钟，弃上清液取沉淀；
沉淀经冷冻真空干燥得灰树花子实体蛋白粉；
酶解：将提取的灰树花子实体蛋白（2g）置于250mL酶解反应器中，加入100mL蒸馏水，添加诺维信公司生产的食品级碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，其用量为灰树花蛋白量的2.5%，控制反应温度为60℃，调整pH 为9.0，反应1.0小时；
灭酶：酶解反应结束时，停止搅拌，将蛋白酶解液迅速升温至95℃，保持10分钟，将蛋白酶灭活；
离心分离：酶解液在4500rpm离心10分钟，收集上清液；
超滤：上清液在0.25MPa，30℃，pH7.0条件下超滤，选用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，超滤后获得具有抗氧化活性的蛋白酶解液（分子量 < 5kD）；
干燥：将超滤后得到的蛋白酶解液冷冻真空干燥至白色粉末，即为具有抗氧化活性的灰树花子实体蛋白酶解物。
实施例六
原料预处理：将灰树花子实体干制品粉碎成粉末，过60目筛；
蛋白质提取：采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺提取灰树花子实体中的蛋白质，具体提取步骤如下：
称取灰树花子实体干粉5kg，按固液质量比1:60加入蒸馏水，搅拌均匀；
通过超声波破碎仪破碎细胞，超声波器输出功率为200 W，每次工作时间/间歇时间为6秒/3秒，工作总时间为10分钟；
采用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至10.5，磁力搅拌器搅拌，50℃水浴保温2小时，搅拌均匀，4500rpm离心10分钟，获得上清液；
上清液用1mol/L盐酸溶液调pH值至3.5，4500rpm离心10分钟，弃上清液取沉淀；
沉淀经冷冻真空干燥得灰树花子实体蛋白粉；
酶解：将提取的灰树花子实体蛋白（2g）置于250mL酶解反应器中，加入100mL蒸馏水，添加诺维信公司生产的食品级碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，其用量为灰树花蛋白量的2.5%，控制反应温度为60℃，调整pH 为9.0，反应2.0小时；
灭酶：酶解反应结束时，停止搅拌，将蛋白酶解液迅速升温至95℃，保持10分钟，将蛋白酶灭活；
离心分离：酶解液在4500rpm离心10分钟，收集上清液；
超滤：上清液在0.25MPa，30℃，pH7.0条件下超滤，选用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，超滤后获得具有抗氧化活性的蛋白酶解液（分子量 < 5kD）；
干燥：将超滤后得到的蛋白酶解液冷冻真空干燥至白色粉末，即为具有抗氧化活性的灰树花子实体蛋白酶解物。
实施例七
原料预处理：将灰树花子实体干制品粉碎成粉末，过60目筛；
蛋白质提取：采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺提取灰树花子实体中的蛋白质，具体提取步骤如下：
称取灰树花子实体干粉5kg，按固液质量比1:60加入蒸馏水，搅拌均匀；
通过超声波破碎仪破碎细胞，超声波器输出功率为200 W，每次工作时间/间歇时间为6秒/3秒，工作总时间为10分钟；
采用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至10.5，磁力搅拌器搅拌，50℃水浴保温2小时，搅拌均匀，4500rpm离心10分钟，获得上清液；
上清液用1mol/L盐酸溶液调pH值至3.5，4500rpm离心10分钟，弃上清液取沉淀；
沉淀经冷冻真空干燥得灰树花子实体蛋白粉；
酶解：将提取的灰树花子实体蛋白（2g）置于250mL酶解反应器中，加入100mL蒸馏水，添加诺维信公司生产的食品级碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，其用量为灰树花蛋白量的2.5%，控制反应温度为60℃，调整pH 为9.0，反应4.0小时；
灭酶：酶解反应结束时，停止搅拌，将蛋白酶解液迅速升温至95℃，保持10分钟，将蛋白酶灭活；
离心分离：酶解液在4500rpm离心10分钟，收集上清液；
超滤：上清液在0.25MPa，30℃，pH7.0条件下超滤，选用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，超滤后获得具有抗氧化活性的蛋白酶解液（分子量 < 5kD）；
干燥：将超滤后得到的蛋白酶解液冷冻真空干燥至白色粉末，即为具有抗氧化活性的灰树花子实体蛋白酶解物。
实施例八 四种不同酶解反应时间下的灰树花子实体蛋白酶解物的体外抗氧化活性
按所述的相同步骤重复进行实施例四、实施例五、实施例六以及实施例七。将制备的灰树花子实体蛋白酶解物溶解于去离子水配制成相同的蛋白质浓度（5mg/mL）分别采用DPPH显色法、Fenton反应法、铁氰化钾测定法，进行体外清除DPPH自由基、羟基自由基以及还原力的实验。
如表1所示，酶解反应时间为2小时的蛋白酶解物的DPPH自由基清除率最高，达到96.88 ± 0.24%；酶解反应时间为2小时的蛋白酶解物的羟基自由基清除率也是最高的，达到79.76 ± 0.45%；还原力最高的是酶解反应时间为4小时的蛋白酶解物，达到0.536 ±0.012。
综合四种不同酶解反应时间下的灰树花子实体蛋白酶解物的体外抗氧化活性，酶解物的DPPH自由基清除率均高于80%，羟基自由基清除率均高于50%，还原力也都在0.2以上。由此可见，四种不同酶解时间下的灰树花子实体蛋白酶解物均具有较强的DPPH自由基和羟基自由基的清除能力以及还原性。因此，本发明所制备的灰树花子实体蛋白酶解物是一种潜在的天然抗氧化剂和功能性食品。
表1四种不同酶解时间下的酶解物的体外抗氧化活性测定结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种具有抗氧化活性的灰树花蛋白酶解物的制备方法，其特征在于：将灰树花子实体干制品粉碎后，经蛋白提取工艺、蛋白酶解工艺、“离心–超滤–干燥”分离纯化工艺，制备具有抗氧化活性的灰树花子实体蛋白酶解物；
该制备方法具体包括以下步骤：
1）原料预处理：将灰树花子实体干制品粉碎成粉末，过40～80目筛；
2）蛋白质提取：采用“超声波破碎–碱溶酸沉”工艺提取灰树花子实体中的蛋白质；
3）酶解：将提取的灰树花子实体蛋白溶解于蒸馏水后，置于酶解反应器中，加入蛋白酶，调节pH值，搅拌酶解；
4）灭酶：酶解反应结束时，停止搅拌，将蛋白酶解液迅速升温至70～100℃，保持10～30分钟，将蛋白酶灭活；
5）离心分离：酶解液在1000～5000rpm离心5～20分钟，收集上清液；
6）超滤：上清液在0.01～0.25MPa，30～50℃，pH6～8条件下超滤，选用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，超滤后获得具有抗氧化活性的蛋白酶解液；
7）干燥：将超滤后得到的蛋白酶解液干燥至白色粉末，即为具有抗氧化活性的灰树花子实体蛋白酶解物；
酶解反应所用的灰树花蛋白质量浓度为1%～10%，所用的蛋白酶为碱性蛋白酶，碱性蛋白酶用量为灰树花蛋白用量的0.50%～2.5%，控制反应温度为60～65℃，调整pH 为8.0～12.0，反应0.5～10小时；
灰树花子实体蛋白质的提取包括以下步骤：
1）称取灰树花子实体干粉，按固液质量比1:40～1:80加入蒸馏水，搅拌均匀；
2）通过超声波破碎仪破碎细胞，超声波器输出功率为100～300W，每次工作时间/间歇时间为1～10秒/1～10秒，工作总时间为2～20分钟；
3）调pH值至10.5～13.0，磁力搅拌器搅拌，40～60℃水浴保温1～4小时，3000～4500rpm离心10分钟，获得上清液；
4）调pH值至3.0～4.0，搅拌均匀，3000～4500rpm离心10分钟，弃上清液取沉淀；
5）沉淀经冷冻真空干燥得灰树花子实体蛋白粉。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的灰树花蛋白酶解物的制备方法，其特征在于：超滤后得到的蛋白酶解液的干燥是采用冷冻真空干燥、喷雾干燥、真空干燥或加热干燥。
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