CN107056885A

CN107056885A - 双酶法制备钙螯合肽的方法

Info

Publication number: CN107056885A
Application number: CN201710246307.3A
Authority: CN
Inventors: 汪少芸; 陈旭; 蔡茜茜; 徐梁棕; 方卫东
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2017-04-15
Filing date: 2017-04-15
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明提供了一种双酶法制备钙螯合肽的方法，以裂殖壶菌粕蛋白为原料，通过碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分步酶解，再经过分离纯化得到纯化的特异性钙（Ca）螯合肽，氨基酸全序列为：fy。本发明制备的钙螯合肽可用于生产新型的钙补充剂—肽螯合钙，其具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和钙离子，必将成为钙补充剂的首选。本发明为裂殖壶菌粕蛋白的应用提供了一条崭新的思路。

Description

双酶法制备钙螯合肽的方法

技术领域

本发明涉及一种钙（Ca）螯合肽，更具体地涉及了一种利用碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分步酶解裂殖壶菌粕蛋白制备的钙螯合肽，属于生物技术领域。

背景技术

随着海洋源活性肽研究与产品开发的兴起，裂殖壶菌除了高含量的油脂外，仍含有相当丰富的蛋白质，并且这些蛋白质富含能提供配位键的谷氨酸和天冬氨酸，可以有效的作为钙离子配体与钙元素形成螯合物，既起到了补充微量元素的作用，又能充分利用高营养价值的裂殖壶菌蛋白。

当今，钙缺失是影响人类健康的全球性问题，缺钙造成机体的各种疾病，使人处于亚健康状态。随着国民生活水平的逐渐提高，同时市面上的各式各样的补钙制剂也在不断的冲击着人们的眼球，使得国民补钙意识也在不断增加。虽然这些补钙剂能在一定程度上缓解钙缺失的压力，但却也没有从根本上改善国民缺钙的状况，并且也具有一定的副作用。近年来，随着钙补充制剂的发展，以及经水解得到小肽易与钙离子形成可溶性配合物，维持钙在小肠内的溶解状态，促进小肠对钙的吸收，使得钙螯合肽的开发将成为一个全球研究性热点。研究表明，多肽螯合钙由于其独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和钙，而成为补钙首选。

因此，如何获得具有钙螯合活性的肽，就成为制备新型钙元素补充剂迫切的研究方向。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种利用碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分步酶解裂殖壶菌粕蛋白制备的钙螯合肽，使钙螯合活性得以高效地实现。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种钙螯合肽，所述肽的氨基酸序列为：fy。所述钙为Ca。

一种钙螯合肽的制备方法，以裂殖壶菌粕蛋白为原料，采用碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶对其进行分步酶解，分离纯化、冷冻干燥得到钙螯合肽。

第一步酶解条件为：最适酶为碱性蛋白酶，时间为8 h，pH为9，酶底比为10wt.%，底物浓度为1 wt.%。第二步酶解条件为：最适酶为复合风味蛋白酶，酶底比为10 wt.%，温度为40 ℃，pH为6，时间为3 h 50 min。

所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3 mL/min，洗脱峰在214 nm下进行测定；收集具有最高钙螯合活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，反相HPLC的分离条件是用体积分数为0-40%乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为2 mL/min，收集洗脱峰，冷冻干燥得到所述的钙螯合肽。

本发明立足于多肽具备与钙离子螯合的作用位点，能够与其形成稳定的化合物，且多肽-钙螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、可同时补充氨基酸和钙的理论基础，以来自于海洋源的裂殖壶菌粕蛋白为原材料，通过碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分步酶解的切割条件控制，切割制备具有高钙螯合活性的肽，而使钙螯合活性得以高效地实现。本发明为裂殖壶菌粕蛋白的应用提供了一条崭新的思路。

附图说明

图1纯化裂殖壶菌粕蛋白源钙螯合肽的 RP-HPLC-C18色谱图；其中SPH-1B为该特异性钙螯合肽的色谱峰。

具体实施方式

实施例1

采用的仪器、检测手段如下：

本技术所采用的裂殖壶菌粕，由福建省水产研究所提供，酶购自诺维信生物技术有限公司（中国·天津）。首先进行裂殖壶菌粕蛋白的提取，使用中药粉碎机处理裂殖壶菌粕，过60目筛，获得实验用原料。采用碱提酸沉的方法提取裂殖壶菌粕中的蛋白质。配制浓度为0.39mol/L的NaOH溶液，按料液比1:100（w/v）在90℃下提取30min。将所获得的样液在4℃下以10000r/min的转速离心20min，取上清弃沉淀。再用6mol/L HCl调节上清液中的pH值，调节pH值至3.0，对蛋白质进行酸沉。静置30min后，在4℃下以10000r/min的转速离心20min。最终取沉淀弃上清，冷冻干燥，然后再进一步对其酶解。

酶解工艺采用单因素实验，第一步酶解实验分别对五个酶解因素进行考察，分别为最适酶（中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶），时间（0.0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、6.0h、8.0h、10.0h、12.0h），pH（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，酶底比（2%、4%、6%、8%、10%、12%，w/w），底物浓度（1%、3%、5%、7%、9%，w/v）。在第一步酶解的基础上，第二步酶解实验分别对五个酶解因素进行考察，最适酶（复合风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶），时间（0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h），酶底比（4%、6%、8%、10%、12%，w/w），pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）。称取一定质量裂殖壶菌蛋白溶解于蒸馏水中，然后用2mol/L NaOH将其pH调节至最适pH。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着再按不同的酶底比加入相应量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再10000rpm离心10分钟。上清液收集后，分别对钙钙螯合活性进行测定，以确定最佳酶解条件。得到第二步酶解中具有最大钙螯合活性的酶解液的酶解条件是：酶底比10%、温度40℃、pH6、时间3h50min。

本发明的制备钙螯合肽的钙螯合活性测定方法，采用邻-甲酚酞比色法，测定钙螯合肽对钙离子的螯合作用。将1 mL 5 mmol/L的CaCl₂和2 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 8.0）加入具塞试管中，再加入1 mL清蛋白肽溶液，置于恒温加热水浴摇床中37℃ 温育2h，取出后10000 r/min常温离心10 min。取1 mL上清液，加入邻-甲酚酞显色液5 mL，摇匀。放置10 min后于分光光度计570 nm处测定吸光值，将数值代入标准曲线中计算出可溶性钙结合量。

标准曲线的制作：分别取标准Ca工作液（10 ug/ mL）0，0.2，0.4，0.6，0.8， 1.0 mL于10 mL试管中，分别加去离子水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL，加入邻-甲酚酞显色液5 mL，摇匀，放置10 min后于分光光度计570 nm处测定吸光值。以可溶性钙含量（ug/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标做图，得标准曲线公式为：y = 0.0992x - 0.0887，R² = 0.9988。

应用Sephadex G-25分子筛、RP-HPLC反相高效液相色谱等分离纯化手段，实现显著活性的裂殖壶菌粕蛋白钙螯合肽的高效分离纯化。

称取1.0克裂殖壶菌粕蛋白溶解于100ml 蒸馏水中，用2mol/L NaOH调节pH至9.0，加碱性蛋白酶，立即置于50℃的水浴摇床中反应8h，沸水浴灭酶10min，立即冷却，10000r/min离心10min，取上清得粗酶解液，用2mol/L NaOH调节pH至6.0，加复合风味蛋白酶，立即置于40℃的水浴摇床中反应3h50min，沸水浴灭酶10min，立即冷却，10000r/min离心10min，取上清备用。

将上清液用Sepadex G-25凝胶过滤色谱（长100 cm，外径2.0 cm）进行分离，获得最好的钙钙螯合活性的样品利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步的分离纯化。洗脱液自含100%去离子水（v/v）的混合液开始，至40%乙腈和60%水（v/v）的混合液结束，流速为2 ml/min进行梯度洗脱，收集洗脱峰，冷冻干燥得到本发明的高纯度的特异性钙钙螯合肽，如图1所示。SPH-1B峰为该特异性钙螯合肽的色谱峰。

纯化得到的特异性钙螯合肽具有很高的钙钙螯合活性，由表1可以看出，与酶解液相比，SPH-1B的钙螯合力有了很大提高。

表1 纯化的特异性钙螯合肽的钙螯合力

对纯化的特异性钙螯合肽利用ESI质谱仪((WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS, WatersCo., U.S.A)测定特异性钙螯合肽的氨基酸序列。所述钙螯合肽的氨基酸序列为：FY。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 双酶法制备钙螯合肽的方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2

<212> PRT

<213> 钙螯合肽

<400> 1

Phe Tyr

1

Claims

1.一种钙螯合肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为：FY。

2.如权利要求1所述的一种钙螯合肽的制备方法，其特征在于：以裂殖壶菌粕蛋白为原料，采用碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶对其进行分步酶解，分离纯化、冷冻干燥得到钙螯合肽。

3.根据权利要求3所述的一种钙螯合肽的制备方法，其特征在于：第一步酶解条件为：酶为碱性蛋白酶，时间为8 h，pH为9，酶底比为10wt.%，底物浓度为1 wt.%；第二步酶解条件为：酶为复合风味蛋白酶，酶底比为10 wt.%，温度为40 ℃，pH为6，时间为3 h 50 min。

4.根据权利要求3所述的一种钙螯合肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3 mL/min，洗脱峰在214 nm下进行测定；收集具有最高钙螯合活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，反相HPLC的分离条件是用体积分数为0-40%乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为2 mL/min，收集洗脱峰，冷冻干燥得到所述的具有钙螯合力的裂殖壶菌粕蛋白肽。