KR20080034712A

KR20080034712A - 대두 발효 조성물의 제조방법 및 이 조성물

Info

Publication number: KR20080034712A
Application number: KR1020060100997A
Authority: KR
Inventors: 이현규; 노신정; 정용일; 이대희
Original assignee: 한양대학교 산학협력단; 샘표식품 주식회사
Priority date: 2006-10-17
Filing date: 2006-10-17
Publication date: 2008-04-22

Abstract

대두 발효 조성물 및 그 제조방법과 이 조성물로부터 정제한 펩타이드가 개시되어 있다. 본 발명의 대두 발효 조성물은 대두를 고온에서 단기간 발효시켜 제조되는 것으로 항산화 활성, 항균 활성, 암세포 독성 및 항고혈압 활성을 가진다. 또한, 이 대두 발효 조성물로부터 정제된 펩타이드는 높은 ACE 저해 활성을 가지므로 고혈압 예방이나 치료를 위한 건강기능식품 및 의약품 원료로 사용될 수 있다.

대두 발효 조성물, 고온 단기 발효, ACE 저해 펩타이드

Description

대두 발효 조성물의 제조방법 및 이 조성물로부터 유래된 펩타이드 {Method of preparating composition comprising fermented soybean and peptide derived therefrom}

도 1은 레닌-안지오텐신계 (RAS, renin-angiotensin system)와 칼리크레인-키닌계 (KKS)에서 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE, angiotensin-I converting enzyme)의 작용을 나타내는 순서도.

도 2는 본 발명의 대두 발효 조성물 (STFS)의 제조방법의 순서도.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 대두 발효 조성물 (STFS)의 DPPH의 흡수율 변화를 나타내는 그래프.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 대두 발효 조성물 (STFS)의 DPPH 라디칼 소거율을 나타내는 그래프.

도 5는 TBA 방법에 의해 측정된 리놀릭산 (linolic acid)의 자동 산화 시스템에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 대두 발효 조성물 (STFS)의 항산화 활성도를 나타내는 그래프.

도 6은 티오시안산 제2철 (ferric thiocyanate) 법을 이용한 리놀릭산의 자동 산화 시스템에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 대두 발효 조성물 (STFS) 의 항산화 활성도를 나타내는 그래프.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 대두 발효 조성물 (STFS)의 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis ATCC11778)에 대한 생장 저해 효과를 나타내는 그래프.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 대두 발효 조성물 (STFS)의 대장균 (Escherichia coli ATCC 10536)에 대한 생장 저해 효과를 나타내는 그래프.

도 9는 HT1080 (Human null fibrosarcoma) 세포와 MCF7 (Human breast adenocarcinoma) 세포에서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 대두 발효 조성물 (STFS)의 MTT 에세이 결과를 나타내는 그래프.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 대두 발효 조성물 (STFS)의 농도에 따른 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE)의 저해 활성을 나타내는 그래프.

도 11은 STFS로부터 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 펩타이드를 분리 및 동정하는 과정을 나타내는 순서도.

도 12는 HiPrep 16/10 SP FF 양이온 교환 칼럼으로부터 얻어진 6개 분획의 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성도를 나타내는 그래프.

도 13은 양이온 교환 칼럼으로부터 얻어진 피크 F를 Superdex Peptide 10/300 GL 겔 여과 크로마토그래피하여 얻은 5개 분획의 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성도를 나타내는 그래프.

도 14는 겔 여과 크로마토그래피로부터 얻어진 활성 분획을 1^st RP-HPLC하여 얻은 분획의 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성도를 나타내는 그래프.

도 15는 1^st RP-HPLC에서 얻어진 HP5 영역의 활성을 나타내는 2^nd RP-HPLC 리크로마토그램.

도 16은 2^nd RP-HPLC에서 얻어진 HP5 영역의 활성을 나타내는 3^rd RP-HPLC 리크로마토그램.

도 17은 본 발명의 정제된 펩타이드 (PP)의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼.

도 18은 단백질 시퀀서로부터 얻어진 본 발명의 정제된 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 펩타이드의 크로마토그램.

본 발명은 대두 발효 조성물, 이의 제조방법 및 이 조성물로부터 정제한 펩타이드에 관한 것이다.

콩을 주원료로 하는 우리나라의 고유의 대두 발효식품인 간장은 조미 식품 중 쓰임새가 다양하고 소비량도 많은 편이며 간장의 제조법, 발효미생물, 콩, 메주와 간장의 성분에 관한 많은 연구가 이루어져 왔다. 간장은 국균 효소에 의하여 단백질은 저분자의 펩타이드와 아미노산으로, 당질은 단당류로 분해된다. 이때 주 발효 효모에 의하여 알코올이 생성된 후 후숙 발효덧의 효모에 의하여 향기 성분이 생성되어 간장의 풍미를 높여준다 (Lee SB, Koh KH, Yang JY, Oh SH. Food Fermentations. Hyoil. pp. 11-64, (2001)).

그러나 간장은 발효시간이 6개월 내지 1년 이상이 소요됨으로써 산업화가 어려운 문제점이 있었다 (Liu K. Soybeans: chemistry, technology, and utilization. Gaithersburg, Maryland: Aspen. pp. 237-260,(1999)). 대부분의 전통적 방식의 간장 제조는 가내수공업 형태의 중소업체에서 이루어지고 있으며, 산업적으로 대량생산 체제를 갖춘 곳에서는 주로 Aspergillus . oryzae나 Aspergillus. sojae를 이용하거나 Bacillus와 혼용하여 간장을 제조하는 일본식 간장의 제조공정을 적용하고 있다.

한편, 현대 성인병의 대표적인 질환 중 하나인 고혈압은 90% 이상이 본태성 고혈압 (1차성 혹은 특발성)이다. 이 본태성 고혈압의 원인으로 레닌-안지오텐신계 (RAS, renin-angiotensin system)가 생체 혈압조절에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Bakris GL. Angiotensin-conerting enzyme inhibition to enhance vascular health-clinical and research models. Am. J. Hypertension. 14: 264S-269S, (2001)). 즉, 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE)는 칼리크레인-키닌계 (KKS)에서 B₂ 수용체를 통해 혈관확장의 촉진, 혈소판의 흡착 및 평활근세포증식의 저해 기능을 하는 나노펩타이드인 브래디키닌으로부터 두 개의 C-말단의 디펩타이드 (Phe-Arg)를 가수 분해하여 불활성화 시킴으로써 결과적으로 혈압을 상승시키게 된다 (Dorer et al., Hydrolysis of bradykinin by angiotensin-converting enzyme. Circ. Res. 34: 824-827, (1974)). 따라서, 이러한 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE)의 저해물질인 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해제는 혈압 상승원을 제거하고 혈관 확장제인 브래디키닌을 증가시키며 특이적으로 신장혈관을 확장시켜 나트륨 배설을 촉진함으로써 고혈압뿐만 아니라 만성신장병, 동맥경화, 심장발작과 그로 인한 사망률 등을 효과적으로 감소시킬 수 있다. 도 1에 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE)의 작용을 나타내었다.

현재 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 활성 저해제는 식물 자원, 어류 및 두류와 그 발효식품 등을 비롯한 다양한 자원으로부터 탐색되고 있다. 식품 내에 존재하는 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해제는 열에 안정하며 체내에서의 흡수도 용이한 비교적 저분자 물질로서 이들의 ACE 활성 저해 효과는 기존의 혈압 강하제보다 비교적 낮은 활성을 가지고 있지만 대량으로 항상 섭취하는 식품 중에 존재하며 안정적이라는 점에서 그 유용성이 기대된다.

본 발명의 목적은 장시간 발효로 인한 산업화의 문제점을 해결하기 위하여 단시간에 대량생산이 가능하면서도 생리 활성 효과가 뛰어난 대두 발효 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 상기 대두 발효 조성물로부터 분리 정제된 항고혈압 활성을 가지는 펩타이드 및 그 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여

본 발명의 일 측면에 따르면,

(a) 탈지 대두 및 볶은 소맥을 혼합하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 얻어진 혼합물에 종국을 첨가하여 제국하는 단계; 및

(c) 단계 (b)에서 얻어진 제국물에 염수를 첨가하여 40~50℃의 온도로 2~5일간 발효시키는 단계를 포함하는 대두 발효 조성물의 제조방법을 제시할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 상기 방법에 의해 제조되는 대두 발효 조성물을 제시할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 제시할 수 있다.

아울러, 본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 건강기능식품 또는 의약품을 제시할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이하에서 '고온 단기 발효한 대두 발효 조성물'은 '고온 단기 발효한 간장 조성물 (STFS, short-term fermented soy sauce reactants by high temperature)'과 동일한 의미로 사용되었다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

(a) 탈지 대두 및 볶은 소맥을 혼합하는 단계;

(c) 단계 (b)에서 얻어진 제국물에 염수를 첨가하여 40~50℃의 온도로 2~5 일간 발효시키는 단계를 포함하는 대두 발효 조성물의 제조방법을 제시할 수 있다.

상기 단계 (a)에서, 탈지 대두는 120℃에서 10분간 증자시켜 준비하며, 소맥은 볶아서 분쇄한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 탈지 대두와 볶은 소맥은 1:1의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하다.

상기 단계 (b)에서는 (a)에서 얻어진 혼합물에 종국으로서 Aspergillus . oryzae 를 상기 혼합물의 0.1~0.2 중량% 첨가하여, 25~30℃에서 3일간 제국하는 단계이다. 단계 (c)에서는 단계 (b)에서 얻어진 제국물에 염수를 첨가하여 40~50℃의 온도로 2~5 일간 발효시키게 된다.

40℃ 이하에서 발효시킬 경우 잡균의 오염이 심하고 분비된 효소의 활성이 떨어지는 문제가 있으며, 50℃ 이상에서 발효시킬 경우에는 국균의 (Aspergillus . oryzae)의 성장이 저해되고 효소 활성이 감소하는 문제가 있다. 또한 2일 이하로 발효시킬 경우 분해율이 낮아 경제성이 떨어지게 되며 5일 이상 발효시킬 경우 제조 비용의 증가로 경제성이 떨어지는 문제점이 있다. 발효시의 바람직한 온도 및 시간 조건은 바람직하게는 45℃에서 3일이다.

현재 우리나라에서 주로 사용하고 있는 재래식 간장과 개량식 간장은 발효탱크에서 6개월 내지 1년 이상 발효 숙성시켜 제조하는데 비하여 본 발명의 방법에 의하면 단기간 발효시켜도 높은 생리활성 효과를 가지는 대두 발효 조성물, 바람직하게는 간장 조성물을 제조할 수 있으므로 본 발명의 방법은 매우 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 단계 (c)를 거쳐 얻어진 대두 발효 조성물을 85~95℃에서 살균하여 규조토로 여과시키는 단계 (d)를 더 포함하도록 구성될 수 있으며 상기 단계 (d) 이후 스프레이 드라이 (spray dry)하는 단계를 더 포함하도록 구성될 수 있다 (도 2 참조).

본 발명의 대두 발효 조성물 (이하, STFS라 칭함) 은 상술한 바와 같이 고온에서 단기간 발효시켜 제조된 것으로서 일반성분을 분석한 결과, 표 1과 같이 수분함량은 19.1%, 단백질은 28.6%, 조지방은 0.4%, 회분은 2.8%, 염도는 0.34%로 나타났다.

또한, STFS의 아미노산 조성을 분석한 결과, 글루타믹산 (glutamic acid) (15.432%), 류신 (leucine) (10.420%), 프롤린 (proline) (8.806%), 알라닌 (alanine) (7.938%)의 순으로 나타났다 (표 3 참조). 상기 아미노산 조성을 식품 성분표 (Food Composition 표, 2001)에 표기된 간장의 아미노산 조성과 비교하였을 때 류신 (leucine), 세린 (serine), 프롤린 (proline), 시스테인 (cystein)의 함량은 높고, 아스파틱산 (aspartic acid)과 글루타믹산 (glutamic acid)의 함량은 작게 나타나는 것을 확인하였다. 겔 침투 크로마토그래피 (GPC)를 이용한 분자량 분포 분석결과에서는 3 kDa 이하가 89.8%를 차지하고 있어 STFS는 대부분 저분자 물질로 구성되어 있음을 알 수 있었다 (표 5 참조).

장류의 품질 지표인 가수분해도를 측정하기 위해 Su 등의 방법에 따라 측정한 STFS의 가수분해도는 55.6%로 나타났다.

DPPH 라디칼 소거능에 의한 항산화 활성은 STFS 농도가 증가할수록 농도의존성을 보였고 IC₅₀값은 1.63 mg/mL로 나타났다 (도 4 참조). TBA (thiobarbituric acid) 법에 의한 활성은 7일차에서 대조구의 유지 변패도에 비해 51.18%의 항산화능의 증가를 보였으며 (도 5 참조), 티오시안산 제2철 (ferric thiocyanate) 법에 의한 활성은 59.29%를 보였다 (도 6 참조). 즉, STFS는 3가지 다른 방법에서 모두 항산화 활성을 보였으며 α-토코페롤을 100%로 하여 비교하였을 때 70% 이상의 높은 활성을 보였다.

도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 페이퍼 디스크법 의한 항균 활성 측정 결과는 바실러스 서브틸리스와 대장균 두 균주 모두에 대하여 항균 활성을 보였고 8 mg/mL에서 가장 높게 나타났다. STFS의 미생물 생육 저해도는 1mg/mL에서 균의 증식을 억제하는 효과를 보였으며 한천배지 확산법에 의한 최소저해농도 (MIC: minimum inhibitory concentration)와 비슷한 경향을 보였다.

도 9는 인간 암세포주를 이용하여 STFS의 암세포 독성을 측정한 결과를 나타낸다. STFS를 처리한 결과 MCF7 세포주는 유의적으로 농도 의존적 저해율을 보였으며 최대 저해율은 1 mg/mL에서 60.58%로 나타났다. 반면, HT1080 세포주에서는 농도 의존성이 관찰되지 않았다.

ACE 저해 활성의 측정으로부터 STFS의 항고혈압 효과를 확인할 수 있는데, 도 10은 STFS의 농도가 증가함에 따라 ACE 저해 활성이 농도 의존적으로 증가함을 보여준다. IC₅₀값은 1.464 mg/mL로 높게 나타났다.

이상의 결과로부터 본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 STFS는 항산화 활성, 항균 활성, 암세포 독성 및 항고혈압 활성 등 생체 적용시 유용한 특성을 가질 수 있음을 확인하였다.

본 발명자 등은 상기 STFS가 ACE 저해 활성을 가진다는 사실에 기초하여 다운스트림으로 이러한 ACE 저해 활성을 보이는 분획을 추적함으로써 최종 Leu-Val-Gln-Gly-Ser의 5개 아미노산 잔기로 구성된 단일 펩타이드를 분리하였다. 즉, 상기 STFS를 한외여과, 양이온 교환 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피, HPLC를 거쳐 ACE 활성을 보이는 최종 물질을 분리, 정제하였고, 그 결과 495.7 달톤을 가지는 5개 잔기의 펩타이드를 확인할 수 있었다.

Cushman 등(1971)과 Cheung 등(1980)은 여러 가지 디펩타이드 (dipeptide)를 합성하여 안지오텐신-I 전환 효소 저해 효과에 미치는 C말단 및 N말단 아미노산 잔기의 영향을 검토한 결과 C말단에서 방향족 아미노산 그리고 N말단에서 지방족 아미노산 잔기가 분지 (branched)된 것이 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE)와 결합하는 경쟁적 저해제로서 적당하다고 보고하였다 (Cheung et al., Binding of peptide substrates and inhibitors of Angiotensin converting enzyme. J. Biol. Chem. 255(2): 401-407, (1980)). 즉, C말단 잔기로서는 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 프롤린을, N말단 잔기로는 발린, 이소류신 및 류신을 가진 디펩타이드 (dipeptide)가 높은 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 활성 저해효과를 가진다는 것을 밝혔으며 저해 작용의 발현에 있어 방향족 및 소수성 아미노산 잔기의 기여가 중요하다고 하였다. Hazato와 Kase는 돼지 혈장으로부터 안지오텐신-I 전환 효소 저해제로서 Leu-Val-Leu을 얻었고, Astawan 등 (1995)은 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 펩타이드로 N말단에서 Gly-Leu 잔기를 C말단에서 Leu 잔기를 발견하였다 (Hazato T, Kase R. Isolation of angiotensin-converting enzyme inhibitor from porcine plasma. Biochem. Biophys. Res. Commun. 139: 52-55, (1986)).

본 발명자 등이 STFS로부터 분리한 서열번호 1의 펩타이드는 N말단에 류신인 소수성 아미노산 잔기를 가지고 있으나 C말단에 지방족 아미노산 잔기가 아닌 친수성 아미노산인 세린을 가지고 있으므로, 현재까지 밝혀지지 않은 새로운 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 펩타이드임을 확인할 수 있었다.

아울러, 본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 하는 고혈압억제용 건강기능식품 또는 의약품을 제시할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 ACE를 저해하는 기작으로 항고혈압 활성을 나타내며 이러한 목적을 위해 건강기능식품이나 의약품 원료로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드의 사용 양태로는, 수용액, 현탁물, 분말, 고체 성형물 등 어떠한 형태여도 무방하며 특별히 한정되는 것은 없다. 따라서, 일반 식품이나 약품에 폭넓게 첨가하여 사용할 수 있다.

제형으로는 캡슐제, 정제, 분말제, 과립제, 드링크제 등으로서 제공될 수 있다. 이 경우에 단미 (單味) 성분으로서 사용할 뿐만 아니라, 기타 정미(呈味)성분, 증량제, 안정제 및 생약, 허브 등의 기능성 소재나 그 기능성 성분과 혼합, 병용하여 이용할 수가 있으며, 비타민, 미네랄 등 영양성분이나 식품으로서 허용되는 소재 등과 혼합, 병용하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 펩타이드의 효과를 발휘시키기 위한 인체 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 0.5∼2000mg/kg·일이 바람직하며, 10∼400mg/kg·일이 더욱 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예를 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 상기 실시예 및 제조예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 이를 제한하기 위한 것으로 해석되어서는 아니된다.

실시예의 실험결과들의 통계처리는 SPSS (statistical package for social science)를 이용하였으며, 각 실험결과들의 평균값들의 차이 검증은 일원분산분석법 (One-Way ANOVA, analysis of variance)를 사용하였고, Duncan 검정법 (Duncan's multiple range test)으로 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다 (Lee SW, Park HD, Her ES. Statistics and Data Analysis method. pp. 253-296. Hyoil Press, Seoul, Korea, (1998)).

실시예 1: 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS) 제조 및 일반성분 분석

1-1. 시약 및 재료

본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물의 제조에 사용된 탈지 대두와 소맥은 대한장유조합에서 구입하여 실험에 사용하였으며, 분자량 분포 분석에 사용된 단백질 표준물질은 바이오-라드사(Bio-rad Lab.(Hercules, USA)) 제품을 사용하였다. 각 생리활성 측정에 사용된 분석 시약은 시그마-알드리치사 (Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO USA))에서 구입하였으며 이외의 모든 용매는 일급 또는 특급 시약을 사용하였다.

1-2. 시료의 제조

고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 제조공정은 도 2에 나타내었다. 탈지대두는 120℃에서 약 10분간 증자시키고, 소맥은 볶아서 분쇄하였다. 증자한 탈지대두와 소맥을 50:50(w/w)으로 섞은 것에 0.1-0.2%의 종국 (Asp. oryzae)를 첨가하여 25-30℃에서 3일간 제국을 하였으며 제국물 대비 1.5배에 해당하는 염수 (염도 25%)를 혼합한 후 45℃에서 200 rpm으로 교반하여 3일간 발효하였다. 발효된 반응액은 90℃에서 2시간 살균하여 규조토로 여과시킨 다음 탈염한 후 Spray dry 하여 시료로 사용하였다.

1-3. 일반성분 분석

A.O.A.C 방법 (AOAC. Official Methods of Analysis of AOAC Intl. 15th ed.; Kenneth, H., Ed.; Chapter 11. pp. 1-31. Association of Official Analysis Chemists, Washington, DC, USA, (1990)) 에 준하여 수분함량은 105℃ 상압 가열건조법, 조단백질은 Kjeldahl 질소 정량법, 조지방은 Soxhlet's 추출법, 조회분은 550℃ 직접 회화법을 이용하여 분석하였다. 이때 염도는 염분농도계 (Model NS-3P, Merbabu Trading Co., Ltd., Japan)를 사용하여 측정하였다. 그 결과 본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물의 수분함량은 19.1%, 단백질은 28.6%, 조지방은 0.4% 였으며 회분은 2.8%, 염도는 0.34%로 나타났다 (표 1 참조).

고온 단기 발효한 대두 발효 조성물의 주요 성분 (Unit: 중량%)

성분 (Component)	고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)
수분 (Moisture)	19.10
단백질 (Protein)	28.60
지질 (Fat)	0.40
회분 (Ash)	2.80
염화나트륨 (NaCl)	0.34

1-4. 아미노산 조성 분석

본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 아미노산 조성은 AccQ-Tag 법을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS) 0.5g에 증류수를 가하여 초음파 처리한 용액을 50 μL 취하여 붕산염 완충액 350 μL와 AccQ-Tag 유도체 시약 100 μL을 넣어 잘 혼합한 후 55℃에서 10분간 유도체화 하였다. 유도체화된 시료를 각각 10 μL씩 취한 후 HPLC의 자동시료주입기에 안치하여 표 2와 같은 조건으로 분석하였다. 표준물질은 40 μL, 시료용액은 10 μL을 HPLC에 주입하여 아미노산을 분석하였으며, 컬럼 (column)은 AccQ-Tag C₁₈ (Millipore Co. Milford,. MA, USA) 아미노산 분석 컬럼(amino acid analysis column)을 사용하였으며 이동상은 0.14 M 아세트산 나트륨 (sodium acetate)과 10% 트리에틸아민 (triethylamine)을 1% 인산 (phosphoric acid) 으로 pH 5.02를 맞춘 용액 (eluent A)과 물과 아세토니트릴 (acetonitrile)을 4:6으로 혼합한 용액 (eluent B)을 선형 구배 (linear gradient) 시켜 용출하였다.

고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 아미노산 성분 분석을 위한 HPLC의 조건

장비 (Instrument)	Waters 1525 Binary Pump, Waters 717 plus Autosampler, Waters 474 Fluorescence detector
컬럼 (Column)	AccQ-Tag column C₁₈
컬럼크기 (Column size)	3.9 × 150 mm
용출용매 A (Eluent A)	0.14 M Sodium acetate, 10% triethylamine in water, pH 5.02
용출용매 B (Eluent B)	Acetonitrile : water = 6:4
구배 (Gradient)	AccQ-Teg method
유속 (Flow rate)	1.0 mL/min
가동시간 (Run time)	45 min
파장(Wavelength)	ex. = 250 nm, em. = 395 nm

그 결과, 본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 아미노산 조성은 글루타믹산(glutamic acid) (15.432%), 류신 (leucine) (10.420%), 프롤린 (proline)(8.806%), 알라닌 (alanine) (7.938%)의 순으로 나타났다(표 3 참조). 본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 아미노산 조성을 식품성분표 (Food Composition 표, 2001)에 표기된 간장의 아미노산 조성과 비교하였을 때 류신 (leucine), 세린 (serine), 프롤린 (proline), 시스테인 (cystein)의 함량은 높고, 아스파틱산 (aspartic acid)과 글루타믹산 (glutamic acid)의 함량은 적은 것으로 나타났다.

고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)과 간장의 아미노산 조성 성분표

아미노산(Amino acid)	고온 단기 발효한 대두 발효 조성물	대두(soy sauce)
아스파틱산(Aspartic acid)	6.748	9.767
세린(Serine)	6.591	4.869
글루타믹산(Glutamic acid)	15.432	25.367
글리신(Glycine)	3.374	4.480
히스티딘(Histidine)	1.351	2.406
아르기닌(Arginine)	3.003	3.500
트레오닌(Threonine)	2.055	3.846
알라닌(Alanine)	7.938	6.065
프롤린(Proline)	8.806	6.525
시스테인(Cystein)	6.633	0.835
티로신(Tyrosin)	1.488	1.196
발린(Valine)	6.713	5.416
메티오닌(Methionine)	1.904	1.023
리신(Lysine)	4.445	6.151
이소류신(Isoleucine)	6.335	5.373
류신(Leucine)	10.420	8.024
페닐알라닌(Phenylalanine)	6.766	4.999
트립토판(Tryptophane)	-	0.158
총계(Total)	100	100

1-5. 분자량 분포 분석

본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 분자량 분포는 겔 침투 크로마토그래피 (gel permeation chromatography)를 이용하여 분석하였고, 단백질 분자량 표준물질은 티로글로뷸린 (Thyroglobulin (670 kDa)), 소의 감마 글로뷸린(Bovine gamma-globulin (158 kDa)), 닭의 난백 알부민 (Chicken ovalbumin (44 kDa)), 말의 미오글로뷸린 (Equine myoglobin(17 kDa)), 비타민 B12 (Vitamin B12(1.35 kDa))이 함유된 겔여과 표준 (gel filtration standard (Bio-rad Lab. Hercules, USA))을 사용하여 측정하였다. 컬럼 (Column)은 GPC 컬럼 (column)인 바이오-실 (Bio-sil) SEC-125 (7.5×300mm, Bio-rad Co. Hercules, USA)을 사용하였고, 이동상은 0.15 M NaCl이 함유된 0.05 M 인산나트륨 완충액 (sodium phosphate buffer (pH 6.8))을 이용하여 분석하였다 (표 4 참조). 분자량 분포는 표준물질의 크로마토그램 (chromatogram)을 얻어 피크 면적을 계산하고 다음과 같은 수식에 의해 측정하였다 (Borneo R, Khan K. Protein changes during various stages of breadmaking of four spring wheats: Quantification by size-exclusion HPLC. Cereal Chem. 76(5): 711-717, (1999)).

log MW = 15.154 - 1.785t

(r = 0.9595; MW= molecular weight of STFS; t = retention time)

고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS) 의 분자분포 분석을 위한 GPC 조건

장비(Instrument)	Waters 510 HPLC pump
감지기(Detecter)	Waters 486 Tunable absorbance detector
데이터모듈(Data module)	Water 746
컬럼(Column)	Bio-sil SEC-125 column
컬럼크기(Column size)	7.8 ×300 mm
용출용매(Eluent)	0.05 M sodium phosphate buffer (pH 6.8) with 0.15 M NaCl
주입량(Injection volume)	10 μL
유속(Flow rate)	1.0 mL/min
가동시간(Run time)	15-17 min
파장(Wavelength)	280 nm

그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 분자량 분포는 3 kDa 이하가 89.8%를 차지하고 있어 대부분 저분자 물질로 구성되어 있음을 알 수 있었다 (표 5 참조).

고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 분자량 분포도

분자량 (Molecular weight )	분포도 (Distribution (%))
>30 kDa	1.6
10-30 kDa	1.0
3-10 kDa	7.6
1-3 kDa	44.0
0.5-1 kDa	26.1
<0.5 kDa	19.7

1-6. 가수분해도 측정

간장 등과 같은 장류의 중요한 품질지표인 가수분해도 (Degree of hydrolysis, DH)는 Su 등의 방법 (Su NW, Wang ML, Kwok KF, Lee MH. Effect of temperature and sodium chloride concentration on the activities of proteases and amylases in soy sauce Koji. J. Agric. Food Chem. 53(5): 1521-1525 (2005))에 따라 포르몰 질소 (formal nitrogen (FN))와 총질소 (total nitrogen (TN))를 이용하여 다음과 같이 계산하였다.

가수분해도 (DH) = formal nitrogen (FN)/total nitrogen (TN) × 100

총 질소(Total nitrogen)는 Kjeldahl 법, 포르몰 질소(formal nitrogen)는 포름알데히드(formaldehyde) 적정법에 의해 측정하였다 (AOAC. Official Methods of Analysis of AOAC Intl. 15th ed.; Kenneth, H., Ed.; Chapter 11. pp. 1-31. Association of Official Analysis Chemists, Washington, DC, USA, (1990)). 그 결과, 본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 가수분해도는 55.6%로 나타나 대두에 함유된 단백질들이 잘 분해되었음을 알 수 있다.

실시예 2: 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 생리활성 측정

2-1. 항산화 활성 측정

1) DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능은 Blois와 Brand-Williams 등의 방법을 변형하여 측정하였다 (Blois MS. Antioxidant determination by the use of a free radical. Nature 26: 1199, (1958); Brand-Williams W, Cuvelier E, Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Food Sci. Technol. 28(1): 25-30, (1995)). 구체적으로, DPPH (α,α'-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 16 mg을 에탄올 100 mL에 녹인 후 여기에 증류수 100 mL을 혼합하여 초음파처리 (sonication)하였다. 이 여액 0.9 mL을 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS) 0.1 mL과 일정시간 간격으로 반응시켜 분광광도계 (spectrophotometer (DU 650 series, Beckman Instruments Inc., Fullerton, California, USA))를 사용하여 528 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 일정 간격 동안 증가한 값을 기록하였으며 라디칼 소거율 (%)은 시료 대신 증류수를 넣은 대조군과 비교하여 아래의 계산식과 같이 계산하였다 (Yen GC, Duh PD. Scavenging effect of methanolic extracts of peanut hulls on free-radical and active-oxygen species. J. Agric. Food Chem. 42(3): 629-632, (1994)).

라디칼 소거율 (%) = (C - S)/C ×100

S : 샘플의 흡광도

C : 대조군 (샘플 대신 증류수를 넣은 군)의 흡광도

IC₅₀값은 DPPH 라디칼 소거능이 50% 되는데 필요한 시료의 농도로 표시하였다.

도 3은 본 발명의 대두 발효 조성물의 라디칼 소거능을 DPPH 법에 의하여 살펴본 결과를 나타낸다. 이에 따르면, 본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물은 반응 15분까지 농도 의존적으로 높은 라디칼 소거능을 보였으나, 이후 60분까지는 유의적인 변화를 보이지 않았다. 반면 알파-토코페롤 (0.15%)은 반응 30분까지 강한 라디칼 소거능을 보였으며 그 정도는 0.20% 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS) 수준보다도 더 현저히 높았으나 30분 이후에는 거의 소거능이 나타나지 않았다. 가장 급격한 라디칼 소거능을 보인 반응 15분에서의 라디칼 소거율(%)을 살펴본 결과, 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS) 농도가 증가할수록 농도의존성을 보였고 IC₅₀값은 1.63 mg/mL로 양성대조군으로 사용된 알파-토코페롤 (IC₅₀= 0.95 mg/mL)과 감마-오리자놀 (IC₅₀= 0.99 mg/mL) 보다는 낮은 값을 보였다 (도 4 참조). 콩과 증자콩의 메탄올 추출물의 농도가 0.1%와 0.5%일 때 10% 이하의 소거능을 보였고, 1.0%일 때는 약 70%의 소거능을 보였다는 So 등의 보고 (So EH, Kuh JH, Park KY, Lee YH. Varietal difference of isoflavone content and antioxidant activity in soybean. Korean J. Breed. 33(1): 35-39, (2001))와 비교하였을 때, 0.2%에서 60% 이상의 소거능을 보인 본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)은 매우 높은 라디칼 소거율을 가지는 것을 알 수 있었다.

2) TBA 법에 의한 항산화 활성 측정

티오바비투릭산 (Thiobarbituric acid, TBA)법에 의한 측정은 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)을 자동 산화시켜 TBA가 불포화 지질의 산화 생성물과 반응하여 산화를 일으키는 정도를 측정하는 것이다.

리놀레익산 모델 시스템은 Osawa 등 (Osawa T, Namiki M. A novel type of antioxidant isolated from leaf wax of Eucalyptus leaves. Agric. Biol. Chem. 45(3): 735-739, (1981))의 방법을 약간 변형하여 리놀레익산 0.13 mL, 99.5% 에탄올 10 mL, 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 10 mL, 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS) 1.3 mg을 넣어 혼합한 다음 총용량이 25 mL이 되게 증류수로 조정하였다. 이 반응 혼합물 (reaction mixture)은 단단히 밀봉하여 배양기 (40±1℃, dark room, J-MIC2, Jisico co., Ltd., Seoul, Korea)에 보관하면서 자동산화를 촉진시켰다.

TBA법에 의한 항산화 측정은, Ohkawa 등의 방법에 따라 측정하였다 (Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal. Biochem. 95: 351-358, (1979)). 즉, 40℃에서 보관한 반응 혼합물 (reaction mixture) 50 μL에 증류수 0.8 mL, 8.1% 소듐 도데실 설페이트 0.2 mL, 20% 아세트산 (pH 3.5) 1.5 mL, 0.8% 2-티오바비투릭산 (2-thiobarbituric acid) 용액 1.5 mL을 넣고 혼합한 후 5℃에서 60분간 방치한 다음 95℃에서 60분 동안 발색시켜 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화 결과는 24 시간 간격으로 7일 동안 측정하였으며 시료 대신 증류수를 넣은 대조군과 비교하여 나타내었다. 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 항산화성을 60±1℃로 조절된 항온기 내에서 7일간 자동 산화시킨 후 측정한 결과, 알파-토코페롤을 100%로 하여 비교하였을 때 70% 이상의 높은 활성을 보였으며 7일 차에서 대조군의 유지 변패도에 비해 51.18%의 항산화능의 증가를 보였다 (도 5 참조).

3) 티오시안산 제 2 철 (Ferric thiocyanate) 법에 의한 측정

티오시안산 제 2 철 (Ferric thiocyanate)법에 의한 측정은 유지의 자동산화에 의해 형성된 과산화물이 티오시안산 제 1 철 (ferrous thio cyanate)을 티오시안산 제2철 (ferric thiocyanate)로 산화시키는 정도를 비색법으로 측정하는 것이다. 리놀레익산 모델 시스템은 TBA법에 의한 측정에서 사용한 방법과 동일하게 사용하였으며, Mitsuda 등의 방법에 따라 티오시안산 철 (ferric thiocyanate)법을 실시하였다 (Mitsuda H, Yasumoto K, Iwami K. Antioxidative action of indole compounds during the autoxidation of linoleic acid. Eiyo to Shokuryo. 19: 210-214, (1966)). 구체적으로, 40℃에서 보관한 반응 혼합물 (reaction mixture)100 μL에 75% 에탄올 4.7 mL, 30% 티오시안산 암모늄 (ammonium thiocyanate) 0.1 mM, 3.5% 염산에 녹인 20 mM 염화 제 1 철 (ferrous chloride) 용액 0.1 mL을 넣고 혼합한 후 40±1℃에서 3분간 반응시켜 염화 제1철 (FeCl₂)과 티오시안산염 (thiocyanate)의 발색 정도를 500 nm에서 측정하였다. 항산화 결과는 24시간 간격으로 7일 동안 측정하였으며 시료 대신 증류수를 넣은 대조군과 비교하여 나타내었다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, TBA법과 마찬가지로 7일차에서 대조군보다 약 59.29% 정도 산화를 억제하는 것으로 나타났다. 양성대조군과의 비교에서는 알파-토코페롤을 100%로 하여 비교하였을 때 약 76%로 높은 활성을 보였다.

2-2. 항균 활성 측정

1) 페이퍼 디스크 법에 의한 항균 활성 측정

항균 활성은 Bauer 등 및 MacLowry 등에 따른 페이퍼 디스크 (paper disc)법을 이용한 한천배지 확산법 (agar diffusion method)으로 측정하였다 (Bauer AW, Kibby MM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45(6): 493-496, (1966)). 항균 활성 측정에 사용된 균주는 그람 음성균의 공시균주인 대장균 (Escherichia coli ATCC10536)과 그람 양성균의 공시균주인 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis ATCC 11778)로서, 이들을 영양 브로스에 접종하고 37℃에서 18~24시간 2회 계대 배양하여 사용하였다.

농도별로 준비한 본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 제균한 후 멸균된 페이퍼 디스크 (paper disc)(Φ 8 mm, Advantec, Toyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan)에 50 μL씩 분주하고 흡수 및 건조를 반복하여 시험용 평판배지 위에 밀착시켰다. 이것을 4℃에서 1시간 방치하여 페이퍼 디스크 (paper disc)를 고정시켜 확산되도록 한 후 37℃ 배양기에서 18~24시간 배양하였다. 항균 활성 정도는 디스크 주변의 저해대 (inhibition clear zone)의 직경 (mm)을 측정하여 시료 대신 증류수를 사용한 대조군과 비교하여 나타내었다. 최소저해농도 (MIC; minimum inhibitory concentration)는 24시간 배양하여 육안적으로 증식이 되지 않는 농도로 결정하였다.

항균 활성을 측정한 결과는 바실러스 서브틸리스와 대장균 균주 모두 8 mg/mL에서 가장 높은 항균 활성을 보였으며(표 6 참조), MIC는 1 mg/mL로 나타났다.

2) 미생물 생육 저해도 측정

미생물 생육 저해도 측정은 액체배지희석법 (broth dilution method)으로 측정하였다 (MacLowry JD, Jaqua MJ. Detailed methodology and implementation semiautomated seril dilution microtechnique for antimicrobial susceptibiity testing. Appl. Mecrbiol. 20: 46-53, (1970)). 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 농도를 각각 0.5, 1, 4, 10 mg/mL로 조절한 액체배지에 상기 대장균 및 바실러스 서브틸리스 균주의 현탁액을 각각 0.1 mL씩 접종하고 37℃에서 6시간 간격으로 24시간까지 배양하였다. 미생물 생육 저해도는 620 nm에서 흡광도를 측정하여 균 증식이 나타나지 않는 농도로 결정하였다 (Pearson RD, Steigbigel RT, Davis HT, Chapman SW. Method for reliable determination of minimal lethal antibiotic concentrations. Antimichrob. Agents Chemother. 18(5): 699-708, (1980)).

그 결과, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 한천배지 확산법에서 측정한 최소저해농도와 비슷한 농도인 1 mg/mL에서 균의 증식을 억제하는 결과를 보였으며 그람 양성과 그람 음성균 모두에 대해서 성장을 저해하는 것으로 나타났다.

2-3. 암세포 독성 측정

암세포 독성을 측정하기 위한 세포주로는 HT1080 (null fibrosarcoma, human, KCLB 10121)과 MCF7 (breast adenocarcinoma, human, KCLB 30022)을 한국세포주은행 (KCLB, Korean cell line bank)에서 분양 받아 사용하였다. 사용한 배지는 RPMI1640를 사용하였으며 배지에는 10% 우태혈청 (fetal bovine serum(FBS))과 100 unit/mL의 페니실린/스트렙토마이신이 함유되도록 하였으며, 세포배양은 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 (J-2000, Jisico co., Ltd., Seoul, Korea)에서 수행하였다.

암세포 독성은 Charmichael 등의 방법에 따라 MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 세포내에서 미토콘드리아 탈수소효소 (mitochondrial dehydrogenases)와 반응하여 포르마잔 (formazan)을 형성하는 정도를 측정하는 MTT 분석(assay)을 이용하여 측정하였다 (Charmichael J, Degraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Michell JB. Evaluation of a tetrazolium based semiautomated chlorimetric assay, assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research 47: 936-942, 1987). 즉, 상기 세포주를 96 웰 플레이트 (well plate)에 5×10⁴ cell/well이 되게 100 μL씩 분주하고 각 농도로 희석한 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS) 용액 100 μL를 첨가하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 72시간 배양하였다. 대조군은 시료 대신 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.2±0.1)를 동량 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 72시간 배양 완료 4시간 전에 PBS에 5 mg/mL의 농도로 제조한 MTT 용액 20 μL를 첨가하여 암상태를 유지하면서 동 배양조건에서 4시간 더 배양하였다. 배양 종료 후 원심분리 (700 rpm, 10min)하여 상층액 200 μL을 제거한 후 생성된 포르마잔 (formazon) 결정을 DMSO (dimethyl sulfoxide) 150 μL에 용해시켜 15분 동안 교반 후 멀티-웰 엘리사 자동 분광 리더기 (multi-well ELISA automatic spectrometer reader (ELx800uV, Bio-Tek Instrument Inc., Texas, USA))를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포성장 저해 효과 (Growth inhibitory effect, %)는 다음과 같이 계산하였다.

성장 저해 효과 (%)= {(C - S)/C} X 100

S : 샘플의 흡광도

C : 대조군 (샘플 대신 증류수를 넣은 군)의 흡광도

도 9는 본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 암세포 독성 효과를 알아보기 위해 MTT 에세이한 결과를 나타낸다. 그 결과 MCF7 세포주는 유의적으로 농도 의존적 저해율을 보였으며 최대 저해율은 1 mg/mL에서 60.58%로 나타났다. 반면, HT1080 세포주에서는 농도 의존성이 나타나지 않았다.

2-4. 항고혈압 활성 측정

항고혈압 활성의 지표인 안지오텐신-I 전환 효소 ACE (angiotensin-1 converting enzyme)의 저해 활성은 Cushman과 Cheung의 방법으로 측정하였다 (Cushman DW, Cheung HS. Spectrophotmetric assay and properties of the angiotensin I-converting enzyme of rabbit lung. Biochemical Pharmacology 20: 1637-1648, (1971)). 구체적으로, 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE)와 기질인 HHL (히퓨릭산-히퓨릭산-류신, Hip-Hip-Leu)이 반응하여 안지오텐신 I의 C말단 디펩타이드 (히스티딘-류신) (His-Leu)를 가수분해하여 생성된 마뇨산 (Hippuric acid)을 측정하여 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해율을 계산하였다.

시료 50 μL에 (히퓨릴-히스티딜-류신, hippuryl-_L-histidyl-_L-leucine (HHL 25 mg/2.5 mL 0.1 M sodium borate buffer, pH 8.3)) 용액 50 μL와 0.4 M NaCl이 함유된 0.1 M 나트륨 붕산염 완충액 (sodium borate buffer(pH 8.3)) 100 μL를 가한 후 37℃에서 10분간 전배양 하였다. 여기에 안지오텐신-I 전환 효소 조효소액 (ACE rabbit lung acetone powder에 10배 가량의 0.1 M sodium borate buffer를 가하여 24시간 교반한 후 15,000×g에서 1시간 원심분리한 상층액)을 50 μL 가하고 다시 37℃에서 30분간 반응시킨 뒤, 1 N HCl을 250 μL 넣어 반응을 정지시켰다. 대조군은 시료 용액 대신 증류수를 사용하였으며, 블랭크는 1 N HCl을 먼저 가한 후 안지오텐신-I 전환 효소 조효소액을 가하였다. 여기에 에틸 아세테이트1.5 mL를 가하여 15초간 교반한 후 원심분리 (3,290×g, 10min)하여 상층액 1 mL를 취하였다. 이 상층액은 드라이 오븐 100℃에서 40분 동안 완전히 건조시킨 다음 증류수 1 mL을 가하여 용해시킨 후 228 nm에서 흡광도를 측정하여 아래 계산식에 따라 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해율 (%)을 나타내었다.

안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해율(%)= 1-{(S-SB)/(C-B)}×100

S : 샘플의 흡광도

SB : 샘플 블랭크 (HCl에 의한 반응정지 후 효소를 넣은 군)의 흡광도

C : 대조군 (샘플 대신 증류수를 넣은 군)의 흡광도

B : 블랭크의 흡광도

도 10을 참조하면, 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성이 증가하였고 IC₅₀값은 1.464 mg/mL로 나타났다. Kuba 등 및 Okamoto 등은 다양한 대두발효식품의 IC₅₀값을 비교한 결과 soy sauce는 3.44 mg/mL, Miso paste는 1.27 mg/mL, Natto는 0.16 mg/mL 그리고 Tofuyo는 1.77 mg/mL로 나타났다고 하였다 (Kuba M et al., Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides isolated from tofuyo fermented soybean food. Biosci Biotechnol Biochem. 67(6): 1278-1283, (2003); Okamoto A et al., Angiotensin I converting enzyme inhibitory activities of various fermented foods. Biosci. Biotech. Biochem. 59(6): 1147-1149, (1995)). 상기 보고와 비교하면 본 발명의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)은 soy sauce와 Tofuyo 보다 높은 ACE 저해 활성을 보이는 것을 알 수 있다.

실시예 3: 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)로부터 안지오텐신-I 전환 효소 저해 펩타이드의 분리 및 정제

3-1. 시약 및 재료

안지오텐신-I 전환 효소 저해 효과 측정에 이용된 효소 (ACE; rabbit lung acetone powder)와 기질 (Hip-His-Leu; hippuryl-L-histidiyl-L-Leucine)은 시그마-알드리치사 (Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA))에서 구입하였고, 분리 정제에 사용한 FPLC와 HPLC 용매는 HPLC 등급용 용매 (Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, USA)를 사용하였다. FPLC에 사용된 컬럼은 아머샴 파마시아 바이오텍사 (Amarsham Pharmacia Biotech. (Uppsala, Sweden))에서 구입하여 사용하였으며 각 단계별 분리 정제에 사용한 유기용매는 일급 또는 특급 시약을 사용하였다.

3-2. 안지오텐신-I 전환 효소 저해 효과 측정

고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 안지오텐신-I 전환 효소 저해 효과는 실시예 2의 2-4. 방법으로 측정하였다.

3-3. 안지오텐신-I 전환 효소 저해 펩타이드의 분리 및 정제

1) 한외여과 (Ultrafiltration)

고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)은 한외여과 셀 (ultrafiltration cell (Amicon Co. Beverly, MA, USA))을 이용하여 한외여과 하였다. 한외여과 막은 YM-30, 10, 3 (MWCO; 30,000, 10,000, 3,000; Amicon Co., Beverly, MA, USA)을 사용하여 4개의 분획 (30 kDa 이상, 10-30 kDa, 3-10 kDa, 3 kDa 이하)으로 여과하였으며 동결건조한 후 각각의 수율과 안지오텐신-I 전환 효소 저해 효과를 측정하였다. 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성이 가장 높은 분획은 -70℃에 보관하면서 다음 정제에 사용하였다.

상기 한외여과한 4개 분획의 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성을 비교한 결과를 표 7에 나타내었다. 표 7을 참조하면, 분자량 3 kDa 이하 (고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)-IV))에서 가장 높은 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성을 나타냈으며 그 수율도 87.2%로 다른 분획에 비해 높게 나타났다. 또한 IC₅₀값은 1.120 ± 0.049 mg/mL로 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)(1.464 ± 0.040 mg/mL)보다 높게 나타났다.

한외여과 멤브레인 시스템 (ultrafiltration membrane system) 에서 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)의 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성 비교

분획(Fractions)	IC₅₀ (mg/mL)¹⁾	수율(Yield (%))
STFS-I (> MW 30 kDa)	1.527 ± 0.018	2.5
STFS-II (MW 10 kDa-30kDa)	3.514 ± 0.279	0.7
STFS-III (MW 3 kDa-10 kDa)	3.451 ± 0.190	9.6
STFS-IV (< MW 3 kDa)	1.120 ± 0.049	87.2

1) IC₅₀ 값은 ACE를 50% 불활성 시키는 단백질 농도(mg/mL)임

분자량 30 kDa 이상 (STFS-1)의 IC₅₀값 (1.527 ± 0.018 mg/mL) 역시 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)보다는 낮았으며 높은 ACE 저해 활성을 보였다.

따라서 한외여과에서 얻은 분획 중 IC₅₀ 값과 수율 (%)을 고려하였을 때 가장 높은 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성을 보인 분자량 3 kDa 이하의 분획 (고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)-IV))만을 모아 이후의 안지오텐신-I 전환 효소 저해 펩타이드의 분리, 정제에 사용하였다.

2) 양이온 교환 크로마토그래피

한외여과액 중 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성이 높은 분획 (고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)-IV))을 prep-FPLC (fast protein liquid chromatography; AKTA, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 이용하여 분리정제 하였다 (표 8 참조).

양이온 교환 컬럼인 하이프렙 (HiPrep) 16/10 SP FF 컬럼 (16×100 mm)은 20 mM 아세트산 나트륨 완충액 (sodium acetate buffer (pH 4.0))로 평형화하였으며 동일한 용액에 NaCl (0-1 M)을 선형구배하여 용출하였다. 용출 유속은 0.5 mL/min로 하였으며 214 nm에서 흡광도를 측정하여 분획 콜렉터 (fraction collector (Frac-900, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden))를 이용하여 피크 분획 (peak fraction)을 얻었다.

각 피크 분획은 용출용매 (eluent)에 의하여 생성된 염을 제거하기 위하여 투석막 (cellulose dialysis membrane, MWCO 100; Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez. CA, USA)을 이용하여 탈염하였으며 감압 원심분리 농축기 (centrifugal vacuum concentrator (Ecospin 3180C, BioTron Inc., Incheon, Korea))를 이용하여 감압농축 한 후 동결건조하여 -70℃에 보관하면서 다음 정제에 사용하였다.

한외여과하여 얻은 3 kDa 이하의 저분자 물질을 펩타이드의 이온 강도에 따라 분리하고자 양이온 교환 컬럼인 하이프렙 (HiPrep) 16/10 SP FF 컬럼을 이용하여 6개의 분획을 얻었으며 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성을 측정한 결과는 도 12에 나타내었다. 염화나트륨 (NaCl)(0-2.0M)이 함유된 아세트산 나트륨 완충용액 (sodium acetate buffer(pH 4.0))을 이용하여 선형 구배 (linear gradient)로 용출한 결과, 피크 F의 IC₅₀ 값은 0.237 mg/mL으로 다른 분획에 비해 가장 높은 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성을 보였다.

피크 F는 0.2-0.3 M 염화나트륨이 함유된 완충액에 의해 결합 (bound)된 분획으로 다량의 염을 함유하고 있다. 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성을 측정하는데 있어서 이러한 염들의 작용에 의해 활성 결과에 영향을 받기 때문에 컷 오프 사이즈가 100인 투석막을 이용하여 탈염하여 활성을 측정하였다. 측정 결과 피크 F (IC_{50 =}0.237 mg/mL)는 한외여과에서 가장 높은 활성을 보인 3 kDa 이하의 분획(1.120 mg/mL) 보다 78.84% 낮게 나타났다.

3) 겔 여과 크로마토그래피

양이온 교환 크로마토그래피에서 얻어진 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성이 가장 높은 분획을 분자량에 따른 분리를 하기 위하여 겔여과 컬럼인 수퍼덱스 펩타이드 10/300 GL 컬럼 (10×300 mm)을 사용하여 prep-FPLC를 이용하여 분획화 하였다 (표 9 참조).

수퍼덱스 펩타이드 10/300 GL 컬럼은 한천과 덱스트란이 서로 연결되어 이루어진 매질로 충진된 컬럼으로서, 분리할 수 있는 단백질의 분자량 범위는 100-7000 Da 정도이다. 활성 분획은 0.2 μm 여과막으로 여과하여 사용하였으며 30% 아세토니트릴로 충진한 컬럼에 로딩한 후 0.36 mL/min의 유속으로 40분간 분석하여 214 nm에서 흡광도를 측정하여 피크 분획만을 얻었다. 각 분획은 감압 원심분리 농축기 (centrifugal vacuum concentrator)를 이용하여 감압농축한 후 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성을 측정하였으며 다음 정제를 위하여 -70℃에 보관하여 사용하였다.

구체적으로, 양이온 교환 컬럼 (Cation exchange column)에서 용출된 분획 중 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성이 가장 높은 피크 F를 농축한 후 수퍼덱스 펩타이드 (Superdex Peptide) 10/300 GL 컬럼을 이용하여 크로마토그래피한 결과, 5개의 분획을 얻었다 (도 13). 30% 아세토니트릴을 용출용매로 하여 얻은 각 분획의 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성을 측정하고 단백질 정량한 결과 피크 III의 IC₅₀값이 0.183 mg/mL로 가장 높은 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성을 보였다.

피크 III를 HPLC 펩타이드 표준 (peptide standard, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 이용하여 분자량을 측정한 결과 대부분 1 kDa 이하로 나타났다. 고분자의 효소와 달리 저분자의 펩타이드의 정제시에는 유사한 극성, 분자량, 이온 강도를 가지고 여러 종류의 펩타이드가 동일한 피크에서 얻어지게 되며 또한, 여러 종의 유리 아미노산이 펩타이드의 분획에 혼재되어 분획화되는 어려움이 있다. 그러나 피크 III은 분자량에 따라 분리된 것이기 때문에 유리 아미노산과 염화나트륨 등의 염과 유리당이 어느 정도 제거가 된 것으로 볼 수 있다.

4) RP-HPLC (Reverse-phase high performance liquid chromatography)

3)의 겔 여과 컬럼에서 얻어진 활성 분획을 HPLC를 이용하여 분리 정제하였다. 이때 실험조건은 표 10, 용매조건은 표 11에 나타내었다. 컬럼은 μ Bondapak^TMC₁₈컬럼 (4.6×300 mm; Waters Co., Milford, Massachusetts, Ireland)을 사용하였으며 유속 1.0 mL/min에서 얻은 피크 만을 모아 감압농축한 후 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성을 측정하고 단백질을 정량하였다.

수퍼덱스 펩타이드 10/300 GL 컬럼에 의해 얻어진 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성 분획인 피크 III를 취하여 농축한 후 0.4 μm 기공 크기 (pore size)의 HPLC 프리필터 (prefilter)로 주사 여과 (syringe filtration)하여 불순물을 제거하고, μBondapak^TMC₁₈ 컬럼을 이용하여 RP-HPLC를 행한 결과를 도 14에 나타내었다. 펩타이드의 소수성에 따른 분리를 하고자 40분 동안 214 nm에서 분석한 결과, 많은 피크를 얻었으며 첫 번째 피크는 안지오텐신-I 전환 효소 저해 활성이 나타나지 않아 제외하였다. 7개의 피크를 모아 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해활성과 단백질 정량하고 낮은 IC₅₀값 (0.092 mg/mL)을 보인 피크 5 (HP5) 만을 모아 농축시킨 후, 재-크로마토그래피 (rechromatography)하였다.

5) RP-HPLC 에 의한 재-크로마토그래피 (Rechromatography)

RP-HPLC에서 활성이 가장 높은 분획의 단일 피크를 얻기 위하여 용매 조건을 달리하여 재-크로마토그래피 (rechromatography)를 실시하였다. HPLC를 이용한 2차, 3차 정제는 1차 정제와 같은 μBondapak^TMC₁₈ 컬럼 (4.6×300 mm)을 사용하였으며 용매조건은 0.1% TFA를 포함한 25-35%의 아세토니트릴을 선형 구배하여 용출하였다.

구체적으로, 1^st RP-HPLC에서 얻어진 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성이 높은 피크 HP5를 앞에서와 같은 μBondapak^TMC₁₈ 컬럼을 이용하여 재분리하였다. 아세토니트릴 (25-35%)을 30분 동안 선형 구배로 용출한 결과, 피크 HP5c에서 32.558%의 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해율을 보였다 (도 15, 표 12). 더 순수한 단일 피크를 얻기 위하여 피크 HP5c를 다시 농축한 후 재-크로마토그래피를 실시하였다.

0.1% TFA를 포함한 25-35% 아세토니트릴을 선형구배하여 30분 동안 RP-HPLC (3차 정제)한 결과, 도 16과 같이 유리 아미노산이 제거된 단일 피크 (PP; purified peptide)를 얻었으며 이 피크를 분자량 분석과 아미노산 서열 측정용 시료로 사용하여 구조분석 하였다.

3-4. 단백질 정량

각 시료의 단백질 정량은 마이크로 BCA (Bicinchoninic acid)법에 의하여 BCA 단백질 분석 키트 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO USA)를 사용하였으며 소의 혈청 알부민 (BSA)을 표준물질로 환산 측정하였다 (Kuba M et al., Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides isolated from tofuyo fermented soybean food. Biosci Biotechnol Biochem. 67(6): 1278-1283, (2003)).

3-5. IC₅₀ 측정

각 분리 정제 단계에서 얻은 분획의 IC₅₀ (mg/mL) 측정은 Fuglsang 등 (2002)의 방법에 따라 측정하였다.

단계별로 수득한 분획을 일정한 농도로 3단계 희석하여 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 활성을 50% 저해하는데 필요한 단백질 양 (mg)인 IC₅₀값을 구한 결과를 표 13에 나타내었다. 최초의 고온 단기 발효한 대두 발효 조성물 (STFS)을 여러 단계에 거쳐 분리, 정제한 결과 최종 IC₅₀ 값은 0.022 mg/mL로 최초의 IC₅₀ 값인 1.464 mg/mL보다 약 67.12배 정도 정제되었음을 알 수 있었다.

종래 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 활성 저해물질을 정제한 연구에서 저해 활성을 보인 펩타이드의 IC₅₀ 값은 0.6 mg/mL 이었으며, 대두 가수분해물에서 정제한 펩타이드가 0.027 mg/mL의 IC₅₀값을 보인 결과와 비교하여 볼 때, 본 발명의 최종 정제된 펩타이드는 높은 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.

실시예 4: 안지오텐신-I 전환 효소 저해 펩타이드의 구조

4-1. 말디-토프 질량분석기 (MALDI-TOF mass spectrometer)를 이용한 분자량 측정

RP-HPLC에서 얻은 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성이 가장 높은 단일 피크(PP)의 분자량을 측정하기 위하여 말디-토프 질량분석기 (MALDI-TOF mass spectrometer (Voyager-DE STR, PerSeptive Biosystem Inc., Framingham, NA, USA))를 이용하여 분석하였다. 도 17에 나타난 바와 같이, 정제된 펩타이드 PP의 분자량은 495.7 달톤으로 나타났으며 시료를 이온화하는 과정에서 H⁺, Na⁺, Ca⁺ 이온이 예상 분자량에 결합하여 분석되었다.

4-2. 아미노산 서열 분석

본 발명의 STFS내의 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 효과를 보이는 물질로 추정되는 펩타이드의 아미노산 서열 분석은 자동 단백질 시퀀서 (Automatric Protein Sequencer (476A-01-120, Applied Biosystems Co., Foster City, CA, USA))를 이용하였으며 에드먼 분해법 (Edman degradation, Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM, Ed. Principles of biochemistry. 2ed ed. Worth poblishers. New York, USA pp.155-159, (1993))에 의하여 자동 분석하였다. 그 결과, STFS 내에서 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성을 보이는 물질은 5개의 아미노산 잔기 즉, 서열번호 1의 Leu-Val-Gln-Gly-Ser의 서열을 가지는 펜타펩타이드인 것을 확인하였다.

Cushman 등(1971)과 Cheung 등 (1980)은 여러 가지 디펩타이드 (dipeptide)를 합성하여 안지오텐신-I 전환 효소 저해 효과에 미치는 C말단 및 N말단 아미노산 잔기의 영향을 검토한 결과 C말단에서 방향족 아미노산 그리고 N말단에서 지방족 아미노산 잔기가 분지 (branched)된 것이 경쟁적 저해제로써 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE)와 결합하는 펩타이드로 적당하다고 하였다 (Cheung et al., Binding of peptide substrates and inhibitors of Angiotensin converting enzyme. J. Biol. Chem. 255(2): 401-407, (1980)). 즉, C말단 잔기로서는 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 프롤린 (Trp, Phe, Tyr, Pro)을, N말단 잔기로는 발린, 이소류신 (Val, Ile) 및 류신(Leu)을 가진 디펩타이드 (dipeptide)가 높은 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 활성 저해효과를 가진다는 것을 밝혔으며 저해 작용의 발현에 있어 방향족 및 소수성 아미노산 잔기의 기여가 중요하다고 하였다. Hazato와 Kase는 돼지 혈장으로부터 안지오텐신-I 전환 효소 저해제로서 Leu-Val-Leu을 얻었고, Astawan 등 (1995)은 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 펩타이드로 N말단에서 Gly-Leu 잔기를 C말단에서 Leu 잔기를 발견하였다 (Hazato T, Kase R. Isolation of angiotensin-converting enzyme inhibitor from porcine plasma. Biochem. Biophys. Res. Commun. 139: 52-55, (1986)).

본 발명의 STFS에서 분리한 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성 펩타이드는 N말단에 Leu인 소수성 아미노산 잔기를 가지고 있어 기존의 연구 결과와 유사하게 나타났으나 C말단에 지방족 아미노산 잔기가 아닌 친수성 아미노산인 세린을 가지고 있으므로 이러한 펩타이드 서열은 안지오텐신-I 전환 효소 (ACE) 저해 활성을 가진 펩타이드라고 밝혀진 다른 소재에서 아직 발견되지 않은 새로운 혈압강하 펩타이드임을 알 수 있다.

<제조예 1> 건강기능식품의 제조방법

<1-1> 영양보충용식품 (정제)의 제조

본 발명의 펩타이드 33.3 %

클로렐라 8.4 %

비타민 C 1.3 %

결정셀룰로오스 3.0 %

Maltitol 30.0 %

유당 20.0 %

전분 3.0 %

스테아린산 마그네슘 1.0 %

상기 조성 및 함량으로 통상적인 방법을 사용하여 영양보충용식품 (정제)을 제조하였다.

<1-2> 영양보충용식품 (캅셀제)의 제조

본 발명의 펩타이드 60.0 %

홍삼 추출물 20.0 %

계피 분말 18.0 %

비타민 C 1.5 %

안식향나트륨 0.5 %

상기 조성 및 함량으로 통상적인 방법을 사용하여 영양보충용식품 (캅셀제)를 제조하였다.

<1-3> 음료 1의 제조

본 발명의 펩타이드 0.48 ~ 1.28 ㎎

꿀 522 ㎎

치옥토산아미드 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

이노시톨 30 ㎎

오르트산 50 ㎎

물 200 ㎖

상기 조성 및 함량으로 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

<1-4> 음료 2의 제조

본 발명의 펩타이드 0.05 %

두충 추출액 (고형분 2% 이상) 56.47 %

감초 추출액 (고형분 2% 이상) 14.00 %

진피 추출액 (고형분 2% 이상) 11.00 %

액상과당 10.00 %

꿀 5.00 %

구연산 0.20 %

사과과즙 3.00 %

타우린 0.10 %

비타민 C 0.05 %

복숭아향 0.07 %

안식향나트륨 0.06 %

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의하면, 항산화 활성, 항균 활성, 암세포 독성 및 항고혈압 활성의 유용한 생리 활성을 가지는 대두 발효 조성물을 고온에서 단기간 발효시켜 간단히 제조할 수 있다. 또한 상기 제조방법에 의하여 제조되는 대두 발효 조성물로부터 정제된 ACE 저해 펩타이드는 고혈압 예방이나 치료를 위한 건강기능식품 또는 의약품의 원료로 사용될 수 있다.

<110> Hanyang university Sempio Inc. <120> Method of preparating soy sauce composition and peptide derived therefrom <130> 9210 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Glycine max <400> 1 Leu Val Gln Gly Ser 1 5

Claims

(a) 탈지 대두 및 볶은 소맥을 혼합하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 얻어진 혼합물에 종국을 첨가하여 제국하는 단계; 및

(c) 단계 (b)에서 얻어진 제국물에 염수를 첨가하여 40~50℃의 온도로 2~5일간 발효시키는 단계를 포함하는 대두 발효 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (a)는 120℃에서 10분간 증자시킨 탈지 대두와 분쇄된 볶은 소맥을, 1:1의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 대두 발효 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (b)는, 상기 단계(a)에서 얻어진 혼합물에 종국으로서 Aspergillus oryzae을 0.1~0.2 중량% 첨가하여, 25~30℃에서 3일간 제국하는 것을 특징으로 하는 대두 발효 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (c) 이후에 상기 대두 발효 조성물을 85~95℃에서 살균하여 규조토로 여과시키는 단계를 더 포함하는 대두 발효 조성물의 제조방 법.
제1항의 방법에 의하여 제조되는 대두 발효 조성물.
제5항에 있어서, 상기 대두 발효 조성물은 간장인 대두 발효 조성물.
제5항에 있어서, 상기 대두 발효 조성물은 항산화 활성, 항균 활성, 암세포 독성 및 항고혈압 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 대두 발효 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드.
제8항의 펩타이드를 유효성분으로 하는 고혈압 억제용 건강기능식품.
제8항의 펩타이드를 유효성분으로 하는 고혈압 억제제.