CN110016076A - 一种具有ace抑制活性的马面鱼皮胶原肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽，该胶原肽的氨基酸序列为Gly‑Val‑Gla，UPLC‑MS检测给出分子离子峰为[M]+329m/z。本发明还涉及一种上述胶原肽的制备方法，包括采用双酶混合水解、超滤、凝胶柱层析技术联用，整个制备过程简单易控，酶解效率高，且所得胶原肽安全无副作用、具有较高的ACE抑制活性，也具有较好的热稳定性，且该胶原肽经胃肠消化道消化后仍保持有较高的ACE抑制活性；另外，本发明制备胶原肽所采用的原料为加工废弃物鱼皮，有效避免了环境污染、提高了资源的利用率，本发明具有较高的实用价值以及商用价值。
Description
技术领域
本发明属于水产品加工综合利用领域，具体涉及一种具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽，本发明还涉及该马面鱼皮胶原肽的制备方法。
背景技术
目前高血压是一种常见的心血管疾病，严重影响着人类的健康。血压是在血管紧张素转化酶(ACE)作用下进行调节的，ACE催化不具活性的血管紧张素I转变为有收缩血管平滑肌活性、引起血压升高的血管紧张素II；另一方面，ACE可使具有血管舒张作用的舒缓激肽转化为没有活力的缓释肽。ACE抑制剂通过抑制ACE活性，阻断ACE引起的这两种生化反应过程，起到降压作用。ACE抑制剂是常用降压药物之一，如赖诺普利、卡托普利等，但是这些化学合成类的药物虽有缓解高血压症状的效果，却存在一定毒副作用，如咳嗽、皮疹、高血钾、头晕、血压过低等。源于天然蛋白质的具有ACE抑制活性的蛋白肽因其食用安全性高，无毒副作用，且对动物正常血压无降压作用等优点引起了人们广泛关注。
制备具有ACE抑制活性的蛋白肽的方法主要有化学降解法、酶降解法、化学合成法、微生物发酵法等，其中酶降解法条件温和、过程易控，采用食源性蛋白质制备得到的蛋白肽天然安全，极具发展前景，也是目前研究的热门方向之一。
水产加工过程中会产生大量鱼皮、鱼骨等副产物，直接丢弃不仅污染环境，也造成了资源的浪费。以马面鱼为例，鱼皮占8.5％～9.4％，皮厚且硬，不宜食用，但其含丰富的胶原蛋白，如能对其充分利用，通过酶法加工鱼皮胶原蛋白获得具有ACE抑制活性的胶原肽，将会取得显著的经济效益和社会效益，也为高值化开发水产加工副产物提供了新的途径。但是，现有技术中，以马面鱼皮为原料制备具有ACE抑制活性的胶原肽的工艺鲜见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供一种ACE抑制活性高、热稳定性好且经胃肠环境消化后仍能保持较高活性的马面鱼皮胶原肽。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种上述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，该方法将双酶混合水解技术与超滤、凝胶柱层析技术联合使用，科学合理、易于操作。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Gly-Val-Gla，UPLC-MS检测给出分子离子峰为[M]+329m/z。
一种上述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)马面鱼皮的前处理
将马面鱼皮洗净、绞碎，然后进行脱脂及除杂蛋白处理，处理完毕后对碎鱼皮进行清洗；
(2)马面鱼皮胶原蛋白的制备
步骤(1)最后所得碎鱼皮采用酸溶液浸泡、离心后收集上清液，向该上清液中加入NaCl后离心处理，将所得沉淀用酸溶液复溶，然后进行透析处理，所得溶液冷冻干燥后即为马面鱼胶原蛋白；
(3)胶原蛋白的双酶混合水解
将步骤(2)所得马面鱼胶原蛋白用缓冲液配制为溶液，采用Protease N Amano和胰蛋白酶在一定温度下混合水解，水解完毕后收集上清液备用；
(4)具有ACE抑制活性的胶原肽的分离
对步骤(3)所得上清液进行超滤，收集分子量小于5kDa的胶原肽组分，再用Sephadex G-15凝胶柱进行柱层析分离，收集在220nm下有吸收峰的组分，各组分进行ACE抑制活性检测，活性最高的组分经冷冻干燥后即得所述的具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽。
作为优选，步骤(1)的具体过程为：
将洗净、绞碎的马面鱼皮按固液重量比1:10～20加入体积浓度为5～15％的异丙醇中，浸泡脱脂10～20h后过滤除去异丙醇，用蒸馏水清洗滤渣后再将该滤渣按固液重量比1:5～10加入质量浓度为7～10％的NaCl溶液中，浸泡12～24h后过滤，所得滤渣用蒸馏水清洗后备用。
上述反应中，脱脂剂可选用正己烷、正丁醇、石油醚、异丙醇中的一种或多种，在相同的实验条件下，异丙醇的脱脂率最高，为62.45％；正丁醇次之，为44.97％；石油醚和正己烷分别为26.67％和26.61％。由此可见，异丙醇对鱼皮脱脂的影响最大，可作为脱脂溶剂。最优脱脂条件为：异丙醇浓度10％，料液比1:15，脱脂时间20h。因此在上述步骤中，脱脂剂的选择为最优选为异丙醇。
作为改进，步骤(2)的具体过程为：
将步骤(1)最后所得滤渣按固液重量比1:10～30加入浓度为0.1～0.5mol/L的乙酸中浸泡12～36h，然后在8000～10000r/min的条件下离心处理收集上清液；
向所得上清液中加入NaCl至NaCl质量浓度为6～9％，然后在8000～10000r/min的条件下离心处理，所得沉淀用0.4～0.6mol/L的酸溶液复溶后，透析24～30h，所得溶液冷冻干燥后即为马面鱼胶原蛋白。
本发明中所采用的的酸溶液可以为盐酸、乙酸、柠檬酸中的一种或多种，在相同的实验条件下，以胶原蛋白的提取量为指标，分别选用0.3M(mol/L)盐酸、乙酸、柠檬酸，料液比1:10，4℃下提取24h，以胶原蛋白得率为指标，从而确定最佳提取液。用盐酸、柠檬酸及乙酸提取时的得率分别为62.86、110.9和249.5mg/g，(提取条件：酸浓度0.38M，料液比1:30，时间33h，其得率为365.7mg/g)。因此在本发明中，酸溶液最优选为盐酸溶液。
再改进，步骤(3)的具体过程为：
用pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液将上述马面鱼皮胶原蛋白配成质量浓度为2～6％的溶液，然后加入Protease N Amano和胰蛋白酶，20～50℃下酶解2～7h得到水解液，将水解液沸水浴8～15min，冷却后在8000～10000r/min的条件下离心处理并收集上清液备用。
优选地，步骤(4)中收集220nm下有吸收峰的组分时，以pH为7.2的磷酸盐缓冲液为洗脱液，在0.2～0.3mL/min的流速下进行分离。
在上述方案中，所述Protease N Amano和胰蛋白酶的酶用量均≥1200U/g。
在上述方案中，所述的酶Protease NAmano生产厂家为日本Amano公司，胰蛋白酶生产厂家为北京Solarbio公司。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明的马面鱼皮胶原肽具有较高的ACE抑制活性，同时也具有较好的热稳定性，该胶原肽在20、40、60、80、100℃下分别保温2h后，对ACE的抑制活性均保持在91％以上；该胶原肽经胃消化道消化后其ACE抑制活性保持率为89.42％，经胃肠消化道消化后其ACE抑制活性保持率为79.76％，仍保持了较高的ACE抑制活性，因此，本发明中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽作为功能因子添加到健康食品、化妆品中具有较好应用前景；
(2)本发明采用双酶混合水解与超滤、凝胶柱层析联用，整个制备过程简单易控、酶解效率高，且所得具有ACE抑制活性的胶原肽安全无副作用；
(3)本发明所采用的原料为海洋低值鱼类马面鱼的加工废弃物，有效避免了环境污染、提高了资源利用率。
附图说明
图1为本发明中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的UPLC-MS图谱；
图2为本发明中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽对ACE的抑制作用图；
图3为温度对本发明中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的活性影响图；
图4为胃肠消化酶对本发明中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的活性影响图。:
具体实施方案
以下结合具体实施例，对本发明做进一步描述。
以下所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明要求的保护范围之内。
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
酶的选用、用量以及ACE肽分离条件的选择：
(1)酶解种类的选择
底物配置：用pH2.2、4.5、7、8、10五种不同的缓冲液分别配制浓度为1％的胶原蛋白溶液；
酶解工艺：1％胶原蛋白溶液至水浴锅中，加酶水解，沸水浴灭酶10min，迅速冷却，10000r/min离心15min，取上清液。
表1：不同酶水解对抑制率的影响
由表1可见，通过改变酶种类，对ACE抑制率的影响较大，本发明选用胰蛋白酶和Protease N“Amano”两种酶作为酶解所用酶。
(2)单酶用量、水解时间以及底物浓度的选择
以抑制率为指标，将筛选出的酶的最佳水解时间，酶用量，底物浓度确定出来。按照以下条件进行三组实验。
水解时间：(酶用量：2400U/g，底物浓度：1％)时间设置分别为1h、2h、3h、4h、5h
酶用量：(时间：2h，底物浓度1％)酶用量分别为1200U/g、2400U/g、3600U/g
底物浓度：(时间：2h，酶用量：2400U/g)底物浓度分别为1％、2％、3％、4％
ProteaseNAmano：酶解时间为4h时，水解液对ACE的抑制率达到最高，为48.84％。当酶用量为2400U/g时，其对ACE的抑制率最高，达到47.22％。当底物浓度为4％时，其对ACE的抑制率达到67.16％。
胰蛋白酶：当酶解时间为4h时，其对ACE的抑制率最高，达到47.58％。当酶用量为1200U/g时，其对ACE的抑制率最高，达到57.92％。当底物浓度为4％时，其对ACE的抑制率最高，达到57.54％。
(3)复合酶用量、水解时间以及底物浓度的选择
表2：不同条件下复合酶水解时间
由表2可见，Protease NAmano和胰蛋白酶复合水解的条件下，当Protease NAmano的用量2400U/g，胰蛋白酶的用量为1200U/g，水解液pH为8.0，水解时间6小时，水解温度40℃，底物浓度4％的条件下，酶解效果最好。而单酶水解得到的水解产物，在同等浓度条件下，没有复合酶水解的活性高。这说明复合水解模式往往比单个酶水解效果更好。
(4)ACE肽的分离
超滤：水解液离心取上清液，再过0.45μm滤膜，所得活性肽水解液再分别用10K、8K、5K超滤膜进行超滤，分管收集进行冷冻干燥。
a级分(<5K)得率为48.68％，b级分(5K～8K)得率为15.14％，c级分(8K～10K)得率为14.54％，d级分(>10K)得率为16.83％。其中a级分ACE抑制率最高，为45.55％。
凝胶柱层析：对超滤所得的a级分进行Sephadex G-15(2cm×50cm I.D.)凝胶柱层析分离纯化。分离条件为：流速0.3mL/min，上样浓度20mg/mL，上样量5mL，220nm检测，每3mL收集一管。得到a1、a2、a3三个组分，其中活性最大的a1组分就是本发明中所述的胶原肽。对ACE的IC50值为0.64mg/mL。
实施例1：
本实施例中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法包括以下步骤：
(1)马面鱼皮的前处理
马面鱼皮洗净、绞碎后，按固液重量比1:20加入体积浓度为5％的异丙醇中，浸泡脱脂10h后过滤除去异丙醇，用蒸馏水清洗滤渣后再将该滤渣按固液重量比1:5加入质量浓度为10％的NaCl溶液中，浸泡12h后过滤，所得滤渣用蒸馏水清洗后备用；
(2)马面鱼皮胶原蛋白的制备
将步骤(1)最后所得滤渣按固液重量比1:10加入浓度为0.5mol/L的乙酸中浸泡12h，然后在10000r/min的条件下离心处理收集上清液；向所得上清液中加入NaCl至NaCl质量浓度为6％，然后在8000r/min的条件下离心处理，所得沉淀用0.6mol/L的乙酸溶液复溶后，透析24h，所得溶液冷冻干燥后即为马面鱼胶原蛋白；
(3)胶原蛋白的双酶混合水解
将步骤(2)所得马面鱼胶原蛋白用磷酸缓冲液(pH 6.5)配制为6％的溶液，采用Protease N Amano和胰蛋白酶30℃下混合酶解3h，Protease N Amano和胰蛋白酶的酶用量分别为2000U/g、1600U/g，酶解液沸水浴10min，冷却后在10000r/min的条件下离心处理并收集上清液备用；
(4)具有ACE抑制活性的胶原肽的分离
对步骤(3)所得上清液进行超滤，收集分子量小于5kDa的胶原肽组分，再用Sephadex G-15凝胶柱层析，以pH为7.2的磷酸盐缓冲液为洗脱液，在0.2mL/min的流速下进行分离，收集在220nm下有吸收峰的组分，各组分进行ACE抑制活性检测，活性最高的组分经冷冻干燥后即得所述的具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽。
实施例2：
本实施例中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法包括以下步骤：
(1)马面鱼皮的前处理
马面鱼皮洗净、绞碎后，按固液重量比1:10加入体积浓度为15％的异丙醇中，浸泡脱脂20h后过滤除去异丙醇，用蒸馏水清洗滤渣后再将该滤渣按固液重量比1:10加入质量浓度为7％的NaCl溶液中，浸泡24h后过滤，所得滤渣用蒸馏水清洗后备用；
(2)马面鱼皮胶原蛋白的制备
将步骤(1)最后所得滤渣按固液重量比1:30加入浓度为0.1mol/L的乙酸中浸泡36h，然后在8000r/min的条件下离心处理收集上清液；向所得上清液中加入NaCl至NaCl质量浓度为9％，然后在10000r/min的条件下离心处理，所得沉淀用0.4mol/L的乙酸溶液复溶后，透析30h，所得溶液冷冻干燥后即为马面鱼胶原蛋白；
(3)胶原蛋白的双酶混合水解
将步骤(2)所得马面鱼胶原蛋白用磷酸缓冲液(pH 7.5)配制为2％的溶液，采用Protease N Amano和胰蛋白酶50℃下混合酶解5h，Protease N Amano和胰蛋白酶的酶用量分别为1600U/g、2000U/g，酶解液沸水浴15min，冷却后在8000r/min的条件下离心处理并收集上清液备用；
(4)具有ACE抑制活性的胶原肽的分离
对步骤(3)所得上清液进行超滤，收集分子量小于5kDa的胶原肽组分，再用Sephadex G-15凝胶柱层析，以pH为7.2的磷酸盐缓冲液为洗脱液，在0.3mL/min的流速下进行分离，收集在220nm下有吸收峰的组分，各组分进行ACE抑制活性检测，活性最高的组分经冷冻干燥后即得所述的具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽。
实施例3：
本实施例中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法包括以下步骤：、
(1)马面鱼皮的前处理
马面鱼皮洗净、绞碎后，按固液重量比1:15加入体积浓度为10％的异丙醇中，浸泡脱脂15h后过滤除去异丙醇，用蒸馏水清洗滤渣后再将该滤渣按固液重量比1:7加入质量浓度为8％的NaCl溶液中，浸泡18h后过滤，所得滤渣用蒸馏水清洗后备用；
(2)马面鱼皮胶原蛋白的制备
将步骤(1)最后所得滤渣按固液重量比1:20加入浓度为0.3mol/L的乙酸中浸泡24h，然后在9000r/min的条件下离心处理收集上清液；向所得上清液中加入NaCl至NaCl质量浓度为8％，然后在9000r/min的条件下离心处理，所得沉淀用0.5mol/L的乙酸溶液复溶后，透析28h，所得溶液冷冻干燥后即为马面鱼胶原蛋白；
(3)胶原蛋白的双酶混合水解
将步骤(2)所得马面鱼胶原蛋白用磷酸缓冲液(pH 8)配制为4％的溶液，采用Protease N Amano和胰蛋白酶40℃下混合酶解6h，Protease N Amano和胰蛋白酶的酶用量分别为1200U/g、2400U/g，酶解液沸水浴12min，冷却后在9000r/min的条件下离心处理并收集上清液备用；
(4)具有ACE抑制活性的胶原肽的分离
对步骤(3)所得上清液进行超滤，收集分子量小于5kDa的抗氧化肽组分，再用Sephadex G-15凝胶柱层析，以pH为7.2的磷酸盐缓冲液为洗脱液，在0.25mL/min的流速下进行分离，收集在220nm下有吸收峰的组分，该组分经冷冻干燥后即得马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。
如图1所示，本发明实施例制备的具有ACE抑制活性的胶原肽分子离子峰为[M]+329.2m/z，2个碎片离子峰分别为272.2m/z([M-57]+)、173.1m/z([M-57-99.1]+)，碎片离子峰173.1m/z([M-57-99.1]+)推测为Gla残基，碎片离子峰272.2m/z([M-57]+)推测为失去一个Gly残疾形成的，173.1m/z([M-57-99.1]+)又是在此基础上失去一个Val残疾形成的，即即本发明制备的物质为三肽，其氨基酸序列为Gly-Val-Gla。
对上述制备的胶原肽进行ACE抑制实验，以此来判断其ACE抑制活性。具体的，将得到的胶原肽配制成不同浓度的溶液，分别向样品管和空白管加入5μL 0.1UACE溶液，接着向样品管加入10μL样品液，空白管10μL缓冲液，37℃温浴5min后加入50μL 6mmol/LHHL(马尿酰-组氨酸-亮氨酸)溶液，于37℃恒温水浴锅中反应30min，加入85μL 1.0mol/LHCl中止反应，得到反应液。用0.22μm有机滤膜过滤后进行HPLC分析，通过测定马尿酸的生成量来评价样品对ACE活性的抑制。
色谱条件：采用SunfireTM C18(150*4.6I.D.,5μm)色谱柱。流动相A：乙腈，B：含0.05％(v/v)三氟乙酸和0.1％(v/v)三乙胺的超纯水；洗脱条件：等度洗脱(A/B，25/75，v/v)；流速：0.5mL/min；检测波长：228nm；进样量：20μL。
计算公式为：
式中：R：样品对ACE的抑制率(％)；A：空白组中马尿酸的峰面积；B：样品组中马尿酸的峰面积。
IC50值为待测物对ACE活性抑制率达到50％时的浓度，根据所测定的各浓度样品对ACE活性抑制率，绘制抑制率与样品浓度的标准曲线，得出拟合方程，再根据方程计算出清除率为50％时样品的浓度，即为IC50值。
如图2所示，本发明所得胶原肽对ACE的IC50值为0.64mg/mL，显示了较高的ACE抑制活性。
对本发明制备的胶原肽在不同温度下ACE抑制活性保持率进行了测试，将胶原肽在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃下分别保温2h，如图3所示，结果表明，该胶原肽ACE抑制活性保持率均在91％以上，显示了较好的热稳定性。
本发明模拟了体外胃肠消化道酶对胶原肽ACE抑制活性的影响情况，如图4所示，结果表明，本发明制备的胶原肽经胃消化道消化后其ACE抑制活性保持率为89.42％，经胃肠消化道消化后其ACE抑制活性保持率为79.76％，均保持了较高的ACE抑制活性。
上述各实施例中的酶Protease NAmano生产厂家为日本Amano公司，胰蛋白酶生产厂家为北京Solarbio公司。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽，其特征在于，所述胶原肽的氨基酸序列为Gly-Val-Gla，UPLC-MS检测给出分子离子峰为[M]+329m/z。
2.一种制备权利要求1所述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)马面鱼皮的前处理
将马面鱼皮洗净、绞碎，然后进行脱脂及除杂蛋白处理，处理完毕后对碎鱼皮进行再次清洗；
(2)马面鱼皮胶原蛋白的提取
将步骤(1)最后所得碎鱼皮采用酸溶液浸泡，离心后收集上清液，向该上清液中加入NaCl后再次离心处理，将所得沉淀用酸溶液复溶，然后进行透析处理，所得溶液冷冻干燥后即为马面鱼皮胶原蛋白；
(3)胶原蛋白的双酶混合水解
将步骤(2)所得马面鱼胶原蛋白用缓冲液配制为溶液，加入Protease N Amano和胰蛋白酶进行混合水解，水解完毕后收集上清液备用；
(4)具有ACE抑制活性的胶原肽的分离
对步骤(3)所得上清液进行超滤，收集分子量小于5kDa的胶原肽组分，再用SephadexG-15凝胶柱进行柱层析分离，收集在220nm下有吸收峰的组分，各组分进行ACE抑制活性检测，收集活性最高的组分，经冷冻干燥后即得所述的具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽。
3.根据权利要求2所述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体过程为：
将洗净、绞碎的马面鱼皮与体积浓度为5～15％的脱脂剂按固液重量比1:10～20的比例混合，浸泡脱脂10～20h后过滤除去脱脂剂，用蒸馏水清洗滤渣后，再将该滤渣按固液重量比1:5～10加入质量浓度为7～10％的NaCl溶液中，浸泡12～24h后过滤，所得滤渣用蒸馏水清洗后备用。
4.根据权利要求2所述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，其特征在于步骤(2)的具体过程为：
将步骤(1)最后所得滤渣按固液重量比1:10～30加入浓度为0.1～0.5mol/L的酸溶液中浸泡12～36h，然后在8000～10000r/min的条件下离心处理收集上清液；
向所得上清液中加入NaCl至NaCl的质量浓度为6～9％，然后在8000～10000r/min的条件下对溶液进行离心处理，将所得沉淀用0.4～0.6mol/L的酸溶液复溶后，透析24～30h，待所得溶液冷冻干燥后即得马面鱼皮胶原蛋白。
5.根据权利要求2所述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，其特征在于步骤(3)的具体过程为：
用pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液将上述马面鱼皮胶原蛋白配成质量浓度为2～6％的溶液，然后加入Protease N Amano和胰蛋白酶，20～50℃下酶解2～7h得到水解液，将水解液沸水浴8～15min，冷却后在8000～10000r/min的条件下离心处理并收集上清液备用。
6.根据权利要求2所述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，在收集220nm下有吸收峰的组分时，采用pH为7.2的磷酸盐缓冲液为洗脱液，并在0.2～0.3mL/min的流速下进行分离。
7.根据权利要求2所述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，Protease N Amano和胰蛋白酶的酶用量均≥1200U/g。
8.根据权利要求2所述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，酸溶液为乙酸。
9.根据权利要求3所述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，其特征在于：所述的脱脂剂为异丙醇。
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