CN114958948A - 一种红藻蛋白活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红藻蛋白活性肽及其制备方法和应用，制备方法包括红藻预处理、冻融提取、超滤除杂、酶解、膜过滤纯化与浓缩、干燥，得红藻蛋白活性肽。本发明将酶高效降解优势与膜快速分离纯化优势相结合，有助于提高酶解反应效率和活性肽的收率；过程易控，成本低，利于工业化生产。本发明制得的红藻蛋白活性肽具有促体内外益生菌增殖、抗肠炎和免疫调节的作用，综合改善亚健康状态；可单独或作为组件，广泛应用于药物、特殊医学用途配方食品、特殊营养配方食品、保健食品、食品或食品添加剂，有利于拓展红藻在保健食品和医药产业的应用范围。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种红藻蛋白活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
益生元是一种膳食补充剂，指选择性刺激一种或几种细菌在宿主肠道内生长或活化，增进宿主健康而又不被宿主胃肠道消化的物质。当前益生元主要包括各种寡糖类物质、低聚糖 (由2～10个分子单糖组成)、膳食纤维等糖类，主要为益生菌提供碳源营养素的益生因子。而蛋白类或低聚肽等氮源类益生元研究较少，仅有酪蛋白的水解物、乳清蛋白、乳铁蛋白被用作益生元，海洋来源的低聚肽类益生元更是鲜有报道。
红藻、紫菜、江蓠在海洋中广泛存在，资源丰富。紫菜和江蓠干藻中粗蛋白含量达25％～50％，富含膳食纤维、多种维生素及钙、钾、镁等微量元素，还含藻类特有的藻胆蛋白，具有很高的营养价值和生理活性，在食品和医药领域具有广阔的前景。随着红藻生物活性肽多种活性的发现，从生物活性肽的角度去研究蛋白质，将为有效利用蛋白质及阐明各种蛋白质的不同作用开辟新途径。
目前，红藻生物活性肽的抗氧化、增强免疫力、抗过敏、抗肿瘤、降血压作用，已有报道，而红藻蛋白肽的其他生物活性，如促益生菌增殖、抗肠炎功效目前研究尚未涉及。通常情况下，蛋白质主要是通过化学降解、发酵、酶解的方法获得生物活性肽。在不同藻类酶解制备生物活性肽的报道中，常采用复合酶法；如发明专利CN106119327A公开一种从海藻中提取低聚肤制作海藻低聚肤粉的方法，利用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、风味酶等，从孔石莼、鼠尾藻、裙带菜和螺旋藻中提取低聚肽，经膜过滤、电渗析、活性炭精制、脱炭、蒸发浓缩、干燥等过程制得海藻低聚肽粉。该法通过果胶酶作用对上述海藻薄壁进行初步破壁，但由于不同海藻的胞壁结构与组成存在极大差异，果胶酶仅能对其中含量极低的果胶及其类似成分进行降解，不能对所述藻类有效破壁且破壁效率低，对蛋白的提取促进作用有限；且增加了工艺复杂性和成本。同时，破壁酶的使用产生低分子糖类，为其后续蛋白肽的纯化过程增添了额外杂质和难度。
另一方面，现有研究表明，不同藻类中蛋白的组成结构有极大的差异，如红藻中蛋白主为藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白等组成的藻胆蛋白，在不同红藻藻种中藻胆蛋白组成因存在差异，该方法统一使用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、风味酶对不同海藻综合作用，所得蛋白肽组成存在差异，难以控制其酶解进程和批次间产物稳定性。该法的后续采用膜过滤、电渗析、活性炭精制、脱炭、蒸发浓缩等手段对蛋白肽进行纯化和浓缩，过程复杂，成本高，不利于工业化生产。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种红藻蛋白活性肽及其制备方法和应用，可有效促益生菌增殖，并具有抗肠炎功效，拓展红藻在保健食品和医药产业的应用范围的目的。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种红藻蛋白活性肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)预处理：将干燥后的红藻用粉碎机粉碎，过10～80目筛，与水按重量体积比1:15～ 50比例充分混匀，复水一定时间；新鲜红藻与水按重量体积比1:1～30比例混合；用胶体磨匀浆，得红藻浆液；
(2)冻融提取：将步骤(1)中所得红藻浆液于-15～-80℃下完全冷结，在2℃～室温下溶解，反复冻融3次，然后离心取上清液，得红藻蛋白粗提液；
(3)超滤除杂：将步骤(2)中得到的红藻蛋白粗提液进行超滤，除去小分子杂质，得红藻蛋白纯化浓缩液；
(4)酶解：将步骤(3)所得到的红藻蛋白纯化浓缩液调节pH至6.0～7.5，在40～55℃下，加入中性蛋白酶，酶解2～5h，得红藻蛋白酶解液；
(5)膜过滤纯化：将步骤(4)中所得红藻蛋白酶解液离心后，超滤纯化，收集滤过液，得红藻蛋白活性肽纯化液；
(6)膜过滤浓缩：将步骤(5)中所得红藻蛋白活性肽纯化液进行超滤精制并浓缩，得红藻蛋白活性肽浓缩液；
(7)干燥：将步骤(5)中所得浓缩液冷冻干燥得到红藻蛋白活性肽粉末。
优选地，步骤(2)中冻结温度为-20℃，可以兼顾成本和提取效率；融化温度为4～10℃，可有效抑制细菌生长。
上述方案中，步骤(3)中超滤除杂所用超滤膜截留分子量为5～20kDa，该截留分子量可高效除去粗提液中小分子杂质，并避免藻胆蛋白及其亚基等红藻可溶性蛋白流失达到快速纯化和浓缩的目的。
上述方案中，步骤(4)中酶解过程加入中性蛋白酶用量为红藻重量的1000～30000U/g。
上述方案中，步骤(5)中，膜过滤纯化所用超滤膜截留分子量为5～10kDa，保证纯化效率。
步骤(5)膜过滤纯化过程浓缩液中蛋白含量较高时，可将浓缩液重复步骤(4)和步骤 (5)，直至浓缩液蛋白浓度不再降低；已达到快速降解的同时除去酶蛋白。
上述方案中，步骤(6)中，膜过滤浓缩所用超滤膜截留分子量为100～200Da，有效回收活性肽并除去小分子盐等杂质。
上述方案中，所述藻为紫菜、江蓠和龙须菜中的至少一种。
一种如上所述的制备方法制得的红藻蛋白活性肽，红藻蛋白活性肽分子量在300Da～ 1500Da之间。
一种如上所述的红藻蛋白活性肽在制备促进益生菌增殖、抗肠炎的药物、特殊医学用途配方食品、特殊营养配方食品、保健食品、食品或食品添加剂中的应用。
上述方案中，所述益生菌包括乳杆菌、双歧杆菌。
通过上述技术方案，本发明提供的一种红藻蛋白活性肽及其制备方法和应用具有如下有益效果：
1、本发明提供的红藻蛋白活性肽的制备方法，充分利用了红藻胞壁主要结构成分红藻多糖的凝胶性质；冻融破壁后红藻胞壁多糖形成不溶性蜂窝结构，有效避免了红藻大分子多糖的溶出，减少酶和酸碱的使用，避免额外藻体杂质的生成，有利于红藻蛋白的分离纯化。
2、目前红藻酶解技术采用复合酶降解，且酶综合用量在红藻重量的1.2万～30万U/g，本发明将酶高效降解优势与膜快速分离纯化优势相结合，使降解产物快速分离，降低了底物对酶的反馈抑制，且高分子蛋白底物通过膜过滤得到浓缩，有助于提高酶解反应效率和酶的利用率；与现有技术相比酶用量降低10倍，仅为红藻重量的1000～30000U/g。
3、本发明技术采用单酶降解，提高了酶解过程的可控性，有利于获得更高活性的促益生菌增殖、抗肠炎肽，大大提高了红藻蛋白活性肽的收率。
4、本发明提供的红藻蛋白活性肽的制备方法，过程简单，成本低，利于工业化生产。
5、本发明制备的红藻蛋白活性肽，具有促进益生菌生长作用。
6、本发明制备的红藻蛋白活性肽，具有促进肠道益生菌增殖的作用，缓解肠道验证，预防亚健康状态的出现。
7、本发明制备的红藻蛋白活性肽，具有良好的风味和色泽，可单独或作为组件，广泛应用于药物、特殊医学用途配方食品、特殊营养配方食品、保健食品、食品或食品添加剂。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例提供一种具有促益生菌增殖和抗肠炎作用的红藻蛋白活性肽，制备方法如下：
(1)预处理：取干坛紫菜5kg用粉碎机粉碎，过20目筛，加入175kg蒸馏水，充分混匀，搅拌室温下复水5h，得紫菜浆液。
(2)冻融提取：将步骤(1)中所得紫菜浆液按照25kg/桶分装后，于-20℃下完全冷结，在10℃下溶解，反复冻融3次；采用管式离心机，在10℃下离心，收集上清液，得红藻蛋白粗提液。
(3)超滤除杂：将步骤(2)中得到的红藻蛋白粗提液，采用截留分子量为10kDa的滤膜，进行超滤，除去粗提液中小分子杂质，获得红藻蛋白纯化浓缩液；
(4)酶解：将步骤(3)所得到的红藻蛋白纯化浓缩液调节pH至7.5，加入规格为30万U/g的中性蛋白酶50g于反应釜中，在50℃下，酶解3h，期间不断搅拌，得红藻蛋白酶解液；
(5)膜过滤纯化：将步骤(5)中所得红藻蛋白酶解液，用管式离心机离心后，泵入膜过滤系统，采用截留分子量为5kDa的膜进行过滤纯化，收集滤过液，为红藻蛋白活性肽纯化液；截留液返回反应釜继续反应，直至测得截留液中蛋白含量小于0.1g/mL，终止反应；
(6)膜过滤浓缩：将步骤(6)中所得红藻蛋白活性肽纯化液，泵入膜过滤系统，采用截留分子量为200Da的膜进行过滤，收集截留液，即得红藻蛋白活性肽浓缩液；
(7)干燥：将步骤(7)中所得红藻蛋白活性肽浓缩液冷冻干燥，得到红藻蛋白活性肽粉，并于2～8℃下保存备用。
实施例2
本实施例提供一种具有促益生菌增殖和抗肠炎作用的红藻蛋白活性肽，制备方法如下：
(1)预处理：取鲜龙须菜100kg，切碎；与100kg水混合，用胶体磨匀浆，得龙须菜浆液。
(2)冻融提取：将步骤(1)中所得龙须菜浆液按照25kg/桶分装后于-20℃下完全冷结，在20℃下溶解，反复冻融3次；采用管式离心机，在10℃下离心，收集上清液，得红藻蛋白粗提液。
(3)超滤除杂：将步骤(2)中得到的红藻蛋白粗提液，采用截留分子量为10kDa的滤膜，进行超滤，除去粗提液中小分子杂质，获得红藻蛋白纯化浓缩液；
(4)酶解：将步骤(3)所得到的红藻蛋白纯化浓缩液调节pH至6.8，加入规格为20万U/g的中性蛋白酶50g于反应釜中，在45℃下，酶解4h，期间不断搅拌，得红藻蛋白酶解液；
(5)膜过滤纯化：将步骤(5)中所得红藻蛋白酶解液，用管式离心机离心后，泵入膜过滤系统，采用截留分子量为5kDa的膜进行过滤纯化，收集滤过液，为红藻蛋白活性肽纯化液；截留液返回反应釜继续反应，直至测得截留液中蛋白含量小于0.1g/mL，终止反应；
(6)膜过滤浓缩：将步骤(6)中所得红藻蛋白活性肽纯化液，泵入膜过滤系统，采用截留分子量为200Da的膜进行过滤，收集截留液，即得红藻蛋白活性肽浓缩液；
(7)干燥：将步骤(7)中所得红藻蛋白活性肽浓缩液冷冻干燥，得到红藻蛋白活性肽粉，并于2～8℃下保存备用。
对比例1
本对比例提供一种红藻蛋白，制备方法如下：
(1)预处理：另取干坛紫菜1kg用粉碎机粉碎，过20目筛，加入35kg蒸馏水，充分混匀，搅拌室温下复水5h，得紫菜浆液。
(2)冻融提取：将步骤(1)中所得紫菜浆液于-20℃下完全冷结，在10℃下溶解，反复冻融3次；采用管式离心机，在10℃下离心，收集上清液，得红藻蛋白粗提液。
(3)超滤除杂：将步骤(2)中得到的红藻蛋白粗提液，采用截留分子量为10kDa的滤膜，进行超滤，除去粗提液中小分子杂质，获得红藻蛋白纯化浓缩液；
(4)干燥：将步骤(3)中所得红藻蛋白纯化浓缩液冷冻干燥，得到红藻蛋白粉，并于2～8℃下保存备用。
对比例2
本对比例提供一种红藻蛋白，制备方法如下：
(1)预处理：另取干坛紫菜1kg用粉碎机粉碎，过80目筛，加入35kg蒸馏水，充分混匀，搅拌室温下复水5h，得紫菜浆液。
(2)酶解提取：将步骤(1)中所得紫菜浆液加热至50℃，调节PH至4.0，加入规格为10 万U/g的果胶酶0.5g、规格为10万U的纤维素酶1g，搅拌酶解5h，得到紫菜酶解液。
(3)超滤除杂：将步骤(2)中得到的紫菜酶解液，采用截留分子量为10kDa的滤膜，进行超滤，除去粗提液中小分子杂质，获得红藻蛋白纯化浓缩液；
(4)干燥：将步骤(3)中所得红藻蛋白纯化浓缩液冷冻干燥，得到红藻蛋白粉，并于2～ 8℃下保存备用。
对比例3
本对比例提供一种红藻蛋白活性肽，制备方法如下：
(1)预处理：另取干坛紫菜5kg用粉碎机粉碎，过20目筛，加入175kg蒸馏水，充分混匀，搅拌室温下复水5h，得紫菜浆液。
(2)冻融提取：将步骤(1)中所得紫菜浆液按照25kg/桶分装后于-20℃下完全冷结，在 10℃下溶解，反复冻融3次；采用管式离心机，在10℃下离心，收集上清液，得红藻蛋白粗提液。
(3)超滤除杂：将步骤(2)中得到的红藻蛋白粗提液，采用截留分子量为10kDa的滤膜，进行超滤，除去粗提液中小分子杂质，获得红藻蛋白纯化浓缩液；
(4)酶解：将步骤(3)所得到的红藻蛋白纯化浓缩液转入反应釜中，调节pH至8.5，加入规格为10万U/g的中性蛋白酶525g、规格为20万U/g的碱性蛋白酶12g、胰酶5g、规格为60 万U/g的木瓜蛋白酶5g、风味蛋白酶5g，在48℃下，酶解5h；之后升温至90灭酶20min；期间不断搅拌，得红藻蛋白酶解液。
(5)膜过滤纯化：将步骤(5)中所得红藻蛋白酶解液，用管式离心机离心后，泵入膜过滤系统，采用截留分子量为5kDa的膜进行过滤纯化，收集滤过液，为红藻蛋白活性肽纯化液；截留液返回反应釜继续反应，直至测得截留液中蛋白含量小于0.1g/mL，终止反应；
(6)膜过滤浓缩：将步骤(6)中所得红藻蛋白活性肽纯化液，泵入膜过滤系统，采用截留分子量为200Da的膜进行过滤，收集截留液，即得红藻蛋白活性肽浓缩液；
(7)干燥：将步骤(7)中所得红藻蛋白活性肽浓缩液冷冻干燥，得到红藻蛋白活性肽粉，并于2～8℃下保存备用。
应用：
1、红藻蛋白和红藻蛋白活性肽对益生菌促生长作用效果评估
培养基：采用PYG基础培养基，分别添加3％的葡萄糖(对照)以及实施例1、2，以及对比例1-3所制备的红藻蛋白活性肽和红藻蛋白，配置发酵培养基，按照30mL/50mL分别分装到50mL的培养瓶中密封，氮气置换至培养基原色，121℃灭菌15min，冷却至室温，加入过滤除菌的维生素K1溶液0.5mL和氯化血红素素溶液(5mg/ml)2.5mL，混匀。
实验菌株：鼠李乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌。
将上述实验菌悬于无菌生理盐水中制备成0.2亿CFU/mL的菌悬液；无菌操作取菌悬液 0.2mL接种于培养瓶中，置于厌氧培养箱中于37℃中静置培养48h；用分光光度计测定发酵菌液在600nm处的吸光度，测定OD600值，结果见表1。
表1红藻蛋白和红藻蛋白活性肽对益生菌的促生长作用
| 对照 | 实施例1 | 实施例2 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
| 鼠李乳杆菌 | 0.441 | 0.551 | 0.549 | 0.449 | 0.457 | 0.461 |
| 罗伊氏乳杆菌 | 0.638 | 0.825 | 0.794 | 0.648 | 0.656 | 0.661 |
| 嗜酸乳杆菌 | 0.411 | 0.586 | 0.596 | 0.415 | 0.417 | 0.430 |
| 青春双歧杆菌 | 0.381 | 0.546 | 0.551 | 0.395 | 0.391 | 0.404 |
| 婴儿双歧杆菌 | 0.486 | 0.686 | 0.715 | 0.472 | 0.485 | 0.496 |
| 动物双歧杆菌 | 0.415 | 0.572 | 0.562 | 0.413 | 0.411 | 0.431 |
由表1可知，实施例1和2中，菌浓相对于空白组提高24.9％～43.3％和24.5％～47.1％，表明本发明所制备的红藻蛋白活性肽对双歧杆菌和乳杆菌均具有良好的促进增值作用。与对照组相比，对比例1和2的菌浓提高不足4％，表明红藻蛋白对双歧杆菌和乳杆菌不具有促进作用。对比例3的菌浓相对对照组略高(仅提高1.4％～3.6％和2.0％～6.1％)，但不具统计学意义的显著性。实施例1实验组菌相对对比例1、2、3分别高22.7％～45.3％、20.6％～41.4％、 19.5％～38.3％；实施例2实验组菌相对对比例1、2、3分别高22.3％～51.5％、20.1％～47.4％、 19.0％～44.1％。由上可知，本发明技术所制备的红藻蛋白活性肽具有良好的促进双歧杆菌和乳杆菌增殖作用，其效果远优于红藻蛋白和经复合酶降解制备的红藻蛋白肽。
2、红藻蛋白和红藻蛋白活性肽对炎症性肠病(IBD)小鼠肠道菌群调节与抗炎作用效果评估
将70只6周龄SPF级健康成年雌性C57BL/6J小鼠，随机分组，每组10只。实验组每天灌胃给予实施例1-2以及对比例1-3所制备的红藻蛋白活性肽和红藻蛋白100mg/kg/d，持续21天；阳性对照组每天灌胃给予阳性药物5-ASA 100mg/kg/d；以等体积的生理盐水灌胃组为空白对照；从第12天开始用2.5％的葡聚糖硫酸钠盐(DSS)替代饮用水，测空白对照组小鼠粪便隐血确定是否IBD小鼠模型；在最后一次灌胃后24h测其体重并处死小鼠，测结肠长度，取结肠和结肠内容物。采用实时荧光定量PCR法测定结肠内容物中双歧杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属和肠杆菌的含量，结果见表2；采用生物试剂盒检测小鼠炎症因子TNF-α、免疫球蛋白sIgA、血液炎症细胞、粪便隐血等指标，采用Histochemistry score法评测肠上皮紧密连接蛋白occludin和zo1水平，结果见表3，以评估其抗炎和免疫节作用。
表2红藻蛋白和红藻蛋白活性肽对小鼠肠道菌群的调节效果(log拷贝数/g)
| 双歧杆菌 | 乳杆菌 | 肠球菌 | 肠杆菌 | |
| 实施例1 | 6.99 | 8.12 | 4.23 | 8.31 |
| 实施例2 | 6.75 | 8.61 | 4.42 | 8.24 |
| 对比例1 | 4.38 | 5.68 | 6.07 | 9.79 |
| 对比例2 | 4.39 | 5.73 | 6.15 | 9.67 |
| 对比例3 | 4.47 | 6.38 | 5.99 | 9.43 |
| 阳性对照 | 4.43 | 6.42 | 4.67 | 8.51 |
| 空白对照组 | 4.15 | 5.40 | 6.19 | 9.82 |
由表2可知，实施例1、2和对比例3制得的红藻蛋白活性肽对小鼠肠道内双歧杆菌和乳杆菌具有更好的促生长作用，有效提高了其含量，并对肠球菌和肠杆菌产生了一定的抑制作用；特别是实施例1和2制得的红藻蛋白活性肽其效果明显高于对比例3复合酶所制备活性肽的效果。由对比例1和2制得的红藻蛋白对上述菌群也产生作用，但其作用效果显著低于本发明，亦低于对比例3复合酶所制备活性肽。上述结果还表明本发明红藻蛋白活性肽对炎症性肠病(IBD)小鼠肠道菌群调节效果明显高于阳性对照组效果。因此，本发明红藻蛋白活性肽可以改善炎症性肠病(IBD)小鼠肠道菌群中益生菌群的含量，并抑制有害菌群的生长。
表3红藻蛋白和红藻蛋白活性肽对炎性肠道理化因子的调节效果
炎症性肠病(IBD)小鼠症状表现为结肠缩短并伴有结肠出血形成粪便隐血，严重者出现便血现象；在血像上表现为白细胞和中性粒细胞升高的炎症表征。由表3可知，实施例1 和2制得的红藻蛋白活性肽可缓解IBD小鼠炎症，如抑制IBD导致的结肠缩短和出血，降低血液中白细胞和中性粒细胞数量，其效果略优于阳性药物对照组，远优于对比例1-3。相对空白对照组小鼠，对比例1-3实验组炎性表征略有改善，但其效果较为有限，且远低于阳性药物组和实施例1和2实验组；同时，对比例3略好于对比例1和2。
在分子表征方面，实施例1和2所制的红藻蛋白活性肽显著的抑制了IBD导致的炎症因子IL-6升高，并调节免疫因子TNF-α升高；提高免疫球蛋白sIgA分泌水平改善粘膜免疫屏障，防止病原体入侵机体；并通过提升紧密连接蛋白Occludin和zo1的含量重塑肠上皮屏障。实施例1和2所制的红藻蛋白活性肽对上述分子表征效果显著优于阳性药物、对比例1-3实验组。对比例1-3实验组分子表征效果相对空白组有所改善，但显著低于阳性药物组；同时，对比例3略好于对比例1和2。上述结果表明本发明红藻蛋白活性肽可从肠炎表征、血液炎症表征、细胞因子、粘膜免疫屏障和肠上皮屏障等多个方面发挥抗肠炎作用，具有良好的抗炎效果；同时，也表现出良好的免疫调节效果，以辅助缓解炎症。
综上所述，本发明红藻蛋白活性肽可以促进双歧杆菌、乳杆菌和肠道内益生菌等益生菌的增殖，抑制肠道有害菌生长；亦具有良好的抑制肠道炎症和免疫调节作用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种红藻蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)预处理：将干燥后的红藻用粉碎机粉碎，过10～80目筛，与水按重量体积比1:15～50比例充分混匀，复水一定时间；新鲜红藻与水按重量体积比1:1～30比例混合；用胶体磨匀浆，得红藻浆液；
(2)冻融提取：将步骤(1)中所得红藻浆液于-15～-80℃下完全冷结，在2℃～室温下溶解，反复冻融3次，然后离心取上清液，得红藻蛋白粗提液；
(3)超滤除杂：将步骤(2)中得到的红藻蛋白粗提液进行超滤，除去小分子杂质，得红藻蛋白纯化浓缩液；
(4)酶解：将步骤(3)所得到的红藻蛋白纯化浓缩液调节pH至6.0～7.5，在40～55℃下，加入中性蛋白酶，酶解2～5h，得红藻蛋白酶解液；
(5)膜过滤纯化：将步骤(4)中所得红藻蛋白酶解液离心后，超滤纯化，收集滤过液，得红藻蛋白活性肽纯化液；
(6)膜过滤浓缩：将步骤(5)中所得红藻蛋白活性肽纯化液进行超滤精制并浓缩，得红藻蛋白活性肽浓缩液；
(7)干燥：将步骤(5)中所得浓缩液冷冻干燥得到红藻蛋白活性肽粉末。
2.根据权利要求1所述的一种红藻蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中冻结温度为-20℃；融化温度为4～10℃。
3.根据权利要求1所述的一种红藻蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中超滤除杂所用超滤膜截留分子量为5～20kDa。
4.根据权利要求1所述的一种红藻蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中酶解过程加入中性蛋白酶用量为红藻重量的1000～30000U/g。
5.根据权利要求1所述的一种红藻蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，膜过滤纯化所用超滤膜截留分子量为5～10kDa。
6.根据权利要求1所述的一种红藻蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，膜过滤浓缩所用超滤膜截留分子量为100～200Da。
7.根据权利要求1所述的一种红藻蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，所述藻为紫菜、江蓠和龙须菜中的至少一种。
8.一种如权利要求1-7任一项权利要求所述的制备方法制得的红藻蛋白活性肽，其特征在于，红藻蛋白活性肽分子量在300Da～1500Da之间。
9.一种如权利要求8所述的红藻蛋白活性肽在制备促进益生菌增殖、抗肠炎的药物、特殊医学用途配方食品、特殊营养配方食品、保健食品、食品或食品添加剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述益生菌包括乳杆菌、双歧杆菌。
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