CN104694615A - 一种利用益生菌发酵海洋生物加工下脚料制备降血压肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用益生菌发酵海洋生物加工下脚料制备降血压肽的方法，其是以鱼皮、鱿鱼皮、鱼鳔或鱼鳞等富含胶原蛋白的海洋生物加工下脚料为原料，清洗后打浆，加热灭除微生物，冷却后加入蛋白酶做液化处理，灭酶后加入葡萄糖，放入发酵罐，灭菌后接种益生菌发酵剂，发酵后滤去残渣。在发酵滤液中加入冷冻保护剂，经冷冻干燥直接得到含活性益生菌与活性肽的复合降血压生物制剂。另外，发酵滤液还可经膜过滤纯化浓缩后，通过喷雾干燥得到降血压肽制品。本发明采用蛋白酶液化和益生菌发酵相结合的技术方案，相比传统的酶法制备工艺，增强了高活性降血压低聚肽的制备效率，提高了海洋生物加工下脚料的附加值，制备工艺合理有效，适合工业化生产。

Description

一种利用益生菌发酵海洋生物加工下脚料制备降血压肽的方法

技术领域

本发明涉及一种利用益生菌发酵海洋生物加工下脚料制备降血压肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术

高血压是种困扰全球的慢性心血管疾病，潜伏期长，并发症多，需要长期的药物治疗才能控制病情的发展。人工合成的降血压药物虽然疗效显著，但在临床应用的过程中产生了多种副作用。然而，存在于天然动植物资源中的降血压功能因子，具有安全有效、无毒副作用等特点，在国内外得到了广泛的关注。其中，降血压肽已成为了当今高血压防治研究中的一个热点。大量基于降血压肽构效关系的研究表明，高活性降血压肽主要是分子量小于1kDa的低聚肽，其氨基酸序列中通常含有脯氨酸和羟脯氨酸残基。胶原蛋白的氨基酸序列中含高达15-25％的脯氨酸和羟脯氨酸残基，是潜在的制取高活性降血压肽的优质蛋白。我国海域辽阔，海洋生物丰富，其在加工过程中产生了大量的富含胶原蛋白的下脚料，如鱼皮、鱿鱼皮、鱼鳔、鱼鳞等，为高活性降血压肽的产业化制备提供了丰富的自然资源。

目前，降血压肽主要是通过酶水解蛋白的方法制得，可采用单酶或复合酶，可以是一步或多步水解，但是产物的降血压活性和制备效率较低。然而，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌等益生菌，能够分泌特异性的胞外蛋白酶，定向水解基质中的蛋白产生高活性降血压肽，从而对人体产生降血压作用；此外，这类益生菌的特定代谢产物，如肽聚糖，也具有显著的降血压作用。因此，具有降血压作用的益生菌已成为了当今高血压防治研究中的另一个热点。这类益生菌为定向水解蛋白制备高活性降血压肽提供了潜在的特异性胞外酶。

目前，利用海洋生物加工下脚料制备降血压肽主要是采用酶法水解的技术路线；此外，利用益生菌发酵制备降血压肽主要是采用乳蛋白作为水解蛋白。如何增强高活性降血压低聚肽的制备效率是一个亟待解决的问题，其中，蛋白和酶的选择以及技术方案的设计是关键技术。目前，还未见到以富含胶原蛋白的海洋生物加工下脚料为原料、采用蛋白酶液化和益生菌发酵相结合的技术方案来制备降血压肽的研究报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种以富含胶原蛋白的海洋生物加工下脚料为原料、采用蛋白酶液化和益生菌发酵相结合的技术方案来制备降血压肽的方法。该方法的原料选取科学，工艺合理有效，制备效率高，开创了一新的工艺路线，适合工业化生产。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用益生菌发酵海洋生物加工下脚料制备降血压肽的方法，其是以鱼皮、鱿鱼皮、鱼鳔或鱼鳞等富含胶原蛋白的海洋生物加工下脚料为原料，经清洗后进行打浆处理，加热灭除微生物，冷却后加入蛋白酶进行液化处理，灭酶后加入葡萄糖得初始发酵液，然后放入发酵罐，灭菌后接种益生菌液体发酵剂进行发酵，发酵后滤去残渣，在发酵滤液中加入冷冻保护剂，经冷冻干燥直接得到含活性益生菌与活性肽的复合降血压生物制剂；另外，发酵滤液还可经进一步管式膜除杂、超滤膜截留分级、纳滤膜浓缩脱盐后，通过喷雾干燥或冷冻干燥得到降血压肽制品。

所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或多种，其用量为海洋生物重量的1～10‰。

所述的益生菌液体发酵剂是将益生菌种按重量百分数0.01～1％接入灭菌的初始发酵液中37～42℃恒温摇床密封培养2～4天而成，接种量是初始发酵液体积百分数的0.1～10％，益生菌种为植物乳杆菌、以及干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌中的一种或多种。

本发明科学合理的选取鱼皮、鱿鱼皮、鱼鳔或鱼鳞等海洋生物的加工下脚料为原料，其所富含的胶原蛋白是富含高活性降血压肽特征性序列的优质蛋白；所用的植物乳杆菌等具有降血压作用的益生菌，能够分泌定向水解蛋白产生高活性降血压肽的特异性胞外蛋白酶；采用蛋白酶初步液化处理，提高了益生菌后续发酵制备降血压肽的效率。发酵后,可在发酵液中加入冷冻保护剂，经冷冻干燥直接得到复合降血压生物制剂，该制剂富含高活性降血压低聚肽、活性益生菌、降血压肽聚糖等益生菌代谢产生的其它功能因子，该制剂还保留了海洋生物加工下脚料中天然存在的其它功能因子；另外，发酵液还可进一步采用膜过滤纯化后，通过喷雾干燥或冷冻干燥得到降血压肽制品。本发明实现了高活性降血压低聚肽的高效定向制备，开创了一新的工艺路线，所得的复合降血压生物制剂和降血压肽制品具有较好的应用前景和社会经济效益，并且提高了海洋生物加工下脚料的附加值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种利用益生菌发酵鱼皮制备降血压肽的方法，其具体工艺步骤如下：

a.原料的选取与预处理：选取10kg鲜鱼皮，清水洗净后捞出沥干水分，加入100L的纯净水后使用打浆机进行打浆处理，得浆状物；

b.蛋白酶液化：将所得的浆状物加热至中心温度达到100℃，保持10min，灭除微生物，冷却到50℃，用HCl调节pH到5.2，加入50g木瓜蛋白酶进行液化处理2h后，将液化液加热至中心温度达到100℃，保持10min，灭除酶活，得灭酶液化液；

c.初始发酵液的制备：在所得的灭酶液化液中，加入2kg葡萄糖，用NaOH调节pH到7.0，得初始发酵液；

d.益生菌发酵：将初始发酵液放入空消发酵罐进行实消，空消和实消的条件均为121℃、20min，待罐温降至37℃，接入2L益生菌液体发酵剂，该液体发酵剂是将植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌均按重量百分数1％接入灭菌的初始发酵液中37℃恒温摇床密封培养3天而成，该接种混合液在37℃和150rpm搅拌转速的条件下密封发酵4天，发酵液滤去残渣，得发酵滤液；

e.降压肽的粗制：在所得的发酵滤液中加入5％海藻糖、3％麦芽糊精、1％甘油等冷冻保护剂，-50℃预冻2h，然后在-50℃冷阱温度和100Pa真空度的条件下冷冻干燥48h，粉碎成粉，直接得到含活性益生菌与活性肽的复合降血压生物制剂。

本复合降血压生物制剂富含高活性降血压低聚肽、活性益生菌、降血压肽聚糖等益生菌代谢产生的其它功能因子，该制剂还保留了鱼皮中天然存在其它功能因子，功能、营养、口感和风味俱佳。

实施例2

一种利用益生菌发酵鱿鱼皮制备降血压肽的方法，其具体工艺步骤如下：

a.原料的选取与预处理：选取10kg鲜鱿鱼皮，清水洗净后捞出沥干水分，加入100L的纯净水后使用打浆机进行打浆处理，得浆状物；

b.蛋白酶液化：将所得的浆状物加热至中心温度达到95℃，保持10min，灭除微生物，冷却到55℃，加入50g风味蛋白酶进行液化处理2h后，将液化液加热至中心温度达到95℃，保持10min，灭除酶活，得灭酶液化液；

c.初始发酵液的制备：在所得的灭酶液化液中，加入1kg葡萄糖，调节pH到7.0，得初始发酵液；

d.益生菌发酵：将初始发酵液放入空消发酵罐进行实消，空消和实消的条件均为121℃、20min，待罐温降至37℃，接入1L益生菌液体发酵剂，该液体发酵剂是将植物乳杆菌按重量百分数1％接入灭菌的初始发酵液中37℃恒温摇床密封培养4天而成，该接种混合液在37℃和200rpm搅拌转速的条件下密封发酵4天，发酵液滤去残渣，得发酵滤液；

e.降压肽的纯化：将所得的发酵滤液采用孔径为0.2um的管式膜脱除大分子，然后采用截留分子量为3kDa的超滤膜截留分级，截留液采用纳滤膜浓缩脱盐，然后在180℃进风温度、80℃出风温度和0.4MPa喷雾压力的条件下喷雾干燥，得到降血压肽制品。

相比传统的蛋白酶水解法，本方法制备的降血压肽制品的得率提高了25％以上，制品中分子量小于1kDa的、含脯氨酸或羟脯氨酸残基的高活性降血压低聚肽，如Glu-Pro-Gly-Pro-Thr和Phe-Tyr-Pro-Pro等，的比例提高了30％以上。

实施例3

一种利用益生菌发酵鱼鳔制备降血压肽的方法，其具体工艺步骤如下：

a.原料的选取与预处理：选取10kg鲜鱼鳔，清水洗净后捞出沥干水分，加入100L的纯净水后使用打浆机进行打浆处理，得浆状物；

b.蛋白酶液化：将所得的浆状物加热至中心温度达到100℃，保持10min，灭除微生物，冷却到55℃，加入50g风味蛋白酶进行液化处理2h后，将液化液加热至中心温度达到100℃，保持10min，灭除酶活，得灭酶液化液；

c.初始发酵液的制备：在所得的灭酶液化液中，加入2kg葡萄糖，用NaOH调节pH到7.0，得初始发酵液；

d.益生菌发酵：将初始发酵液放入空消发酵罐进行实消，空消和实消的条件均为121℃、20min，待罐温降至37℃，接入2L益生菌液体发酵剂，该液体发酵剂是将植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌均按重量百分数1％接入灭菌的初始发酵液中37℃恒温摇床密封培养4天而成，该接种混合液在37℃和150rpm搅拌转速的条件下密封发酵4天，发酵液滤去残渣，得发酵滤液；

e.降压肽的粗制：在所得的发酵滤液中加入6％海藻糖、3％麦芽糊精、1％甘油等冷冻保护剂，-50℃预冻2h，然后在-50℃冷阱温度和100Pa真空度的条件下冷冻干燥48h，粉碎成粉，直接得到含活性益生菌与活性肽的复合降血压生物制剂。

本复合降血压生物制剂富含高活性降血压低聚肽、活性益生菌、降血压肽聚糖等益生菌代谢产生的其它功能因子，该制剂还保留了鱼鳔中天然存在其它功能因子，功能、营养、口感和风味俱佳。

实施例4

一种利用益生菌发酵鱼鳞制备降血压肽的方法，其具体工艺步骤如下：

a.原料的选取与预处理：选取20kg鲜鱼鳞，清水洗净后捞出沥干水分，加入100L的纯净水后使用打浆机进行打浆处理，得浆状物；

b.蛋白酶液化：将所得的浆状物加热至中心温度达到100℃，保持10min，灭除微生物，冷却到37℃，用HCl调节pH到2，加入100g胃蛋白酶进行液化处理4h后，将液化液加热至中心温度达到100℃，保持10min，灭除酶活，得灭酶液化液；

c.初始发酵液的制备：在所得的灭酶液化液中，加入1kg葡萄糖，调节pH到7.0，得初始发酵液；

d.益生菌发酵：将初始发酵液放入空消发酵罐进行实消，空消和实消的条件均为121℃、20min，待罐温降至37℃，接入1L益生菌液体发酵剂，该液体发酵剂是将植物乳杆菌按重量百分数1％接入灭菌的初始发酵液中37℃恒温摇床密封培养4天而成，该接种混合液在37℃和200rpm搅拌转速的条件下密封发酵4天，发酵液滤去残渣，得发酵滤液；

e.降压肽的纯化：将所得的发酵滤液采用孔径为0.2um的管式膜脱除大分子，然后采用截留分子量为3kDa的超滤膜截留分级，截留液采用纳滤膜浓缩脱盐，然后在185℃进风温度、80℃出风温度和0.4MPa喷雾压力的条件下喷雾干燥，得到降血压肽制品。

相比传统的蛋白酶水解法，本方法制备的降血压肽制品的得率提高了30％以上，制品中分子量小于1kDa的、含脯氨酸或羟脯氨酸残基的高活性降血压低聚肽的比例提高了35％以上。

Claims (3)

1.一种利用益生菌发酵海洋生物加工下脚料制备降血压肽的方法，其特征在于，经过如下具体的工艺步骤：

a.原料的选取与预处理：选取鱼皮、鱿鱼皮、鱼鳔或鱼鳞富含胶原蛋白的海洋生物加工下脚料为原料，清水洗净后捞出沥干水分，加入5～20倍体积的纯净水后使用打浆机进行打浆处理，得浆状物；

b.蛋白酶液化：将步骤a得到的浆状物加热至中心温度达到95～100℃，保持10min，灭除微生物，冷却到35～55℃，用NaOH和HCl调节pH到1～9，加入蛋白酶进行液化处理，其用量为海洋生物重量的1～10‰，酶解1～6h后，将液化液加热至中心温度达到95～100℃，保持10min，灭除酶活，得灭酶液化液；

c.初始发酵液的制备：在步骤b得到的灭酶液化液中，按重量百分数0.5～3％加入葡萄糖或蔗糖，用NaOH和HCl调节pH到6.5～7.5，得初始发酵液；

d.益生菌发酵：将步骤c得到的初始发酵液放入空消发酵罐进行实消，空消和实消的条件均为121℃、20min，待罐温降至37～42℃，接入益生菌液体发酵剂，该液体发酵剂是将益生菌种按重量百分数0.01～1％接入灭菌的初始发酵液中37～42℃恒温摇床密封培养2～4天而成，接种量是初始发酵液体积百分数的0.1～10％，该接种混合液在37～42℃和100～300rpm搅拌转速的条件下密封发酵2～5天，发酵液滤去残渣，得发酵滤液；

e-1.降压肽的粗制：在步骤d得到的发酵滤液中加入2～10％海藻糖、1～5％麦芽糊精、0.5～2％甘油冷冻保护剂，-80～-20℃预冻2～6h，然后在-50～-40℃冷阱温度和＜150Pa真空度的条件下冷冻干燥24～48h，直接得到含活性益生菌与活性肽的复合降血压生物制剂；

e-2.降压肽的进一步纯化：另外，步骤d得到的发酵滤液，还可进一步采用孔径为0.1～0.5um的管式膜脱除大分子，然后采用截留分子量为3kDa的超滤膜截留分级，截留液采用纳滤膜浓缩脱盐，然后在175～185℃进风温度、75～85℃出风温度和0.35～0.45MPa喷雾压力的条件下喷雾干燥，或者在-50～-40℃冷阱温度和＜150Pa真空度的条件下冷冻干燥24～48h，得到降血压肽制品。

2.根据权利要求1所述的一种利用益生菌发酵海洋生物加工下脚料制备降血压肽的方法，其特征在于，步骤b所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种利用益生菌发酵海洋生物加工下脚料制备降血压肽的方法，其特征在于，步骤d所述的益生菌种为植物乳杆菌、以及干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌中的一种或多种。