CN104031967B - 一种沙丁鱼降血压肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品生物技术及功能保健领域，公开一种沙丁鱼降血压肽及其制备方法与应用。所述方法主要技术步骤如下：沙丁鱼预处理成均浆后，先加入木瓜蛋白酶进行酶解，再加入碱性蛋白酶进行酶解；酶解完成后灭酶，并对灭酶后的酶解液进行离心；取离心后的上清液，利用超滤、凝胶层析的方法，对粗制品进行分离纯化；对分离纯化后的高效组分进行冷冻干燥，得到沙丁鱼降血压肽。沙丁鱼产量高、价格低廉，因此以沙丁鱼作为原料制备降血压肽，能充分提高沙丁鱼的综合利用价值，并且通过酶解获得的沙丁鱼降血压肽，不存在安全性问题，没有化学降血压类药物的副作用，降压效果理想。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术及功能保健领域，涉及一种降血压肽，具体涉及一种沙丁鱼降血压肽及其制备方法与应用。
背景技术
降血压肽，又称为血管紧张素转化酶(Angioensin I Converting Enzyme，简称ACE)抑制肽，是从食物蛋白中分离出的一类具有显著降低血压功效的多肽短链物质。从来源上，可分为乳蛋白(包括酪蛋白、乳清蛋白)、发酵食品、动物蛋白、植物蛋白以及天然ACE抑制肽。这些来源于食品的降血压肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高，其共同突出优点是只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用，因而不会有降压过度现象发生。除降压功能，它们往往具有免疫促进、抗凝血、易消化吸收和抗肿瘤等功能。而化学合成的降压药物(如卡托普利等)，虽然治疗高血压的效果非常明显，但其对肾脏的毒副作用，以及服药后出现低血压、干咳等症状，使人们对其安全性产生忧虑。
降血压肽的开发，以及关键的分离提纯过程，具有很大的现实意义。降血压肽的分离，是在食物蛋白经过化学酶解处理之后，将有明确降压效果的短肽分离出来，得到的产品一部分可作为功能食品的主要成分，开发降血压类功能食品；另一部分可继续提纯，在药品方面成为化学合成药物的替代品，还可以根据结构合成类似的氨基酸序列，验证其降压效果，为高血压的治疗以及降血压机理的研究提供了途径。
沙丁鱼，又称萨丁鱼、鳁和鰯。我国东南沿海有丰富的沙丁鱼类资源，主要为小沙丁鱼属约10余种，其中以金色小沙丁鱼和裘氏小沙丁鱼产量最高。而目前我国沙丁鱼降血压肽还未见产业化发展，这主要是由于在分离技术上还不够完善，如果能够克服细节上的关键问题，将具有很大的开发价值和应用前景。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种沙丁鱼降血压肽的制备方法；
本发明的另一目的在于提供上述制备方法得到的沙丁鱼降血压肽；
本发明的再一目的在于提供上述沙丁鱼降血压肽的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种沙丁鱼降血压肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料预处理：将沙丁鱼去鳞去头，搅拌，与水搅匀成沙丁鱼均浆；
优选的，所述原料预处理的具体步骤为：将沙丁鱼去鳞去头，放入高速搅拌机内搅拌，去除大块肉粒；然后将搅拌后的碎肉于30～40℃中自溶2.5～3.5h；自溶底物以25～35％(w/v)的浓度加入水中，搅拌成沙丁鱼均浆；
(2)第一步可控酶解：在所述沙丁鱼均浆中加入木瓜蛋白酶进行第一步酶解反应；
优选的，所述第一步酶解反应的温度为60～70℃，pH值为6.9～7.5，酶添加量为2000～4000U/g，反应时间为1.75～2.25h；
(3)第二步可控酶解：在步骤(2)所述第一步可控酶解后的酶解液中加入碱性蛋白酶进行第二步酶解反应；
优选的，所述第二步酶解反应的温度为55～65℃，pH值为9.0～10.0，酶添加量为2000～4000U/g，反应时间为1.75～2.25h；
(4)酶灭活：将步骤(3)所述第二步可控酶解后的酶解液进行高温灭活，然后冷却至室温；
优选的，所述高温灭活的温度为90～95℃，时间为15～20min；
(5)离心：将步骤(4)酶灭活处理冷却后的酶解液进行离心，取上清液，得到沙丁鱼蛋白肽粗提取物溶液；
优选的，所述离心的转速为8000～10000rpm，离心时间为10～20min；
(6)超滤：采用超滤膜对所述沙丁鱼蛋白肽粗提取物溶液进行分离纯化，得到超滤浓缩液；
优选的，所述超滤膜为截留分子量为3000～10000Da的超滤膜；
(7)凝胶层析：利用凝胶层析柱对所述超滤浓缩液进行进一步分离纯化，得到沙丁鱼降血压肽提取物浓缩液；
优选的，所述凝胶层析柱的型号为Sephadex G-50、Sephadex G-25或Sephadex G-15；
(8)冷冻干燥：将所述沙丁鱼降血压肽提取物浓缩液进行冷冻干燥，得到所述沙丁鱼降血压肽。
一种由上述制备方法得到的沙丁鱼降血压肽。
上述沙丁鱼降血压肽在制备降血压功能食品或药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明所述制备方法所用原料为大宗低值沙丁鱼，在沿海地区产量高，且不存在安全性问题。
(2)本发明所述制备方法采用双酶法对沙丁鱼进行酶解，酶解效果好，能有效地将沙丁鱼蛋白酶解成多肽。
(3)本发明所述沙丁鱼降血压肽食用安全性高，只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用，不会有降压过渡现象发生。
(4)本发明所述沙丁鱼降血压肽可应用于食品工业、制药工业、饲料工业等。
(5)本发明所述制备方法工艺过程简单，生产成本较低，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例所用沙丁鱼是广东省大宗低值沙丁鱼，来源于广东省阳江市大开水产有限公司；所用木瓜蛋白酶为市售产品，购买于广州市华琪生物科技有限公司，型号为PA1，实测的酶活为5.81*104U/g；所用碱性蛋白酶为市售产品购买于广州柏棠贸易有限公司，型号为Protex6L，实测的酶活为5.13*105U/g。
实施例1
一种沙丁鱼降血压肽，其制备方法如下：
(1)原料预处理：将沙丁鱼清洗干净后去鳞去头，放入高速搅拌机内搅成肉末状；在30℃恒温水浴下，自溶3.5h；自溶后的鱼肉末以25％(W/V)的浓度加入到100mL蒸馏水中，搅拌成沙丁鱼均浆；
(2)第一步酶解：于沙丁鱼均浆中加入木瓜蛋白酶，在60℃、pH＝6.9、酶添加量2000U/g的条件下酶解2.25h；
(3)第二步酶解：待第一步酶解完成后，于酶解液中继续加入碱性蛋白酶，在65℃、pH＝10.0、酶添加量4000U/g的条件下酶解1.75h；
(4)酶灭活：待第二步酶解完成后，将酶解液在水浴温度为90℃的条件下灭活20min，冷却；
(5)离心：对冷却后的酶解液进行离心，设定离心机转速为8000rpm，维持20min；离心完成后取上清液，得到沙丁鱼蛋白肽粗提取物溶液；
(6)超滤：采用截留量为3000Da的超滤膜对所述沙丁鱼蛋白肽粗提取物溶液进行超滤，除去大分子蛋白及多肽；
(7)凝胶层析：对超滤后的浓缩液进行凝胶层析，采用Sephadex G-50，以1.5mL/min的洗脱速度进行洗脱，收集活性高的组分，得到沙丁鱼降血压肽提取物浓缩液；
(8)冷冻干燥：对所得沙丁鱼降血压肽提取物浓缩液进行冷冻干燥，得到产品沙丁鱼降血压肽。
所述沙丁鱼降血压肽呈淡黄白色粉末状，水溶性良好，无苦味、异味。
所述沙丁鱼降血压肽功效测试：用pH8.3的磷酸盐缓冲溶液配制HHL为10mmol/L，ACE酶液为25mu/mL；取沙丁鱼降血压肽粉末0.2g溶于10mL超纯水中，10000rpm离心15min；取60uL离心后的上清液，加入80uL的HHL，10uL的ACE酶液，置于37℃恒温水浴中反应80min；加入110uL的1mol/L的HCl，5min后终止反应；加入1.5mL的乙酸乙酯进行萃取，10000rpm离心15min；取乙酸乙酯层1mL，置于烘箱中90℃蒸发10min；将干燥后的物质溶解在3mL蒸馏水中，于228nm吸光度下测定。测得所述沙丁鱼降血压肽的ACE抑制率为65.4％。
实施例2
一种沙丁鱼降血压肽，其制备方法如下：
(1)原料预处理：将沙丁鱼清洗干净后去鳞去头，放入高速搅拌机内搅成肉末状；在35℃恒温水浴下，自溶3h；自溶后的鱼肉末以30％(W/V)的浓度加入到100mL蒸馏水中，搅拌成沙丁鱼均浆；
(2)第一步酶解：于沙丁鱼均浆中加入木瓜蛋白酶，在65℃、pH＝7.2、酶添加量3000U/g的条件下酶解2.0h；
(3)第二步酶解：待第一步酶解完成后，于酶解液中继续加入碱性蛋白酶，在60℃、pH＝9.5、酶添加量3000U/g的条件下酶解2.0h；
(4)酶灭活：待第二步酶解完成后，将酶解液在水浴温度为95℃的条件下灭活15min，冷却；
(5)离心：对冷却后的酶解液进行离心，设定离心机转速为9000rpm，维持15min；离心完成后取上清液，得到沙丁鱼蛋白肽粗提取物溶液；
(6)超滤：采用截留量为5000Da的超滤膜对所述沙丁鱼蛋白肽粗提取物溶液进行超滤，除去大分子蛋白及多肽；
(7)凝胶层析：对超滤后的浓缩液进行凝胶层析，采用Sephadex G-15，以1.5mL/min的洗脱速度进行洗脱，收集活性高的组分，得到沙丁鱼降血压肽提取物浓缩液；
(8)冷冻干燥：对所得沙丁鱼降血压肽提取物浓缩液进行冷冻干燥，得到产品沙丁鱼降血压肽。
所述沙丁鱼降血压肽呈淡黄白色粉末状，水溶性良好，无苦味、异味。
按照实施例1的分析方法，测定所述沙丁鱼降血压肽的ACE抑制率为60.8％。
实施例3
一种沙丁鱼降血压肽，其制备方法如下：
(1)原料预处理：将沙丁鱼(采用的是广东省大宗低值沙丁鱼，来源于广东省阳江市大开水产有限公司)清洗干净后去鳞去头，放入高速搅拌机内搅成肉末状；在40℃恒温水浴下，自溶2.5h；自溶后的鱼肉末以35％(W/V)的浓度加入到100mL蒸馏水中，搅拌成沙丁鱼均浆；
(2)第一步酶解：于沙丁鱼均浆中加入木瓜蛋白酶(采用的木瓜蛋白酶型号为PA1，购买于广州市华琪生物科技有限公司，实测的酶活为5.81*104U/g)，在70℃、pH＝7.5、酶添加量4000U/g的条件下酶解1.75h；
(3)第二步酶解：待第一步酶解完成后，于酶解液中继续加入碱性蛋白酶(采用的碱性蛋白酶型号为Protex6L，购买于广州柏棠贸易有限公司，实测的酶活为5.13*105U/g)，在55℃、pH＝9.0、酶添加量2000U/g的条件下酶解2.25h；
(4)酶灭活：待第二步酶解完成后，将酶解液在水浴温度为95℃的条件下灭活15min，冷却；
(5)离心：对冷却后的酶解液进行离心，设定离心机转速为10000rpm，维持10min；离心完成后取上清液，得到沙丁鱼蛋白肽粗提取物溶液；
(6)超滤：采用截留量为10000Da的超滤膜对所述沙丁鱼蛋白肽粗提取物溶液进行超滤，除去大分子蛋白及多肽；
(7)凝胶层析：对超滤后的浓缩液进行凝胶层析，采用Sephadex G-25，以1.5mL/min的洗脱速度进行洗脱，收集活性高的组分，得到沙丁鱼降血压肽提取物浓缩液；
(8)冷冻干燥：对所得沙丁鱼降血压肽提取物浓缩液进行冷冻干燥，得到产品沙丁鱼降血压肽。
所述沙丁鱼降血压肽呈淡黄白色粉末状，水溶性良好，无苦味、异味。
按照实施例1的分析方法，测定所述沙丁鱼降血压肽的ACE抑制率为63.4％
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种沙丁鱼降血压肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)原料预处理：将沙丁鱼去鳞去头，搅拌，与水搅匀成沙丁鱼均浆；
(2)第一步可控酶解：在所述沙丁鱼均浆中加入木瓜蛋白酶进行第一步酶解反应；
(3)第二步可控酶解：在步骤(2)所述第一步可控酶解后的酶解液中加入碱性蛋白酶进行第二步酶解反应；
(4)酶灭活：将步骤(3)所述第二步可控酶解后的酶解液进行高温灭活，然后冷却至室温；
(5)离心：将步骤(4)酶灭活处理冷却后的酶解液进行离心，取上清液，得到沙丁鱼蛋白肽粗提取物溶液；
(6)超滤：采用超滤膜对所述沙丁鱼蛋白肽粗提取物溶液进行分离纯化，得到超滤浓缩液；
(7)凝胶层析：利用凝胶层析柱对所述超滤浓缩液进行进一步分离纯化，得到沙丁鱼降血压肽提取物浓缩液；
(8)冷冻干燥：将所述沙丁鱼降血压肽提取物浓缩液进行冷冻干燥，得到所述沙丁鱼降血压肽；
步骤(2)所述第一步酶解反应的温度为60～70℃，pH值为6.9～7.5，酶添加量为2000～4000U/g，反应时间为1.75～2.25h；
步骤(3)所述第二步酶解反应的温度为55～65℃，pH值为9.0～10.0，酶添加量为2000～4000U/g，反应时间为1.75～2.25h。
2.根据权利要求1所述的一种沙丁鱼降血压肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述原料预处理的具体步骤为：将沙丁鱼去鳞去头，放入高速搅拌机内搅拌，去除大块肉粒；然后将搅拌后的碎肉于30～40℃中自溶2.5～3.5h；自溶底物以25～35％(w/v)的浓度加入水中，搅拌成沙丁鱼均浆。
3.根据权利要求1所述的一种沙丁鱼降血压肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述高温灭活的温度为90～95℃，时间为15～20min。
4.根据权利要求1所述的一种沙丁鱼降血压肽的制备方法，其特征在于：步骤(5)所述离心的转速为8000～10000rpm，离心时间为10～20min。
5.根据权利要求1所述的一种沙丁鱼降血压肽的制备方法，其特征在于：步骤(6)所述超滤膜为截留分子量为3000～10000Da的超滤膜。
6.根据权利要求1所述的一种沙丁鱼降血压肽的制备方法，其特征在于：步骤(7)所述凝胶层析柱的型号为Sephadex G-50、Sephadex G-25或SephadexG-15。
7.一种沙丁鱼降血压肽，是根据权利要求1～6任一项所述制备方法得到的。
8.权利要求7所述的沙丁鱼降血压肽在制备降血压功能食品或药物中的应用。
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