CN112094881B - 稳定型钙离子螯合肽的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了稳定型钙离子螯合肽的制备方法与应用，属于植物源生物活性肽技术领域。本发明以黑豆蛋白为原料，利用蛋白酶解技术建立钙离子螯合肽的制备工艺，后通过构建高效液相色谱(HPLC)指纹图谱分离得到水解液中活性较强的共有肽段组分。本发明方法所制备得到的钙离子螯合肽成分稳定、安全天然、得率高，有望发展成为一种新型的钙营养补充剂，且为黑豆蛋白的应用提供了新的思路和方向。

Description

稳定型钙离子螯合肽的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及稳定型钙离子螯合肽的制备方法与应用，属于植物源生物活性肽技术领域。
背景技术
钙是人体中含量最丰富的常量元素(1.5％～2.2％)，其在骨骼生长、凝血、神经传导、肌肉收缩等方面发挥着重要的作用。钙摄入不足会导致多种疾病，如骨质疏松症、佝偻病、软骨病等。日常饮食是摄入钙的主要途径，但在肠道的碱性环境下，离子形式的钙容易与磷酸盐等形成不溶性沉淀，从而降低了其吸收效率和生物利用度。钙摄入不足是我国人群普遍面临的问题，仅凭日常饮食结构的调整并不能有效地提高摄入水平，因此，钙营养强化剂的研究和推广显得尤为重要。
近年来，食源性的钙离子螯合肽成为了钙营养补充剂的研究热点。与其他钙产品相比，钙离子螯合肽结构稳定、吸收率高、安全性好且价格低廉，是一种极具发展潜力的钙营养补充剂。酪蛋白磷酸肽是最早被报道研究的钙离子螯合肽，之后，从谷物、动物骨骼、海产品等多种来源的蛋白中都分离得到了具备钙离子螯合能力的活性肽。黑豆蛋白是一种优质的植物蛋白资源，其蛋白含量高(可达40％)，且其中两种利于金属离子螯合的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)含量丰富。目前，已从黑豆蛋白中分离出抗氧化肽、降血压肽等多种生物活性肽，但从中制备钙离子螯合肽的相关研究甚少。
现有研究中，钙离子螯合肽的分离主要依靠超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱等多种分离技术联用的方法，这些操作手段繁琐费时，且存在着重复性差、易受制样过程干扰、得率低等缺点，因而难以得到成分确定的稳定型组分。因此，建立快速、节约、重复性强且得率高的用于分离活性肽的方法十分必要。基于此，充分利用黑豆蛋白资源并从中分离得到成分稳定且活性强的钙离子螯合肽具有重要意义。
发明内容
[技术问题]
现有技术中已从黑豆蛋白中分离出抗氧化肽、降血压肽等多种生物活性肽，但从中制备钙离子螯合肽的相关研究甚少。此外，钙离子螯合肽的分离主要依靠超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱等多种分离技术联用的方法，这些操作手段繁琐费时，且存在着重复性差、易受制样过程干扰、得率低等缺点，因而难以得到成分确定的稳定型组分。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种制备稳定型钙离子螯合肽的方法，本发明以黑豆为原料，通过蛋白酶解技术制备钙离子螯合肽，而后又通过构建HPLC指纹图谱分离得到其中活性高、成分稳定的共有组分，从而最终得到了稳定的钙离子螯合肽。
本发明提供了一种制备钙离子螯合肽的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)黑豆蛋白提取：利用碱溶酸沉法提取黑豆中的蛋白质；
(2)物理场预处理：将步骤(1)中得到的蛋白粉进行物理场预处理，物理场预处理的方法包括热处理或超声处理；
(3)黑豆蛋白水解液的制备：将步骤(2)中处理后的蛋白配制成质量分数为1％～10％的蛋白溶液，调节溶液pH值，然后加入蛋白酶，保温震荡反应，反应结束后水解液经水浴灭酶、冷却，调节溶液pH至中性后离心取上清液，上清液经滤膜过滤，即得到含钙离子螯合肽的黑豆蛋白水解液；
(4)HPLC指纹图谱的构建：按照步骤(3)中制备黑豆蛋白水解液的方法，制备不同水解条件下的黑豆蛋白水解液，利用高效液相色谱技术对不同的黑豆蛋白水解液进行分离纯化，得到共有成分峰，收集各共有成分峰的物质，后经氮吹、脱盐、冷冻干燥的处理，即得到稳定型钙离子螯合肽，所述稳定型钙离子螯合肽是指在不同条件下制备的水解液中成分稳定、且具备较强钙离子螯合能力的肽组分。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述碱溶酸沉法具体为：黑豆粉脱脂后加入碱液搅拌1～2h，然后经离心收集上清液，向上清液中加入酸调节pH值至4～5以沉降蛋白质，后经离心取蛋白质沉淀，重悬、冻干得到黑豆分离蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述碱液包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠中的任意一种或几种。
在本发明的一种实施方式中，用于调节pH的酸为盐酸、硫酸、醋酸、乳酸中的任意一种或几种。
在本发明的一种实施方式中，收集上清液的离心条件为：转速5000～10000rpm/min，离心时间10～30min。
在本发明的一种实施方式中，离心取蛋白质沉淀中离心条件为：转速5000～10000rpm/min，离心时间10～30min。
在本发明的一种实施方式中，蛋白质沉淀重悬于去离子水中于-80～-20℃冷冻，后经冷冻干燥去除水分，其冷冻干燥的条件为真空度1～30Pa，温度为-100～-70℃，冻干时间为1～3d。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述物理场预处理的方法包括：采用微波、红外、烘箱等热处理手段，处理温度为100～150℃，处理时间为10～30min；采用超声处理，其处理功率为70～100Hz，处理时间为10～30min。通过物理场预处理，破坏其分子间作用力使蛋白结构变性，以增大酶解效率、获得有效肽段。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述蛋白酶为碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述蛋白酶为无花果蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中蛋白酶的用量为：占蛋白质量的1％～5％。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶时，水解温度为45～65℃，pH为8.0～10.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为菠萝蛋白酶时，水解温度为45～65℃，pH为6.0～8.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为无花果蛋白酶时，水解温度为50～70℃，pH为5.0～7.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为胰蛋白酶时，水解温度为25～45℃，pH为7.0～9.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为胰酶时，水解温度为25～40℃，pH为7.0～9.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为风味蛋白酶时，水解温度为45～65℃，pH为6.0～8.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为木瓜蛋白酶时，水解温度为45～65℃，pH为6.0～8.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为胃蛋白酶时，水解温度25～45℃，pH为1.0～3.0，水解时间为1～8小时。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中的水解液于95～100℃的水浴中加热10～20min灭酶，调节酶解液pH至中性，后于5000～10000rpm/min的条件下离心10～30min，收集到的水解液经0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中HPLC的条件参数为：色谱柱为C18柱；流动相为0.1％(v/v)三氟乙酸/水和0.1％(v/v)三氟乙酸/乙腈，采用二元梯度洗脱，其中三氟乙酸/乙腈浓度变化范围为5％～95％；进样体积为10μL，流速为1.0mL/min，柱温设定为30℃，检测波长为220nm。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中收集各共有成分峰的物质的方法为：收集经检测器流出的各组分峰，后经氮吹、脱盐、冷冻干燥得到组分物质。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中得到的钙离子螯合肽采用LC-MS/MS鉴定组分中的活性序列。
本发明提供了一种制备稳定型钙离子螯合肽的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)黑豆蛋白提取：利用碱溶酸沉法提取黑豆中的蛋白质；
(2)物理场预处理：将步骤(1)中得到的蛋白粉进行物理场预处理，物理场预处理的方法包括热处理或超声处理；
(3)黑豆蛋白水解液的制备：将步骤(2)中处理后的蛋白配制成质量分数为5％的蛋白溶液，调节溶液pH值为5.2～6.44，然后加入1～2％的无花果蛋白酶，于65～70℃下保温震荡反应，反应结束后水解液经水浴灭酶、冷却，调节溶液pH至中性后离心取上清液，上清液经滤膜过滤，即得到含钙离子螯合肽的黑豆蛋白水解液；
(4)HPLC指纹图谱的构建：利用高效液相色谱技术对步骤(3)制备的黑豆蛋白水解液进行分离纯化，收集保留时间为4.8～5.8min的组分，后经氮吹、脱盐、冷冻干燥的处理，即得到稳定型钙离子螯合肽。
本发明提供了上述方法制备得到的钙离子螯合肽，所述钙离子螯合肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4所示。
本发明提供了上述钙离子螯合肽在食品领域的应用。
[有益效果]：
(1)本发明采用酶解法制备活性多肽，该方法反应条件温和、可控性强、安全性好、成本较低，可实现工业化规模生产，为开发新型钙类营养补充剂奠定基础。制得的蛋白水解液具备较强的钙离子螯合活性，可达77.54μg/mg。
(2)本发明通过构建HPLC指纹图谱对水解液进行分离纯化，经分离后，组分的钙螯合活性进一步提高，可达101.45μg/mg，得率为传统分离方法的3～5倍；所得组分的活性序列稳定性高，可避免制样过程等外界条件造成的活性成分上的差异。
(3)本发明以脱脂后的黑豆加工副产物为原料制备钙离子螯合肽，实现了油料加工副产物的再利用，减少了有效资源的浪费，可以提高该类资源的附加值，具有重要的应用价值和社会经济效益。
附图说明
图1为实施例1中黑豆肽HPLC指纹图谱。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
钙离子螯合能力的测定方法以及黑豆肽指纹图谱的构建方法具体如下：
1、采用邻甲酚酞络合比色法测定钙离子螯合能力，其具体测定方法如下：
①钙结合实验所需试剂：
0.2M、pH 8.0磷酸盐缓冲液：称取0.146g一水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)和6.78g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)溶于去离子水中，后定容至100mL；
5mM CaCl2溶液：称取0.2775g无水氯化钙，并用去离子水定容至500mL。
②邻甲酚酞络合比色法所需试剂：
乙醇胺-硼酸盐缓冲液：3.6g硼酸与10mL去离子水及10mL乙醇胺混合，轻轻摇晃至乙醇胺完全溶解，后用乙醇胺定容至100mL；
邻甲酚酞溶液：称取80mg邻甲酚酞络合剂，并与25mL去离子水和0.5mL、1M KOH溶液混合，完全溶解后加入0.5mL冰乙酸，后用去离子水定容至100mL；
8-羟基喹啉溶液：5.0g 8-羟基喹啉溶于95％乙醇中，后用95％乙醇定容至100mL；
400μg/mL钙标准溶液：CaCO3于105℃烘干4h，冷却至室温后称取0.1g CaCO3溶于0.5M、5mL HCl，后使用去离子水定容至100mL；
10μg/mL钙标准工作溶液：取2.5mL钙标准溶液定容至100mL；
工作显色液：取6mL乙醇胺-硼酸盐缓冲液、1.8mL 8-羟基喹啉溶液、6mL邻甲酚酞溶液混合，并用去离子水定容至100mL(工作液在室温下稳定一天，需现配现用)。
③钙标准曲线的制作：取钙标准工作液(10μg/mL)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于离心管中，后分别加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mL的去离子水，之后加入5mL工作显色液，混合均匀后测定混合液在570nm处的吸光度值并绘制标准曲线。
④样品钙螯合能力的测定：1mL、5mM的CaCl2溶液和2mL、0.2M、pH 8.0磷酸盐缓冲液混合并加入1mL、1mg/mL的蛋白水解液，置于37℃反应2h，后于10000rpm/min离心10min。上清液与工作显色液以1:5的体积比混合均匀，并测定其在570nm处的吸光度值，后计算上清液中可溶性的钙结合量。
2、黑豆肽指纹图谱的构建：
①样品制备：水解液样品浓度均调整至10mg/mL，后用0.22μm微孔滤膜过滤。
②：HPLC条件参数：
色谱柱：Venusil MP-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相A：0.1％(v/v)三氟乙酸/水；流动相B：0.1％(v/v)三氟乙酸/乙腈；
进样体积：10μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：220nm。
时间程序：0～15min，流动相B 5％～15％；15～30min，流动相B15％～40％；30～50min，流动相B 40％～70％；50～60min，流动相B 70％～95％。
【实施例1】
(1)黑豆蛋白提取：黑豆粉经正己烷脱脂后，以1:8(g/mL)的比例分散于去离子水中，并以1M NaOH调节混合液pH至8.0，在室温下搅拌2h后，于8000rpm/min的条件下离心20min以得到上清液，后以1M HCl调节上清液pH至4.5以沉降蛋白质，而后在8000rpm/min的条件下离心15min以收集蛋白质沉淀，重悬于去离子水后于-80℃冷冻成固态，后于1Pa，-70℃的条件下冷冻干燥3天，得到的固体粉末即为黑豆分离蛋白。
(2)黑豆蛋白水解液的制备：将冻干得到的黑豆蛋白粉进行红外预处理，处理温度100℃，时间20min；后制备5％(w/v,5g蛋白溶于100mL水)的黑豆蛋白溶液，并以1M NaOH和1M HCl调节pH至5.7，后加入2％(w/w，每克蛋白加0.02g蛋白酶)的无花果蛋白酶，于65℃反应4h，后将反应液置于95℃水浴中灭酶10min，迅速冷却至室温后调节溶液pH至7.0，后以8000rpm/min离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤后于-20℃保存。
参照上文钙离子螯合能力的测定方法，测得水解液钙离子螯合能力为27.34μg/mg。
(3)水解条件的优化
参照上述实验，采用响应面设计对酶解时间、温度、pH、酶浓度等参数进行优化。具体结果如表1所示。
表1水解反应参数的优化结果
Figure BDA0002670293040000061
Figure BDA0002670293040000071
经响应面拟合后，优化结果显示，最优水解条件为pH 6.2，酶浓度1.61％，温度70℃，时间3h，该条件下水解液的钙离子螯合能力为77.54μg/mg。
(4)钙离子螯合肽的分离及鉴定
优选步骤(3)表1中钙螯合能力最强的11组水解液(试验号为14、24、21、25、16、13、20、15、19、12、26)，调整浓度至10mg/mL，后用0.22μm微孔滤膜过滤。将这11组样品上样于Venusil MP-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，其具体条件参数如下：
流动相A：0.1％(v/v)三氟乙酸/水；流动相B：0.1％(v/v)三氟乙酸/乙腈；
进样体积：10μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：220nm；
时间程序：0～15min，流动相B 5％～15％；15～30min，流动相B15％～40％；30～50min，流动相B 40％～70％；50～60min，流动相B 70％～95％。
图1为实施例1中黑豆肽HPLC指纹图谱，其中R为对照谱图，S1～S11分别对应表1中试验号为14、24、21、25、16、13、20、15、19、12、26这11组样品的谱图，各谱图保留时间相近的共有特征峰即为11组样品中组成相似、成分稳定的共有组分。
收集经检测器流出的各组分峰，后经氮吹、脱盐、冷冻干燥等得到各组分物质，并参照上文方法测定各组分的钙离子螯合能力，后测定螯合能力最强的组分中的氨基酸序列。本实施例中，保留时间为4.8～5.8min的组分螯合活性最强，测定其钙螯合能力为101.45μg/mg，收集该时间段的组分，组分得率为5.8％；后采用LC-MS/MS测定组分的氨基酸序列，得到共有的组分的氨基酸序列为：
Lys-Asp-Gly-Val-Gly-Gln-Glu-Pro-Val-His-Leu-Glu(KDGVGQEPVHLE,SEQ IDNo.1)；
Val-Asn-Pro-Lys-Asp-His-Asp-Lys-Pro-Val-Gln(VNPKDHDKPVQ,SEQ ID No.2)；
Glu-Asn-Leu-Pro-Glu-Glu-Pro-Pro-Gln(ENLPEEPPQ,SEQ ID No.3)；
Thr-Val-Val-Pro-Thr(TVVPT,SEQ ID No.4)。
【实施例2】
(1)黑豆蛋白提取：与实施例步骤(1)相同；
(2)黑豆蛋白水解液的制备：将步骤(2)中红外预处理的方式改变为超声处理，处理条件为100Hz，30min，其他过程及条件不变。
参照上文钙离子螯合能力的测定方法，测得水解液钙离子螯合能力为22.46μg/mg。
【实施例3】
(1)黑豆蛋白提取：与实施例步骤(1)相同；
(2)黑豆蛋白水解液的制备：将步骤(2)中红外预处理的方式改变为烘箱预处理，处理条件为100℃，20min，其他过程及条件不变。
参照上文钙离子螯合能力的测定方法，测得水解液钙离子螯合能力为20.26μg/mg。
【实施例4】
(1)黑豆蛋白提取：与实施例步骤(1)相同；
(2)黑豆蛋白水解液的制备：将步骤(2)中红外预处理的方式改变为水浴处理，处理条件为95℃，20min，其他过程及条件不变。
参照上文钙离子螯合能力的测定方法，测得水解液钙离子螯合能力为21.37μg/mg。
【对比例1】
将实施例1中最优条件下(pH 6.2，酶浓度1.61％，温度70℃，时间3h)制备得到的反应液冷冻干燥，后配制成20mg/mL的溶液，上样于Sephadex G-15柱，用超纯水进行洗脱，流速为1.0mL/min。检测器波长设定为220nm，并收集洗脱时间为85～110min的组分。
将上一步收集的组分冷冻干燥，后配置成10mg/mL的溶液上样于Venusil MP-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，用流动相A(0.1％三氟乙酸/水)及流动相B(0.1％三氟乙酸/乙腈)进行洗脱；洗脱程序为0～40min，流动相B为0～40％；流速为1.0mL/min，检测器波长设定为220nm。
收集24～25min的组分，其钙离子螯合活性为87.24μg/mg，组分得率为1.4％。这是由于多步分离富集作用较弱，螯合能力及得率较低。
【实施例5】
(1)黑豆蛋白提取：与实施例步骤(1)相同；
(2)黑豆蛋白水解液的制备：将冻干得到的黑豆蛋白粉进行红外预处理，处理温度100℃，时间20min；后制备5％(w/v)的黑豆蛋白溶液，并以1M NaOH和1M HCl调节pH至7.0，后加入2％(w/w)的菠萝蛋白酶，于55℃反应4h，后将反应液置于95℃水浴中灭酶10min，迅速冷却至室温后调节溶液pH至7.0，后以8000rpm/min离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤后于-20℃保存。
参照上文钙离子螯合能力的测定方法，测得水解液钙离子螯合能力为18.05μg/mg。
【实施例6】
(1)黑豆蛋白提取：与实施例步骤(1)相同；
(2)黑豆蛋白水解液的制备：将冻干得到的黑豆蛋白粉进行红外预处理，处理温度100℃，时间20min；后制备5％(w/v)的黑豆蛋白溶液，并以1M NaOH和1M HCl调节pH至8.5，后加入2％(w/w)的胰蛋白酶，于37℃反应4h，后将反应液置于95℃水浴中灭酶10min，迅速冷却至室温后调节溶液pH至7.0，后以8000rpm/min离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤后于-20℃保存。
参照上文钙离子螯合能力的测定方法，测得水解液钙离子螯合能力为15.19μg/mg。
【实施例7】
(1)黑豆蛋白提取：与实施例步骤(1)相同；
(2)黑豆蛋白水解液的制备：将冻干得到的黑豆蛋白粉进行红外预处理，处理温度100℃，时间20min；后制备5％(w/v)的黑豆蛋白溶液，并以1M NaOH和1M HCl调节pH至8.5，后加入2％(w/w)的碱性蛋白酶，于55℃反应4h，后将反应液置于95℃水浴中灭酶10min，迅速冷却至室温后调节溶液pH至7.0，后以8000rpm/min离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤后于-20℃保存。
参照上文钙离子螯合能力的测定方法，测得水解液钙离子螯合能力为22.43μg/mg。
【实施例8】
(1)黑豆蛋白提取：与实施例步骤(1)相同；
(2)黑豆蛋白水解液的制备：将冻干得到的黑豆蛋白粉进行红外预处理，处理温度100℃，时间20min；后制备5％(w/v)的黑豆蛋白溶液，并以1M NaOH和1M HCl调节pH至7.0，后加入2％(w/w)的木瓜蛋白酶，于55℃反应4h，后将反应液置于95℃水浴中灭酶10min，迅速冷却至室温后调节溶液pH至7.0，后以8000rpm/min离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤后于-20℃保存。
参照上文钙离子螯合能力的测定方法，测得水解液钙离子螯合能力为19.54μg/mg。
【实施例9】
(1)黑豆蛋白提取：与实施例步骤(1)相同；
(2)黑豆蛋白水解液的制备：将冻干得到的黑豆蛋白粉进行红外预处理，处理温度100℃，时间20min；后制备5％(w/v)的黑豆蛋白溶液，并以1M NaOH和1M HCl调节pH至8.0，后加入2％(w/w)的风味蛋白酶，于50℃反应4h，后将反应液置于95℃水浴中灭酶10min，迅速冷却至室温后调节溶液pH至7.0，后以8000rpm/min离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤后于-20℃保存。
参照上文钙离子螯合能力的测定方法，测得水解液钙离子螯合能力为16.89μg/mg。
【实施例10】
(1)黑豆蛋白提取：与实施例步骤(1)相同；
(2)黑豆蛋白水解液的制备：将冻干得到的黑豆蛋白粉进行红外预处理，处理温度100℃，时间20min；后制备5％(w/v)的黑豆蛋白溶液，并以1M NaOH和1M HCl调节pH至2.0，后加入2％(w/w)的胃蛋白酶，于37℃反应4h，后将反应液置于95℃水浴中灭酶10min，迅速冷却至室温后调节溶液pH至7.0，后以8000rpm/min离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤后于-20℃保存。
参照上文钙离子螯合能力的测定方法，测得水解液钙离子螯合能力为14.37μg/mg。
【实施例11】
(1)黑豆蛋白提取：与实施例步骤(1)相同；
(2)黑豆蛋白水解液的制备：将冻干得到的黑豆蛋白粉进行红外预处理，处理温度100℃，时间20min；后制备5％(w/v)的黑豆蛋白溶液，并以1M NaOH和1M HCl调节pH至8.0，后加入2％(w/w)的胰酶，于37℃反应4h，后将反应液置于95℃水浴中灭酶10min，迅速冷却至室温后调节溶液pH至7.0，后以8000rpm/min离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤后于-20℃保存。
参照上文钙离子螯合能力的测定方法，测得水解液钙离子螯合能力为12.59μg/mg。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 稳定型钙离子螯合肽的制备方法与应用
<130> BAA200759A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Lys Asp Gly Val Gly Gln Glu Pro Val His Leu Glu
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Val Asn Pro Lys Asp His Asp Lys Pro Val Gln
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Glu Asn Leu Pro Glu Glu Pro Pro Gln
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Thr Val Val Pro Thr
1 5

Claims (9)

1.一种制备稳定型钙离子螯合肽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)黑豆蛋白提取：利用碱溶酸沉法提取黑豆中的蛋白质；
(2)物理场预处理：将步骤(1)中得到的蛋白粉进行物理场预处理，物理场预处理的方法包括热处理或超声处理；
(3)黑豆蛋白水解液的制备：将步骤(2)中处理后的蛋白配制成质量分数为1％～10％的蛋白溶液，调节溶液pH值，然后加入蛋白酶，保温震荡反应，反应结束后水解液经水浴灭酶、冷却，调节溶液pH至中性后离心取上清液，上清液经滤膜过滤，即得到含钙离子螯合肽的黑豆蛋白水解液；
(4)HPLC指纹图谱的构建：按照步骤(3)中制备黑豆蛋白水解液的方法，制备不同水解条件下的黑豆蛋白水解液，利用高效液相色谱技术对不同的黑豆蛋白水解液进行分离纯化，得到共有成分峰，收集各共有成分峰的物质，后经氮吹、脱盐、冷冻干燥的处理，即得到稳定型钙离子螯合肽；
所述钙离子螯合肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述碱溶酸沉法具体为：黑豆粉脱脂后加入碱液搅拌1～2h，然后经离心收集上清液，向上清液中加入酸调节pH值至4～5以沉降蛋白质，后经离心取蛋白质沉淀，重悬、冻干得到黑豆蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述物理场预处理的方法包括：采用热处理手段微波、红外、烘箱，处理温度为100～150℃，处理时间为10～30min；采用超声处理，其处理功率为70～100Hz，处理时间为10～30min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述蛋白酶为碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为碱性蛋白酶时，水解温度为45～65℃，pH为8.0～10.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为菠萝蛋白酶时，水解温度为45～65℃，pH为6.0～8.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为无花果蛋白酶时，水解温度为50～70℃，pH为5.0～7.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为胰蛋白酶时，水解温度为25～45℃，pH为7.0～9.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为胰酶时，水解温度为25～40℃，pH为7.0～9.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为风味蛋白酶时，水解温度为45～65℃，pH为6.0～8.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为木瓜蛋白酶时，水解温度为45～65℃，pH为6.0～8.0，水解时间为1～8小时；所述蛋白酶为胃蛋白酶时，水解温度25～45℃，pH为1.0～3.0，水解时间为1～8小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述蛋白酶为无花果蛋白酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中高效液相色谱技术中使用的色谱柱为C18柱。
8.一种制备稳定型钙离子螯合肽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)黑豆蛋白提取：利用碱溶酸沉法提取黑豆中的蛋白质；
(2)物理场预处理：将步骤(1)中得到的蛋白粉进行物理场预处理，物理场预处理的方法包括热处理或超声处理；
(3)黑豆蛋白水解液的制备：将步骤(2)中处理后的蛋白配制成质量分数为5％的蛋白溶液，调节溶液pH值为5.2～6.44，然后加入1～2％的无花果蛋白酶，于65～70℃下保温震荡反应，反应结束后水解液经水浴灭酶、冷却，调节溶液pH至中性后离心取上清液，上清液经滤膜过滤，即得到含钙离子螯合肽的黑豆蛋白水解液；
(4)HPLC指纹图谱的构建：利用高效液相色谱技术对步骤(3)制备的黑豆蛋白水解液进行分离纯化，收集保留时间为4.8～5.8min的组分，后经氮吹、脱盐、冷冻干燥的处理，即得到稳定型钙离子螯合肽；
所述钙离子螯合肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3所示。
9.权利要求1～8任一项所述方法制备得到的钙离子螯合肽在食品领域的应用。
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