CN101153310B - 复合酶解带鱼脊骨制备降血压肽的方法 - Google Patents

复合酶解带鱼脊骨制备降血压肽的方法 Download PDF

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本发明公开了一种复合酶解带鱼脊骨制备降血压肽的方法，包括如下步骤：将带鱼脊骨粉碎后加水搅匀，调节pH值，将温度升高到30-45℃，加入弹性蛋白酶，进行酶解反应，然后将酶解液迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，再迅速冷却至室温终止反应，调酶解液pH为1.5-3.0，加入胃蛋白酶，进行酶解反应，而后反应体系迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，再迅速冷却至室温终止反应，离心后取上清液过滤、真空浓缩、冷冻干燥，得到粉状降血压肽。本发明方法原料来源丰富，价格低廉，经过本发明的技术转化可以有效的提高带鱼脊骨这种水产加工下脚料的经济附加值，对继续促进水产加工业的发展有重要的意义。

Description

复合酶解带鱼脊骨制备降血压肽的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及生物制药技术及功能性食品生产加工技术。
背景技术
血管紧张素转换酶(ACE)在血压调节过程中扮演重要的角色。其可使无活性的血管紧张素十肽前体转化为血管紧张素，从而使血压升高。血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性肽是血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)中的一种，通过抑制ACE的活性而达到降低血压的作用。目前已经有多种化学合成肽类药物作为ACE的抑制剂。这类合成降血压药物的缺点是作用时间不长，血压容易反弹，并且药物经肾脏排出容易造成肾功能的损伤。
从天然蛋白质中提取具有营养性和生理活性的功能肽，并将这些功能肽应用到保健食品和强化营养食品当中不但能够全面利用食品及食品加工中优质蛋白质，而且能够有效的提高来源广泛的蛋白质原料的附加值，同时大大提升传统食品的科技含量。
食品蛋白质经酶解产生的降血压肽具有食用安全性高、无副作用，特别是其对高血压患者具有降压作用，但对血压正常人无降压作用的优点，近年来受到广泛关注。目前人们已经成功地从磷虾、金枪鱼、沙丁鱼、鲣鱼、玉米、大豆、酒糟、蚕蛹、酪蛋白中获得了ACE抑制肽。但上述研究分离方法成本高，规模化生产的成本也较高，并且原料多为人们的生活食物。九十年代后期，国内外关于蛋白酶解肽的研究主要围绕在蛋白质的水解度、分子量大小、游离氨基酸含量、生物酶重复利用以及对苦味的控制和去除等。
带鱼(Trichiurus iaponicus)属鲈形目、带鱼科、带鱼属，俗名刀鱼、裙带鱼、牙带、白带鱼等，为集群于底层的暖水性鱼类，广泛分布于中国、朝鲜、日本、印度尼西亚、菲律宾、印度、非洲东岸及红海等海域。据统计，该鱼种在中国的渔获量中最高，占世界同种鱼渔获量的70％-80％，位居中国海洋渔业单鱼种渔获量第1位；而东海区带鱼渔获量又最高，占中国同种渔获量的80％-90％，是东海区渔业生产最重要的捕捞对象。
传统医学认为，带鱼性温、味甘、能暖胃、泽肤、补气、养血、健美，适宜久病体虚、血虚头晕、气短乏力、食少赢瘦、营养不良之人和皮肤干燥之人食用。《食物中药与便方》云：带鱼.滋阴.养肝。急慢性肠炎蒸食，能改善症状。经常食用带鱼.具有补益五脏的功效。
带鱼脊骨是带鱼加工后的主要下脚料，俗称带鱼鱼排。目前其主要用于饲料工业，对于利用带鱼脊骨的利用及深度加工尚属空白。
发明内容
本发明提供了一种复合酶解带鱼脊骨制备具有对血管紧张素转换酶(ACE)具有抑制作用的降血压肽的方法。
一种复合酶解带鱼脊骨制备降血压肽的方法，包括如下步骤：将带鱼脊骨粉碎后加水搅匀，调节PH值为7-9(一般用盐酸)，将温度升高到30-45℃，保持10-20分钟后，加入原料(带鱼脊骨)中蛋白重量的0.5-2％的弹性蛋白酶(酶活力为15000U/g，弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶伴有广泛的底物特异性，它能水解氨基化合物和酯。弹性酶的特殊之处在于它能作用于弹性蛋白。用于蛋白测序研究以及制备组织分离细胞。)，继续保温并不断搅拌进行酶解反应2-5小时，然后将酶解液迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，再迅速冷却至室温终止反应。调酶解液pH为1.5-3.0(优选2.0)，加入原料(带鱼脊骨)中蛋白重量的0.05-0.3％的胃蛋白酶(酶活力5000U/g，胃蛋白酶能消化蛋白质，使凝固的蛋白质分解。在pH值1.5-2.5时其活力最强，遇碱性药物或抗酸药，效果减弱甚至失效。遇鞣酸、没食子酸或多数重金属盐溶液产生沉淀而失效。)，在35-40℃继续保温并不断搅拌进行酶解反应1-3小时，而后反应体系迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，再迅速冷却至室温终止反应，在2500-3000r/min的条件下离心30分钟，留上清液，过滤，利用真空浓缩机将酶解液浓缩，进行冷冻干燥，得到具有降血压功能的肽粉。
所述的带鱼脊骨加水搅匀时，带鱼脊骨的质量与水的体积比为1∶2-6(g/ml)，优选1∶4(g/ml)；调节PH值优选为8.0。
作为优选，调节PH值后将温度升高到37℃。
作为优选，弹性蛋白酶加入量为原料(带鱼脊骨)中蛋白重量的0.8％。
作为优选，加入弹性蛋白酶后进行酶解反应3小时。
作为优选，胃蛋白酶加入量为原料(带鱼脊骨)中蛋白重量的0.1％。
作为优选，加入胃蛋白酶后在37℃进行酶解反应2小时。
本发明方法采用两段酶解，缩短了酶解时间，减低能源消耗。带鱼脊骨中主要是弹性蛋白，用相应的酶进行有针对性酶解效果好。对于产品得率，和产品性能有很大提高。
本发明方法的优点是：
1.本发明所制备的降血压肽是带鱼脊骨经生物酶水解而得，具有抑制ACE活性的作用，对高血压患者具有降压作用，安全、无毒副作用，对血压正常者可起到保健作用，对正常血压无影响。
2.本发明所采用的原料来源丰富，价格低廉，经过本发明的技术转化可以有效的提高带鱼脊骨这种水产加工下脚料的经济附加值，对继续促进水产加工业的发展有重要的意义。
3.本发明的产品可以作为药品、保健食品、食品、食品添加剂、药物增效剂等，工艺科学合理，操作简单，具有较强的工业化实施性。
具体实施方法1
实施例1
称取匀浆后的带鱼脊骨(水分76.22％，蛋白质含量12.17％，浙江省宁波超星海洋生物制品有限公司提供)20kg，加水80kg搅匀后用调节PH值为8.0，将温度升高到37℃，保持20分钟后，加入原料中带鱼脊骨重量的0.1％的弹性蛋白酶0.02kg(酶活力为15000U/g)，继续保温并不断搅拌进行酶解反应3小时。然后采用酶解液迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，迅速冷却至室温来终止反应。调节酶解液的pH为2.0，将温度保持在37℃约20分钟，加入原蛋白含量的0.1％的胃蛋白酶0.002kg，继续保温并不断搅拌进行酶解反应2小时。然后采用酶解液迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，迅速冷却至室温来终止反应。在J-6M型大容量冷冻离心机(BECKMAN公司)3000r/min的4℃条件下离心30分钟，得上清液76.5kg。以普通滤纸过滤，而后利用中空纤维聚砜超滤膜(截留分子量10KDa)对粗滤酶解液进行超滤，工作压力0.2MPa，工作温度约30℃，得到膜透过液62.7kg。利用真空浓缩机将超滤透过酶解液浓缩至5kg，进行冷冻干燥，得到具有降血压功能的肽粉1.32kg，肽含量为93.89％，产品得率为6.7％，色泽乳黄色细腻，利用体外检测ACE抑制活性的CUSHMAN法，测得其IC50为0.598mg/ml。
实施例2
称取匀浆后的带鱼脊骨(水分76.22％，蛋白质含量12.17％，浙江省宁波超星海洋生物制品有限公司提供)10kg，加水30kg搅匀后用调节PH值为7.0，将温度升高到37℃，加入原料中带鱼脊骨重量的0.12％的弹性蛋白酶0.012kg(酶活力为15000U/g)，继续保温并不断搅拌进行酶解反应2小时。然后采用酶解液迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，迅速冷却至室温来终止反应。调节酶解液的pH为2.0，将温度保持在37℃约20分钟，加入原蛋白含量的0.1％的胃蛋白酶0.002kg，继续保温并不断搅拌进行酶解反应1小时。然后采用酶解液迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，迅速冷却至室温来终止反应。在J-6M型大容量冷冻离心机(BECKMAN公司)3000r/min的4℃条件下离心30分钟，得上清液27.2kg。以普通滤纸过滤，而后利用中空纤维聚砜超滤膜(截留分子量10KDa)对粗滤酶解液进行超滤，工作压力0.2MPa，工作温度约25-30℃，得到膜透过液22.1kg。利用真空浓缩机将超滤透过酶解液浓缩至3kg，进行冷冻干燥，得到具有降血压功能的肽粉0.42kg，肽含量为87.24％，产品得率为4.2％，色泽乳黄色细腻，利用体外检测ACE抑制活性的CUSHMAN法，测得其IC50为1.996mg/ml。
实施例3
称取匀浆后的带鱼脊骨(水分76.22％，蛋白质含量12.17％，浙江省宁波超星海洋生物制品有限公司提供)25kg，加水125kg搅匀后用调节PH值为8.0，将温度升高到37℃，保持20分钟后，加入原料中带鱼脊骨重量的0.12％的弹性蛋白酶0.03kg(酶活力为15000U/g)，继续保温并不断搅拌进行酶解反应3小时。然后采用酶解液迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，迅速冷却至室温来终止反应。调节酶解液的pH为1.5，将温度保持在37℃约20分钟，加入原蛋白含量的0.1％的胃蛋白酶0.0025kg，继续保温并不断搅拌进行酶解反应1小时。然后采用酶解液迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，迅速冷却至室温来终止反应。在J-6M型大容量冷冻离心机(BECKMAN公司)3000r/min的4℃条件下离心30分钟，得上清液98.9kg。以普通滤纸过滤，而后利用中空纤维聚砜超滤膜(截留分子量10KDa)对粗滤酶解液进行超滤，工作压力0.2MPa，工作温度约30℃，得到膜透过液81.4kg。利用真空浓缩机将超滤透过酶解液浓缩至7kg，进行冷冻干燥，得到具有降血压功能的肽粉1.3kg，肽含量为89.93％，产品得率为5.2％，色泽乳黄色细腻，利用体外检测ACE抑制活性的CUSHMAN法，测得其IC50为1.207mg/ml。

Claims (8)

1.一种复合酶解带鱼脊骨制备降血压肽的方法，包括如下步骤：将带鱼脊骨粉碎后加水搅匀，调节PH值为7-9，将温度升高到30-45℃，保持10-20分钟后，加入原料带鱼脊骨中蛋白重量的0.5-2％的弹性蛋白酶，继续保温并不断搅拌进行酶解反应2-5小时，然后将酶解液迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，再迅速冷却至室温终止反应，调酶解液pH为1.5-3.0，加入原料带鱼脊骨中蛋白重量的0.05-0.3％的胃蛋白酶，在35-40℃搅拌进行酶解反应1-3小时，而后反应体系迅速升温至90-100℃，保持10-15分钟后，再迅速冷却至室温终止反应，离心后取上清液过滤、真空浓缩、冷冻干燥，得到粉状降血压肽；
所述的弹性蛋白酶的活力为15000U/g；所述的胃蛋白酶的活力为5000U/g。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的带鱼脊骨加水搅匀时，带鱼脊骨的质量与水的体积比为1∶2-6g/ml。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的带鱼脊骨加水搅匀时，带鱼脊骨的质量与水的体积比为1∶4g/ml。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：弹性蛋白酶加入量为原料带鱼脊骨中蛋白重量的0.8％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：加入弹性蛋白酶后进行酶解反应3小时。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：胃蛋白酶加入量为原料带鱼脊骨中蛋白重量的0.1％。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：加入胃蛋白酶后在37℃进行酶解反应2小时。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的离心条件是2500-3000r/min，离心20-30分钟。 
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