CN108208848A - 红藻蛋白多肽复配物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了红藻蛋白多肽复配物的制备方法,包括:提取红藻蛋白、制备红藻蛋白多肽、制备螯合钙、制备复配物,将红藻泥经冻融、超声破碎、硫酸铵沉淀、透析后制得红藻蛋白,红藻蛋白经中性蛋白酶酶解制得红藻蛋白多肽,将红藻蛋白多肽分别与钙盐、亚铁盐复配后混合得红藻蛋白多肽复配物。有益效果为:红藻蛋白多肽复配物的螯合率较高,易于被机体吸收,红藻蛋白多肽螯合亚铁避免了无机铁盐的缺点;红藻蛋白多肽螯合钙可以释放出钙离子被细胞利用,并可促进亚铁离子等其他金属离子的吸收,同时红藻蛋白多肽可以补充机体所需氨基酸,降低血压、血脂,具有较好的保健功效,是一种高效的红藻蛋白多肽复配物。
Description
技术领域
本发明涉及红藻多肽复配物的制备领域,尤其是涉及红藻蛋白多肽复配物的制备方法。
技术背景
红藻绝大部分海生,见于热带和亚热带海岸附近,常附著于其他植物。叶状体有丝状、分枝状、羽状或片状。细胞间连以纤细的原生质丝。除叶绿素外,尚含藻红素和藻蓝素,故常呈红色或蓝色。红藻的生殖细胞不能运动。雌性器官称果孢,由单核区和受精丝构成。不动精子在精子囊中单生。重要的食用红藻(如紫菜、掌状红皮藻)煮熟后仍保持其色泽及胶体性质。工业上,角叉菜属(Chondrus)红藻作为明胶的代用品用于布丁、牙膏、冰淇淋及保藏食品中。珊瑚藻属(Corallina)的某些种在形成珊瑚礁与珊瑚岛的过程中起重要作用。主要由江蓠属(Gracilaria)和石花菜属(Gelidium)红藻制备的琼脂是细菌和真菌培养基的重要成分。红藻门的经济价值很高。在红藻类中,紫菜是一种食用藻类,它含有丰富的蛋白质,不仅营养丰富,而且味道鲜美。此外石花菜(Gelidium amansii)、海萝(Gloiopeltisfurcata)等均可食用。鹧鸪菜(Caloglossa leprieurii)和海人草(Digenea simples)是常用的小儿驱虫药。从石花菜属、江篱属(Gracilaria)、麒麟菜属(Eucheuma)植物中提取的琼胶(agar),被应用在医药工业和纺织工业上,并广泛作为培养基。
发明内容
本发明的目的在于提供红藻蛋白多肽复配物的制备方法,本制备方法简单易行,未添加任何有害有机物,红藻蛋白多肽复配物的螯合率较高,易于机体吸收。
本发明针对背景技术中提到的问题,采取的技术方案为:红藻蛋白多肽复配物的制备方法,包括:提取红藻蛋白、制备红藻蛋白多肽、制备螯合钙、制备复配物,具体包括以下步骤:
提取红藻蛋白:将红藻泥溶于浓度为1-2mmol/L、pH为7.0-7.2的PBS缓冲液中,摇匀后置于-10~-20℃冷冻,30-60分钟后以14-18℃解冻,反复冻融2-3次,在冰浴条件下超声波破碎处理30-45分钟,间隙时间1-2s,超声时间2-4s;取破碎液在2-4℃、10000-12000r/min条件下离心30-35分钟收集上清液,加入硫酸铵达到28%的饱和度,搅拌30-45分钟,0-2℃静置过夜后离心收集上清液,加入硫酸铵达到55%的饱和度,0-2℃静置过夜后离心收集沉淀;将沉淀用浓度为0.01-0.02mol/L、pH为7.0-7.4的PBS缓冲液溶解后装入截留量为8-14 ku的透析袋透析去盐,再次离心,收集上清液,真空冷冻干燥成红藻蛋白干粉;以冻融配合超声波破碎法破碎红藻细胞,不会对细胞内容物造成破坏,而且又可以较为彻底的粉碎细胞,析出细胞内的蛋白质,提取方法简单易行,不添加有机试剂;
制备红藻蛋白多肽:将粗蛋白粉末按料液比1:10-12溶解于蒸馏水中,加入粗蛋白粉末5000-5600u/g的中性蛋白酶,在45-47℃、pH6.6-6.8的条件下水解30-45分钟,在酶解过程的中间阶段加入中性蛋白酶重量12-18‰的(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛;酶解完成后高温灭酶,经4000-4500r/min、2-4℃离心30-45分钟,取上清液低温干燥得红藻蛋白多肽;(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于蛋白酶的金属原子活性中心,降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒,增大酶与底物之间的反应活性,从而大大提高蛋白酶的酶解活性,加速酶解;红藻蛋白多肽富含红藻多肽和游离氨基酸,具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降血压、保护基因组DNA和提高机体免疫力等多重功效,具有较好的医疗保健效果;
制备螯合钙:将红藻蛋白多肽复溶成20-25%的肽液,调整pH为8.2-8.5,按肽钙质量比1:2.5-3.5加入无水氯化钙,再加入红藻蛋白多肽质量5-6‰的维生素C,震荡混匀后,在23-25℃恒温螯合,螯合45-60分钟后,加入溶液体积6-7倍的无水乙醇,静置沉淀3-5小时后,在2-4℃、6000-6500r/min条件下离心30-45分钟,取下层沉淀物冻干得红藻蛋白多肽螯合钙粉;谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸对螯合的贡献最大,红藻蛋白多肽螯合钙以Ca-多肽的形式进入细胞,然后在细胞中主动分裂,释放出Ca2+便被细胞利用,从而促进金属离子吸收,是一种优质的补钙剂,同时红藻蛋白多肽也可以增强机体体质、降低血压血脂;
制备复配物:将红藻蛋白多肽复溶成10-12%的肽液,调节pH值至7.2-7.5,取80-100份肽液,加入120-150份1.0-1.2mol/L的氯化亚铁溶液,再加入3-4mg的维生素C,在30-33℃温度下震荡合成20-30分钟,于2-4℃、6000-7000r/min条件下离心浓缩20-45分钟,弃沉淀,上清液低温干燥后即得红藻蛋白多肽亚铁螯合粉,将红藻蛋白多肽螯合钙粉与红藻蛋白多肽亚铁螯合粉按照1:2-3的比例混合即得红藻蛋白多肽复配物;红藻蛋白多肽亚铁螯合物易于被机体吸收,避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点,红藻蛋白多肽复配物有助于钙铁的吸收,同时红藻蛋白多肽可以补充机体所需氨基酸,降低血压、血脂,具有较好的保健功效,是一种高效的红藻蛋白多肽复配物。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
1)(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于蛋白酶的金属原子活性中心,降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒,增大酶与底物之间的反应活性,从而大大提高蛋白酶的酶解活性,加速酶解;红藻蛋白多肽富含红藻多肽和游离氨基酸,具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降血压、保护基因组DNA和提高机体免疫力等多重功效,具有较好的医疗保健效果;
2)红藻蛋白多肽复配物的螯合率较高,易于被机体吸收,红藻蛋白多肽螯合亚铁避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点;红藻蛋白多肽螯合钙以Ca-多肽的形式进入细胞,然后在细胞中主动分裂,释放出钙离子可以被细胞利用,并可促进亚铁离子等其他金属离子吸收,同时红藻蛋白多肽可以补充机体所需氨基酸,降低血压、血脂,具有较好的保健功效,是一种高效的红藻蛋白多肽复配物。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明:
实施例1:
红藻蛋白多肽复配物的制备方法,包括以下步骤:
1)将红藻泥溶于浓度为1mmol/L、pH为7.0的PBS缓冲液中,摇匀后置于-10℃冷冻,30分钟后以14℃解冻,反复冻融2次,在冰浴条件下超声波破碎处理30分钟,间隙时间1s,超声时间2s;取破碎液在2℃、10000r/min条件下离心30分钟收集上清液,加入硫酸铵达到28%的饱和度,搅拌30分钟,0℃静置过夜后离心收集上清液,加入硫酸铵达到55%的饱和度,0℃静置过夜后离心收集沉淀;将沉淀用浓度为0.01mol/L、pH为7.0的PBS缓冲液溶解后装入截留量为8-14 ku的透析袋透析去盐,再次离心,收集上清液,真空冷冻干燥成红藻蛋白干粉;2)将粗蛋白粉末按料液比1:10溶解于蒸馏水中,加入粗蛋白粉末5000u/g的中性蛋白酶,在45℃、pH6.6的条件下水解30分钟,在酶解过程的中间阶段加入中性蛋白酶重量12‰的(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛;酶解完成后高温灭酶,经4000r/min、2℃离心30分钟,取上清液低温干燥得红藻蛋白多肽;3)将红藻蛋白多肽复溶成20%的肽液,调整pH为8.2,按肽钙质量比1:2.5加入无水氯化钙,再加入红藻蛋白多肽质量5‰的维生素C,震荡混匀后,在23℃恒温螯合,螯合45分钟后,加入溶液体积6倍的无水乙醇,静置沉淀3小时后,在2℃、6000r/min条件下离心30分钟,取下层沉淀物冻干得红藻蛋白多肽螯合钙粉;4)将红藻蛋白多肽复溶成10%的肽液,调节pH值至7.2,取80份肽液,加入120份1.0mol/L的氯化亚铁溶液,再加入3mg的维生素C,在30℃温度下震荡合成20分钟,于2℃、6000r/min条件下离心浓缩20分钟,弃沉淀,上清液低温干燥后即得红藻蛋白多肽亚铁螯合粉,将红藻蛋白多肽螯合钙粉与红藻蛋白多肽亚铁螯合粉按照1:2的比例混合即得红藻蛋白多肽复配物。
实施例2:
红藻蛋白多肽复配物的制备方法,包括以下步骤:
1)提取红藻蛋白:将红藻泥溶于浓度为2mmol/L、pH为7.2的PBS缓冲液中,摇匀后置于-20℃冷冻,60分钟后以18℃解冻,反复冻融3次,在冰浴条件下超声波破碎处理45分钟,间隙时间2s,超声时间4s;取破碎液在4℃、12000r/min条件下离心35分钟收集上清液,加入硫酸铵达到28%的饱和度,搅拌45分钟,2℃静置过夜后离心收集上清液,加入硫酸铵达到55%的饱和度,2℃静置过夜后离心收集沉淀;将沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为7.4的PBS缓冲液溶解后装入截留量为14 ku的透析袋透析去盐,再次离心,收集上清液,真空冷冻干燥成红藻蛋白干粉;以冻融配合超声波破碎法破碎红藻细胞,不会对细胞内容物造成破坏,而且又可以较为彻底的粉碎细胞,析出细胞内的蛋白质,提取方法简单易行,不添加有机试剂;
2)制备红藻蛋白多肽:将粗蛋白粉末按料液比1:12溶解于蒸馏水中,加入粗蛋白粉末5600u/g的中性蛋白酶,在47℃、pH6.8的条件下水解45分钟,在酶解过程的中间阶段加入中性蛋白酶重量18‰的(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛;酶解完成后高温灭酶,经4500r/min、4℃离心45分钟,取上清液低温干燥得红藻蛋白多肽;(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于蛋白酶的金属原子活性中心,降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒,增大酶与底物之间的反应活性,从而大大提高蛋白酶的酶解活性,加速酶解;红藻蛋白多肽富含红藻多肽和游离氨基酸,具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降血压、保护基因组DNA和提高机体免疫力等多重功效,具有较好的医疗保健效果;
3)制备螯合钙:将红藻蛋白多肽复溶成25%的肽液,调整pH为8.5,按肽钙质量比1:3.5加入无水氯化钙,再加入红藻蛋白多肽质量6‰的维生素C,震荡混匀后,在25℃恒温螯合,螯合60分钟后,加入溶液体积7倍的无水乙醇,静置沉淀5小时后,在4℃、6500r/min条件下离心45分钟,取下层沉淀物冻干得红藻蛋白多肽螯合钙粉;谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸对螯合的贡献最大,红藻蛋白多肽螯合钙以Ca-多肽的形式进入细胞,然后在细胞中主动分裂,释放出Ca2+便被细胞利用,从而促进金属离子吸收,是一种优质的补钙剂,同时红藻蛋白多肽也可以增强机体体质、降低血压血脂;
4)制备复配物:将红藻蛋白多肽复溶成12%的肽液,调节pH值至7.5,取100份肽液,加入150份1.2mol/L的氯化亚铁溶液,再加入4mg的维生素C,在33℃温度下震荡合成30分钟,于4℃、7000r/min条件下离心浓缩45分钟,弃沉淀,上清液低温干燥后即得红藻蛋白多肽亚铁螯合粉,将红藻蛋白多肽螯合钙粉与红藻蛋白多肽亚铁螯合粉按照1:3的比例混合即得红藻蛋白多肽复配物;红藻蛋白多肽亚铁螯合物易于被机体吸收,避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点,红藻蛋白多肽复配物有助于钙铁的吸收,同时红藻蛋白多肽可以补充机体所需氨基酸,降低血压、血脂,具有较好的保健功效,是一种高效的红藻蛋白多肽复配物。
实施例3:
红藻蛋白多肽复配物的制备方法,包括:提取红藻蛋白、制备红藻蛋白多肽、制备螯合钙、制备复配物,具体包括以下步骤:
提取红藻蛋白:将红藻泥溶于浓度为1.8mmol/L、pH为7.0的PBS缓冲液中,摇匀后置于-18℃冷冻,45分钟后以15℃解冻,反复冻融2次,在冰浴条件下超声波破碎处理30分钟,间隙时间2s,超声时间3s;取破碎液在3℃、10500r/min条件下离心32分钟收集上清液,加入硫酸铵达到28%的饱和度,搅拌35分钟,2℃静置过夜后离心收集上清液,加入硫酸铵达到55%的饱和度,2℃静置过夜后离心收集沉淀;将沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为7.2的PBS缓冲液溶解后装入截留量为10 ku的透析袋透析去盐,再次离心,收集上清液,真空冷冻干燥成红藻蛋白干粉;以冻融配合超声波破碎法破碎红藻细胞,不会对细胞内容物造成破坏,而且又可以较为彻底的粉碎细胞,析出细胞内的蛋白质,提取方法简单易行,不添加有机试剂;
制备红藻蛋白多肽:将粗蛋白粉末按料液比1:10溶解于蒸馏水中,加入粗蛋白粉末5500u/g的中性蛋白酶,在46℃、pH6.7的条件下水解35分钟,在酶解过程的中间阶段加入中性蛋白酶重量15‰的(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛;酶解完成后高温灭酶,经4200r/min、2-4℃离心30-45分钟,取上清液低温干燥得红藻蛋白多肽;(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于蛋白酶的金属原子活性中心,降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒,增大酶与底物之间的反应活性,从而大大提高蛋白酶的酶解活性,加速酶解;红藻蛋白多肽富含红藻多肽和游离氨基酸,具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降血压、保护基因组DNA和提高机体免疫力等多重功效,具有较好的医疗保健效果;
制备螯合钙:将红藻蛋白多肽复溶成24%的肽液,调整pH为8.4,按肽钙质量比1:3.0加入无水氯化钙,再加入红藻蛋白多肽质量5‰的维生素C,震荡混匀后,在24℃恒温螯合,螯合45分钟后,加入溶液体积6倍的无水乙醇,静置沉淀4小时后,在3℃、6000r/min条件下离心32分钟,取下层沉淀物冻干得红藻蛋白多肽螯合钙粉;谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸对螯合的贡献最大,红藻蛋白多肽螯合钙以Ca-多肽的形式进入细胞,然后在细胞中主动分裂,释放出Ca2+便被细胞利用,从而促进金属离子吸收,是一种优质的补钙剂,同时红藻蛋白多肽也可以增强机体体质、降低血压血脂;
制备复配物:将红藻蛋白多肽复溶成10%的肽液,调节pH值至7.4,取90份肽液,加入130份1.1mol/L的氯化亚铁溶液,再加入3mg的维生素C,在32℃温度下震荡合成25分钟,于3℃、6500r/min条件下离心浓缩35分钟,弃沉淀,上清液低温干燥后即得红藻蛋白多肽亚铁螯合粉,将红藻蛋白多肽螯合钙粉与红藻蛋白多肽亚铁螯合粉按照1:2.5的比例混合即得红藻蛋白多肽复配物;红藻蛋白多肽亚铁螯合物易于被机体吸收,避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点,红藻蛋白多肽复配物有助于钙铁的吸收,同时红藻蛋白多肽可以补充机体所需氨基酸,降低血压、血脂,具有较好的保健功效,是一种高效的红藻蛋白多肽复配物。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知,在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明,应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.红藻蛋白多肽复配物的制备方法,包括:提取红藻蛋白、制备红藻蛋白多肽、制备螯合钙、制备复配物,其特征在于:所述制备红藻蛋白多肽步骤为:将粗蛋白粉末按料液比1:10-12溶解于蒸馏水中,加入粗蛋白粉末5000-5600u/g的中性蛋白酶酶解,在酶解过程的中间阶段加入(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛;酶解完成后高温灭酶,经4000-4500r/min、2-4℃离心30-45分钟,取上清液低温干燥得红藻蛋白多肽。
2.根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽复配物的制备方法,其特征在于:所述制备红藻蛋白多肽步骤中,酶解温度为45-47℃,酶解pH6.6-6.8,酶解时间为30-45分钟。
3.根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽复配物的制备方法,其特征在于:所述制备红藻蛋白多肽步骤中,(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛的添加量为中性蛋白酶重量的12-18‰。
4.根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽复配物的制备方法,其特征在于:所述提取红藻蛋白步骤为:将红藻泥溶于浓度为1-2mmol/L、pH为7.0-7.2的PBS缓冲液中,摇匀后置于-10~-20℃冷冻,30-60分钟后以14-18℃解冻,反复冻融2-3次,在冰浴条件下超声波破碎处理30-45分钟,间隙时间1-2s,超声时间2-4s;取破碎液在2-4℃、10000-12000r/min条件下离心30-35分钟收集上清液进行硫酸铵沉淀;将沉淀用浓度为0.01-0.02mol/L、pH为7.0-7.4的PBS缓冲液溶解后装入截留量为8-14 ku的透析袋透析去盐,再次离心,收集上清液,真空冷冻干燥成红藻蛋白干粉。
5.根据权利要求4所述的红藻蛋白多肽复配物的制备方法,其特征在于:所述提取红藻蛋白步骤中,硫酸铵沉淀的操作步骤为:在上清液加入硫酸铵达到28%的饱和度,搅拌30-45分钟,0-2℃静置过夜,离心后收集上清液加入硫酸铵达到55%的饱和度,0-2℃静置过夜后离心收集沉淀。
6.根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽复配物的制备方法,其特征在于:所述制备螯合钙步骤为:将红藻蛋白多肽复溶成20-25%的肽液,调整pH为8.2-8.5,加入无水氯化钙、维生素C,震荡混匀后,在23-25℃恒温螯合,螯合45-60分钟后,加入溶液体积6-7倍的无水乙醇,静置沉淀3-5小时后,在2-4℃、6000-6500r/min条件下离心30-45分钟,取下层沉淀物冻干得红藻蛋白多肽螯合钙粉。
7.根据权利要求6所述的红藻蛋白多肽复配物的制备方法,其特征在于:所述制备螯合钙步骤中,无水氯化钙的添加量为红藻蛋白多肽质量的2-3倍,维生素C的添加量为红藻蛋白多肽质量的5-6‰。
8.根据权利要求1所述的红藻蛋白多肽复配物的制备方法,其特征在于:所述制备复配物步骤为:将红藻蛋白多肽复溶成10-12%的肽液,调节pH值至7.2-7.5,取80-100份肽液,加入氯化亚铁溶液、维生素C,在30-33℃温度下震荡合成20-30分钟,于2-4℃、6000-7000r/min条件下离心浓缩20-45分钟,弃沉淀,上清液低温干燥后即得红藻蛋白多肽亚铁螯合粉,将红藻蛋白多肽螯合钙粉与红藻蛋白多肽亚铁螯合粉按照1:2-3的比例混合即得红藻蛋白多肽复配物。
9.根据权利要求8所述的红藻蛋白多肽复配物的制备方法,其特征在于:所述制备复配物步骤中氯化亚铁溶液的浓度为1.0-1.2mol/L、添加量为120-150份,维生素C的添加量为3-4mg。
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CN114958948A (zh) * | 2022-04-15 | 2022-08-30 | 中国海洋大学 | 一种红藻蛋白活性肽及其制备方法和应用 |
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