CN113693237A - 一种干预乳糖不耐腹泻的新型天然固体干预剂及制备方法和应用 - Google Patents

一种干预乳糖不耐腹泻的新型天然固体干预剂及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干预乳糖不耐腹泻的新型天然固体干预剂及制备方法和应用，固体干预剂由一定比例的莲原花青素和羧甲基茯苓多糖组成，步骤是：A、按一定比例取莲原花青素和羧甲基茯苓多糖；B、将莲原花青素和羧甲基茯苓多糖置于混合容器中，混合均匀，获得组合物；C、将组合物缓慢加入总质量1‑10倍的蒸馏水并均匀混合，避光静置，获得复合物；D、将获得的混合物进行低温减压干燥，获得一种固体干预剂。该干预剂能够通过激活肠道乳糖酶活性从而加强对膳食乳糖的分解代谢能力，同时能够提升肠道健康水平、改善肠道菌群，提供良好的消化环境，有效发挥干预乳糖不耐腹泻及相关症状的作用。

Description

一种干预乳糖不耐腹泻的新型天然固体干预剂及制备方法和 应用
技术领域
本发明属于功能性食品技术领域，具体涉及一种干预乳糖不耐腹泻的新型天然固体干预剂，同时还涉及一种针对乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂的制备方法，还涉及一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂在保健食品和食品添加剂中的用途。
背景技术
乳糖不耐是一种长期困扰部分患者尤其是新生儿与婴幼儿的消化不良疾病。数据统计表明，90％的亚洲人经历过乳糖不耐，3-13岁中国儿童乳糖不耐的发生率为87％。由于肠道乳糖酶活性下降，未被消化的乳糖进入大肠后在肠道微生物的发酵作用下，产生氢气、二氧化碳、甲烷等气体，以及短链脂肪酸如丁酸、醋酸、丙酸、甲酸和乳酸等代谢产物，使得肠道渗透压升高，肠道内流体和电解质增多，最终引发腹泻、腹胀、腹痛等症状。此外，乳糖不耐是一种连锁反应，如不及时介入干预，会导致继发性乳糖不耐，即炎症、氧化应激、以及肠道屏障和肠粘膜被破坏等，导致乳糖酶活性的进一步下降、小肠绒毛萎缩、肠道屏障相关蛋白及水、离子通道蛋白表达异常，最终使婴幼儿对营养的吸收、生长发育和机体健康造成极大的危害。
目前，对于乳糖不耐主要的解决方法是避免乳糖的摄入、补充外源乳糖酶以及使用抗生素等。但这些方法都只能暂时缓解乳糖不耐症状，尚不能通过提高自身乳糖酶的活性达到根本的治疗效果。乳糖由半乳糖和葡萄糖构成，是人类和哺乳动物乳汁中所特有的一种二糖。乳糖对于幼年个体的生长发育具有极其重要的意义，其水解后的葡萄糖是机体代谢的重要能量来源，而半乳糖则是婴幼儿脑部发育所必需的结构糖，因此不能将乳糖或乳制品轻易的从婴幼儿的食谱中排除。乳糖酶(β-半乳糖苷酶，EC 3.2.1.108)是一种重要的二糖酶，主要存在于哺乳动物小肠粘膜刷状缘的绒毛中，能够将乳糖分解为可被肠道吸收的葡萄糖和半乳糖，大多数哺乳动物断奶后(3-5岁之间)乳糖酶活性在基因的正常调控下逐渐下降，导致乳糖不耐的发生。因此，乳糖酶以及肠道健康水平(包括肠道氧化应激、炎症、肠道屏障、肠道菌群等)对于机体尤其是婴幼儿代谢乳糖具有重要的意义，是研究乳糖不耐腹泻的重要靶点，但目前却鲜有利用天然产物针对其进行防治。因此，亟需以肠道乳糖酶活性以及肠道消化环境健康为研究重点，开发天然无副作用的乳糖不耐腹泻干预剂。
莲房与茯苓是中国著名的传统药食同源的中药材，其安全性及肠道健康提升效果早已得到公认，其中莲原花青素(Lotus Seedpod Oligomeric Procyanidins,LSPC)在体内外具有较强的肠道健康提高效果，而羧甲基茯苓多糖(Carboxymethyl Pachyman,CMP)在肠道内也能够表现出一定抗氧化、抗炎和提高免疫力等效果，因此能够通过改善肠道消化环境而在一定程度上缓解腹泻症状。在过去的研究中，莲原花青素与羧甲基茯苓多糖常被单独运用于各种生物活性及对提升健康的研究和应用中，而尚无二者联合使用时的相关报道。近些年来，已有部分研究表明多酚与多糖的非共价相互作用对复合物生物活性具有积极的影响，复合物具有更好的抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性，一定情况下二者间还会发生协同效应。其中，二者间的非共价相互作用可以通过紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱、核磁共振等手段进行表征。因此，我们在前期得到了莲原花青素与羧甲基茯苓多糖间产生了有利于提高生物活性的协同效应的基础之上，以二者间发生非共价相互作用为前提，提供了一种通过有效激活肠道乳糖酶活性并提高肠道健康水平而抗乳糖不耐腹泻的解决方案。
发明内容
本发明目的是在于提供了一种干预乳糖不耐腹泻的新型天然固体干预剂，该干预剂能够通过激活肠道乳糖酶活性从而加强对膳食乳糖的分解代谢能力，同时能够提升肠道健康水平、改善肠道菌群，提供良好的消化环境，有效干预了乳糖不耐腹泻及相关症状。
本发明的另一个目的是在于提供了一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂的制备方法，方法易行，操作简便，它能够克服现有技术之不足，采用具有较好生物活性的莲原花青素与另一种功能因子羧甲基茯苓多糖通过特殊共混进行非共价相互作用、产生有利于生物活性的协同效应，以肠道乳糖酶、肠道环境的健康水平及肠道菌群为作用靶点，从而对机体尤其是婴幼儿的乳糖不耐腹泻产生较好的干预效果。
本发明还有一个目的是在于提供了一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂在保健食品和食品添加剂中的应用，莲原花青素和羧甲基茯苓多糖作为天然来源的具有较好安全性的功能活性因子，在不同食品介质中均具有较好的适配性，如在液体、固体、粉末状食物中，并且摄入后在体内具有较好的提高乳糖酶活性及肠道抗氧化、抗炎、调节肠道菌群等生物活性，从而起到了干预乳糖不耐腹泻的效果。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，它由以下质量比的原料组成：
原料 质量百分比％
莲原花青素 20－80％
羧甲基茯苓多糖 20－80％。
一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，它由以下质量比的原料组成 (较好范围)：
原料 质量百分比％
莲原花青素 40－80％
羧甲基茯苓多糖 20－60％。
一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，它由以下质量比的原料组成 (最好范围)：
原料 质量百分比％
莲原花青素 50－75％
羧甲基茯苓多糖 25－50％。
一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，它由以下质量比的原料组成 (具体值)：
原料 质量百分比％
莲原花青素 75％
羧甲基茯苓多糖 25％。
该莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂的制备利用了莲原花青素与羧甲基茯苓多糖通过特殊共混所产生的有利于提高生物活性的非共价相互作用，因此当莲原花青素质量占 75％，羧甲基茯苓多糖质量占25％时，二者间具有最为显著的分子间非共价相互作用，也使得此时的固体干预剂相较于其他混合比例时具有更强的乳糖不耐腹泻干预效果。也因如此，为了使得二者间能够产生较好的分子间非共价相互作用从而提高组合物的生物活性，对于固体干预剂中的莲原花青素最关键的是其化学结构中的没食子酰基，能够显著提高与羧甲基茯苓多糖的相互作用强度及生物活性提高效果；而对于羧甲基茯苓多糖而言，其三螺旋空间的空间立体结构、一定范围内的羧甲基取代度(0.20-0.95)均会影响固体干预剂的应用效果。
所述的莲原花青素的制备方法参照本实验的中国授权专利(专利授权号为：CN02115423.6)进行：将新鲜莲房洗净、剪碎后以料液比1:10(m/V)加入70％(v/v)乙醇或纯水，使其在60-80℃下浸提5h。随后，将滤液通过旋转蒸发器回收乙醇(水温45℃)，并将浓缩液过AB-8大孔树脂以10倍体积蒸馏水除去杂质，再以70％(v/v)乙醇洗脱，将洗脱液再次通过旋转蒸发器回收乙醇，浓缩液置于4℃避光环境下沉淀过夜后将上清液抽滤，并以一定体积乙酸乙酯萃取，有机相通过旋转蒸发器(水温40℃)旋蒸至干再以少量蒸馏水溶解，最后进行低温减压干燥，即可得到黄色粉末状的莲原花青素。此外，原花青素单体物质同样具有与羧甲基茯苓多糖非共价相互作用，并协同干预乳糖不耐腹泻的生物功效，单体物质包括但不限于表儿茶素EC、表儿茶素没食子酸酯ECG、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG等。
所述的羧甲基茯苓多糖制备方法在现有技术(专利授权号CN 105348407 A)的基础之上，略微修改进行：新鲜茯苓块经过粉碎、过筛后进行脱脂。经脱脂的茯苓粉于60℃-80℃蒸馏水中浸提两次(1:50，w/v，1h)并离心(4500g/min，10min)以去除水溶性多糖。随后，剩余固体以NaOH水溶液(0.6M)浸提两次(1:50，w/v，8h，4℃)，再利用10％(v/v) 冰醋酸将浸提液pH值调节至6.0，并将得到的胶状沉淀转移至纤维素透析袋(截留分子量为3500g/mol)中以蒸馏水充分脱盐3d后低温(-10～-50℃)减压(0.1pa–5pa)干燥，即可得碱溶性茯苓多糖。并以此为原料进行羧甲基化衍生反应：将3.0g碱溶性茯苓多糖分散于40mL NaOH(20％)和100mL异丙醇的混合溶液中，并在冰浴状态下搅拌至完全溶解。缓慢滴入100mL异丙醇(含有24.0g一氯乙酸)和40mL氢氧化钠(NaOH)20％的混合溶液，并在室温(20－25℃，以下相同)下搅拌3h左右。随后，将反应体系升温至 50℃-60℃并搅拌30min后，再次缓慢滴入100mL异丙醇(含有24.0g一氯乙酸)和40 mL氢氧化钠(NaOH)20％的混合溶液，保持该温度范围50℃-60℃继续搅拌1h。最后，通过冰浴迅速使反应体系冷却至室温，并通过10％(v/v)冰醋酸溶液将反应体系pH值调节至7.0以结束衍生化反应，通过旋转蒸发回收异丙醇。接下来，将羧甲基粗多糖水溶液转移至纤维素透析袋(截留分子量为3500g/mol)中以蒸馏水透析6天，通过旋转蒸发器浓缩后利用DEAE纤维素层析柱脱去蛋白质，最后低温减压干燥即可获得白色泡沫状的羧甲基茯苓多糖。此外，通过不同层析树脂获得的羧甲基茯苓多糖级分同样具有与莲原花青素及单体物质非共价相互作用(其特征之一为非共价相互作用前后，在组合物的紫外-可见光及傅里叶变换红外图谱中不会出现新的吸收峰，同时相互作用前样品的吸收峰会发生吸收波长和峰高的改变)，并协同干预乳糖不耐腹泻的生物功效。
一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂的制备方法，其步骤是：
A、按一定比例取莲原花青素和羧甲基茯苓多糖；
B、将莲原花青素和羧甲基茯苓多糖置于混合容器中，混合均匀，获得组合物；
C、将组合物缓慢加入总质量1-10倍的蒸馏水并均匀混合，在4℃下避光静置28－32 min，获得复合物；
D、将步骤C中获得的复合物进行低温减压干燥(温度控制在-10～-50℃，压力控制在范围0.1pa–5pa)，获得一种淡黄色的干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂。
在上述技术措施步骤中，最为关键的是莲原花青素与羧甲基茯苓多糖均匀混合后在4℃下避光静置28－32min。在此过程中，多糖与原花青素能够充分的进行非共价相互作用，形成一种新型复合物。同时，通过上述步骤的技术措施，主要解决了在乳糖不耐腹泻发病时肠道乳糖酶活性难以得到显著提升这一技术问题和难点，使得干预剂能够更加高效的分解、代谢膳食中的乳糖，降低了乳糖不耐腹泻对机体，尤其是婴幼儿身体健康的损害。与现有技术相比，本发明通过将两种具有不同生物活性偏向的天然活性物质组合起来，利用二者间的非共价相互作用形成新型复合物，使其在肠道乳糖酶活性、肠道健康及改善肠道菌群等方面具有更加全面的乳糖不耐腹泻干预效果。
此种以莲原花青素和羧甲基茯苓多糖为活性成分的天然药物组合物具有良好的协同激活乳糖酶效果和干预乳糖不耐腹泻效果，可作为保健食品和食品添加剂加以应用。
一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂在保健食品中的应用，其步骤是：
A、莲原花青素从莲科植物中提取(专利授权号为：CN 02115423.6)；碱溶性茯苓多糖提取自多孔菌科卧孔菌属Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥真菌核，并在现有技术(专利授权号CN 105348407 A)的基础之上略微修改进行羧甲基化衍生以提高其水溶性和生物活性，无任何毒副作用。
B、所述的莲原花青素及羧甲基茯苓多糖作为保健食品中的主要药性活性成分，利用现代制药手段，可将莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物与固体或液体赋形剂或辅剂(如淀粉、糊精、甘油、木糖醇等)制备成胶囊、微囊、粉剂、片剂、口服液等任意一种药学或保健食品、食品添加剂和膳食补充剂上可接受的剂型，其中赋形剂或辅剂通常占40％-60％，而莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物占30％-50％。所述的保健食品在乳糖不耐腹泻中具有一定的用途。
一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂在食品添加剂中的应用，其步骤是：
A、在幼年个体，尤其是婴幼儿断奶后常接触的乳制品，如奶粉、牛奶、奶片、奶酪等中，加入一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖生物活性组合物(添加量通常为0.1–2.0％)。
B、对幼年个体，尤其是婴幼儿由于摄入过量乳糖而引发的乳糖不耐腹泻具有较显著的干预、防治效果。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
在莲原花青素和羧甲基茯苓多糖间发生了有益于提升生物活性的非共价相互作用的基础之上，该新型天然组合物不仅可以显著协同激活肠道乳糖酶活性，提高肠道健康水平，还能够改善肠道菌群结构，增加结肠乳酸菌和双歧杆菌的含量，从而具有良好的乳糖不耐腹泻干预效果。
附图说明
图1为一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂在体外对乳糖酶活性的激活效果示意图。
图2为一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂在体内对乳糖不耐腹泻小鼠腹泻率的干预效果及肠道乳糖酶活性的激活效果示意图。
图3一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂对乳糖不耐小鼠肠道氧化应激的干预效果示意图。
图4一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂对乳糖不耐小鼠肠道炎症的干预效果示意图。
图5为一种莲原花青素与羧甲基茯苓多糖间的非共价相互作用示意图(以紫外-可见光谱图A和傅里叶变换红外光谱图B为例，该图表明与单独莲原花青素的紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱图相比，莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物的紫外-可见光谱与傅里叶变换红外光谱图并未出现新的吸收峰，同时原有吸收峰的波长及峰高发生了明显变化，说明二者间通过非共价相互作用形成了一种新型的复合物)。
具体实施方式
下面通过体外乳糖酶活性实验以及乳糖不耐腹泻的动物模型实验说明所描述的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂在乳糖不耐腹泻中起到的干预作用和效果，探讨其作用机制，说明其在保健食品和食品添加剂中的新用途。
实施例1：
一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，它由以下质量比的原料组成：
原料 质量比％
莲原花青素 78％
羧甲基茯苓多糖 22％。
实验材料及组合物制备方法：
所述的一种莲原花青素的制备方法，参照中国授权专利(专利授权号为：CN02115423.6) 进行：将新鲜莲房洗净、剪碎后以料液比1:10(m/V)加入70％(v/v)乙醇，使其在60℃下浸提5h或在热水(60-100℃)中浸泡1-3h。随后，将滤液通过旋转蒸发器回收乙醇(水温45℃)或浓缩到原体积的1/10，并将浓缩液过AB-8大孔树脂以10倍体积蒸馏水除去难吸附的杂质，再以70％(v/v)乙醇洗脱，将洗脱液再次通过旋转蒸发器于40℃下进行真空浓缩以回收乙醇，浓缩液置于4℃避光环境下沉淀过夜后将上清液抽滤，并以一定体积乙酸乙酯萃取，有机相通过通过旋转蒸发器(水温40℃)旋蒸至干再以少量蒸馏水溶解，最后进行低温减压干燥，即可得到黄色粉末状的莲原花青素。
所述的一种羧甲基茯苓多糖的制备方法，采用以下步骤：新鲜茯苓块，经过粉碎、过筛后在现有技术(专利授权号CN 105348407 A)的基础之上，略微修改进行。经脱脂的茯苓粉于80℃蒸馏水中浸提两次(1:50，w/v，1h)并离心(4500g/min，10min)以去除水溶性多糖。随后，剩余固体以氢氧化钠(NaOH)水溶液(0.6M)浸提两次(1:50，w/v，8h， 4℃)，再利用10％(v/v)冰醋酸将浸提液pH值调节至6.0，并将得到的胶状沉淀转移至纤维素透析袋(截留分子量为3500g/mol)中以蒸馏水充分脱盐3d后低温减压(温度范围 -10～-50℃，压力范围0.1pa–5pa)干燥，即可得碱溶性茯苓多糖。并以此为原料进行羧甲基化衍生反应：将3.0g碱溶性茯苓多糖分散于40mL氢氧化钠(NaOH)20％和100mL异丙醇的混合溶液中，并在冰浴状态下搅拌至完全溶解。缓慢滴入100mL异丙醇(含有24.0 g一氯乙酸)和40mL氢氧化钠(NaOH)20％的混合溶液，并在室温下搅拌3h。随后，将反应体系升温至60℃并搅拌30min后，再次缓慢滴入100mL异丙醇(含有24.0g一氯乙酸)和40mL氢氧化钠(NaOH)20％的混合溶液，并保持60℃继续搅拌1h。最后，通过冰浴迅速使反应体系冷却至室温(20－25℃)，并通过10％(v/v)冰醋酸溶液将反应体系pH值调节至7.0以结束衍生化反应，通过旋转蒸发回收异丙醇。接下来，将羧甲基粗多糖水溶液转移至纤维素透析袋(截留分子量为3500g/mol)中以蒸馏水透析6天，通过旋转蒸发器浓缩后利用DEAE纤维素层析柱脱去蛋白质。随后，将多糖溶液在4℃下以4倍体积的95％乙醇沉淀过夜，收集沉淀用无水乙醇、乙醚和丙酮反复洗涤，最终低温减压干燥：温度控制在-10或-20或-30或-40或-50℃，压力控制在0.1或0.5或1或2或3或4或5pa，获得白色泡沫状的羧甲基茯苓多糖。
一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂的制备方法，其步骤是：
A、按一定比例取莲原花青素和羧甲基茯苓多糖；
B、将莲原花青素和羧甲基茯苓多糖置于混合容器中，混合均匀，获得组合物；
C、将组合物缓慢加入总质量1-10倍的蒸馏水并均匀混合，在4℃下避光静置28-32min，获得复合物；
D、将步骤C中获得的复合物进行低温减压干燥(温度控制在范围-10～-50℃，压力控制在范围0.1pa–5pa)，获得一种淡黄色的干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂。
通过体外测试及动物模型共同证实该组合物对由高乳糖膳食所引发的乳糖不耐腹泻具有显著的干预效果。本发明的特点是在莲原花青素与羧甲基茯苓多糖间非共价相互作用的影响下，天然组合物固体干预剂具有激活肠道乳糖酶活性、提高小肠健康水平和结肠乳酸菌、双歧杆菌含量等多重效果，从而有效防治了乳糖不耐腹泻的发生和症状。
实施例2－6：
一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，它由以下质量百分比的原料组成：
原料及实施例 2 3 4 5 6
莲原花青素 20 30 50 60 75
羧甲基茯苓多糖 80 70 50 40 25
总计 100 100 100 100 100
其制备步骤与实施例1相同。
实施例7：
一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂在保健食品中的应用，其步骤是：
A、莲原花青素从莲科植物中提取(专利授权号为：CN 02115423.6)；碱溶性茯苓多糖提取自多孔菌科卧孔菌属Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥真菌核，并在现有技术(专利授权号CN 105348407 A)的基础之上略微修改进行羧甲基化衍生以提高其水溶性和生物活性，无任何毒副作用。
B、所述的莲原花青素及羧甲基茯苓多糖作为保健食品中的主要药性活性成分，利用现代制药手段，可将莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物与某种固或液体赋形剂或辅剂(如淀粉、糊精、甘油、木糖醇等)制备成胶囊、微囊、粉剂、片剂、口服液等任意一种药学或保健食品、食品添加剂和膳食补充剂上可接受的剂型，其中赋形剂或辅剂如淀粉、糊精、甘油等，通常占40％或45％或50％或55％或60％，而莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物占30％或35或40或45或50％。所述的保健食品在乳糖不耐腹泻中具有一定的用途。
实施例8：
一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂在食品添加剂中的应用，其步骤是：
A、在幼年个体，尤其是婴幼儿断奶后常接触的乳制品，如奶粉、牛奶、奶片、奶酪等中，加入一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖生物活性组合物(添加量通常为0.1–2.0％)。
B、对幼年个体，尤其是婴幼儿由于摄入过量乳糖而引发的乳糖不耐腹泻具有较显著的干预、防治效果。
实施例9：莲原花青素-羧甲基茯苓多糖生物活性组合物体外对乳糖酶的激活作用
1.实验材料
1.1样品：根据上述描述所制备的莲原花青素、羧甲基茯苓多糖及莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物。
1.2实验试剂：
乳糖酶、2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)等均购自sigma公司。
1.3主要仪器：
紫外分光光度计，恒温水浴锅。
2实验方法：
首先使用PBS磷酸盐缓冲液(0.1M，pH＝7.2)分别配置0.02mg/mL乳糖酶和1.5mmol/L ONPG(2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)溶液。以2mL试管为反应容器，依次加入依次加入700μL PBS溶液、75μL乳糖酶溶液、75μL样品PBS溶液(莲原花青素、羧甲基茯苓多糖及莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物)和75μL ONPG溶液，混合均匀后立即置于37℃下避光水浴15min，其中空白对照组是用等体积PBS溶液代替样品溶液。加入75μL碳酸钠溶液(2mol/L，由PBS溶液配制)以终止反应，测定各组溶液在420nm处的吸光值，按下述公式计算酶活抑制率和IC50值(达到50％抑制作用所需的样品浓度)：
Figure 1
其中：A0值空白对照组的吸光值，而As代表样品组的吸光值。
3数据处理：
所有实验均重复三次，所得数据均由SPSS 18.0进行统计处理，以平均值±标准差表示。
4实验结果：
羧甲基茯苓多糖在实验浓度范围能够激活乳糖酶，提高其水解活性，其中2.0mg/mL羧甲基茯苓多糖对乳糖酶活的促进率为9.85％(图1)，而莲原花青素在体外能够显著抑制乳糖酶的水解活性，IC50值为0.35mg/mL，并具有剂量-效应关系(图1)。而对于莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物而言(图1)，结果表明，与多糖等质量浓度复配后，莲原花青素抑制乳糖酶活性的能力得到了削弱，表现为IC50值最多由0.35提高至0.87mg/mL以上。此外，莲原花青素与羧甲基茯苓多糖在低浓度下表现出对乳糖酶的协同激活效应，逆转了原花青素在高浓度下的不良抑制作用，增加了酶的水解能力。例如，0.1mg/mL莲原花青素对乳糖酶的抑制率为7.12％，而0.1mg/mL羧甲基茯苓多糖对乳糖酶活的激活率为0.5％，而同浓度下的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物对乳糖酶活的激活率则升高至5.2％，表明该组合物在体外能够作为激活剂协同促进乳糖酶的酶活，为其干预乳糖不耐腹泻的进一步研究打下基础。
实施例10：莲原花青素-羧甲基茯苓多糖生物活性组合物体内对乳糖不耐腹泻的干预作用
1、实验材料
1.1样品：根据上述描述所制备的莲原花青素、羧甲基茯苓多糖及莲原花青素-羧甲基茯苓多糖组合物。
2、实验方法
50只ICR小鼠自三峡大学实验动物研究中心购回后，给予充足的标准饲料(表1)和蒸馏水以进行适应性饲养一周(1-7d)。随后，根据体重将实验小鼠分为五组，每组10只，并使所有小鼠禁食12h(第7d晚)，以排除标准饲料的干扰。建模开始(第8-14d)，持续给予模型组、莲原花青素组、羧甲基茯苓多糖组和莲原花青素组-羧甲基茯苓多糖组合物组充足的高乳糖饲料(表1)和饮用蒸馏水，而正常对照组的饲料仍为标准饲料。同时，通过灌胃使小鼠每日摄入样品(第8-14d)，其中OD组和NC组给予无菌生理盐水，而莲原花青素和羧甲基茯苓多糖组分别给予150mg/kg BW相应样品溶液，莲原花青素组-羧甲基茯苓多糖组合物组给予300mg/kg BW剂量的样品溶液。早8点以无菌生理盐水配制样品，8 点30分进行灌胃，灌胃量为0.2mL。灌胃后，每只小鼠置于独立的代谢笼中以记录每天的饲料摄入量和体重变化。此外，灌胃后至晚22点之间，每隔2h观察一次小鼠的腹泻情况，通过目测粪便稠度的方式连续7天评估、记录不同组断奶小鼠的腹泻程度，粪便稠度得分为：0＝正常，1＝半固体，2＝半液体和3＝液体，腹泻被定义为连续两天产生得分为2或3的粪便。根据公式计算腹泻率：各组小鼠腹泻发生率(％)＝(腹泻小鼠数×腹泻天数)/(小鼠总数×7天)×100％
表1基础饲料和高乳糖饲料的组成
Figure BDA0003221626790000111
3、数据处理：
所有实验测试均重复三次，所得数据均由SPSS 18.0进行统计处理，以平均值±标准差表示。
4、实验结果：
在7天的观察中，模型组最终的腹泻发生率为71.43％。而对于样品组，单独的莲原花青素组和羧甲基茯苓多糖组小鼠最终的腹泻率分别为11.43％和28.57％，而莲原花青素组- 羧甲基茯苓多糖组合物组小鼠最终的腹泻发生率为0(图2)，因此该天然组合物具有较好的干预断奶小鼠乳糖不耐腹泻的效果。此外，通过对小肠乳糖酶活性的测定，可以发现乳糖不耐腹泻不利于肠道对乳糖酶的分解消化，而在组合物的干预作用下，不仅恢复了肠道对乳糖酶的消化能力，还能够提高其水解活性，意味着该组合物可能通过作用于肠道乳糖酶，激活其水解活性，从而显著干预缓解了乳糖不耐腹泻症状(图2)。
其次，对于肠道的氧化应激程度，通过检测，发现与模型组相比，组合物组小鼠的空肠 MDA含量发生显著降低、T-SOD含量显著增加(图3)，腹泻小鼠肠道的抗氧化水平得到提高、氧化应激程度降低，减轻了由于乳糖不耐腹泻而造成的氧化应激，保护了肠道消化酶的活性。同时，通过测定空肠和血清中IL-4(抗炎因子)、TNF-α(促炎因子)和sIgA(抗体分子)的浓度(图4)。而在样品组中，组合物对肠道抗炎因子浓度的恢复效果最佳(IL-4 浓度比模型组高51.4％)。在组合物的干预下，小鼠的肠道中具有最低的TNF-α含量，相较于模型组降低了60.4％。类似的，渗透性腹泻降低了模型组小鼠空肠粘膜中的sIgA含量，而组合物的干预作用使小鼠肠道中sIgA的含量具有一定程度的恢复，提高了肠道的免疫水平。
此外，在该固体干预剂的作用下，乳糖不耐小鼠粪便中致病菌群肠杆菌属和肠球菌属的数量发生了明显的下降、益生菌群(乳酸菌属和双歧杆菌属)的数量有所增加，表明该干预剂在体内对大肠杆菌属以及肠球菌属具有较好的抑制生长能力(表2)。
表2小鼠粪便中特定肠道菌群的分析
Figure BDA0003221626790000121
同一行中标注不同字母表示组间有显著性差异(p<0.05)
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，本说明书内容不是对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，它由以下质量比的原料组成：
原料 ％
莲原花青素 20－80％
羧甲基茯苓多糖 20－80％；
一种固体干预剂的制备方法，其步骤是：
A、按一定比例取莲原花青素和羧甲基茯苓多糖；
B、将莲原花青素和羧甲基茯苓多糖置于混合容器中，混合均匀，获得组合物；
C、将组合物缓慢加入总质量1-10倍的蒸馏水并均匀混合，在4℃下避光静置28－32min，获得复合物；
D、将步骤(C)中获得的混合物进行低温减压干燥，温度控制在-10～-50℃，压力控制在0.1pa–5pa，获得一种固体干预剂。
2.根据权利要求1所述的一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，其特征在于：
原料 ％
莲原花青素 40－80％
羧甲基茯苓多糖 20－60％。
3.根据权利要求1所述的一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，其特征在于：
原料 ％
莲原花青素 50－75％
羧甲基茯苓多糖 25－50％。
4.根据权利要求1所述的一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，其特征在于：
原料 ％
莲原花青素 75％
羧甲基茯苓多糖 25％。
5.根据权利要求1所述的一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，其特征在于：
原料 ％
莲原花青素 78％
羧甲基茯苓多糖 22％。
6.根据权利要求1所述的一种能够有效干预乳糖不耐腹泻的天然产物固体干预剂，其特征在于：
原料 ％
莲原花青素 50％
羧甲基茯苓多糖 50％。
7.权利要求1所述的一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂在保健食品中的应用。
8.权利要求1所述的一种干预乳糖不耐腹泻的莲原花青素-羧甲基茯苓多糖固体干预剂在食品添加剂中的应用。
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