KR20200110099A - 항고혈압 활성 펩타이드, 그의 제조방법 및 그의 용도 - Google Patents

항고혈압 활성 펩타이드, 그의 제조방법 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효소 전처리 및 유산균 발효 공정을 이용하여 대두분리단백으로부터 항고혈압 활성 펩타이드를 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 항고혈압 활성 펩타이드 및 상기 항고혈압 활성 펩타이드를 포함하는 항고혈압 활성 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

항고혈압 활성 펩타이드, 그의 제조방법 및 그의 용도{Peptides having antihypertensive activity, method of manufacturing the same and use of the same}
본 발명은 항고혈압 활성 펩타이드, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 효소 전처리 및 유산균 발효 공정을 이용하여 대두분리단백으로부터 항고혈압 활성 펩타이드를 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 항고혈압 활성 펩타이드 및 상기 항고혈압 활성 펩타이드를 포함하는 항고혈압 활성 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
고혈압은 관상동맥 심장질환의 위험 인자이자 뇌졸중의 가장 중요한 위험 인자로서, 수축기 혈압이 140mmHg 이상과 이완기 혈압이 90mmHg 이상인 것이 특징인데, 장기적으로 고혈압은 중요 장기에 혈액 공급이 불충분해져 사망에까지 이르게 하는 중요한 질병이다.
레닌-앤지오텐신계(renin-angiotensin system; RAS)는 고혈압의 중요한 발병 기전으로 많이 연구되고 있는데, RAS는 두 가지 프로테아제, 즉 레닌(renin) 및 안지오텐신1-전환효소(angiotensin 1-converting enzyme)에 의해 유지되고, 그 중 ACE(EC 3.4.15.1)는 안지오텐신 I의 C 말단 다이펩타이드를 가수분해하여 강력한 혈관 수축제인 안지오텐신 II로 전환시키고, 안지오텐신 II는 안지오텐신 타입-1(angiotensin type-1) 수용체에 결합하여 혈관 수축을 일으켜 혈압 상승의 원인이 된다.
한편, 특정 식품의 단백질은 효소 가수분해 및 발효 등에 의해 생리활성 펩타이드로 전환될 수 있으며, 이러한 물질이 혈압조절 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1).
콩은 단백질 함량이 높은 식품으로서, 콩의 단백질을 분리 및 정제하여 제조되는 대두분리단백(ISP)은 34%는 글리시닌(11S 글로불린), 27%는 β-콘글리시닌(7S 글로불린)으로 이루어져 있으며, 그 외에 감마-콘글리시닌(γ-conglycinin), 7S 글로불린, 리폭시게나제(lipoxygenase), 아글루티닌(agglutinins) 및 β-아밀라제로 구성된다.
대두 단백질은 콜레스테롤 수치를 낮추고, 심혈관 질환의 위험도를 낮추며, 유방암 및 저혈압 등의 질병을 개선시키는 것으로 알려져 있다. 특히, 유산균으로 발효시킨 대두단백질이 강력한 ACE 저해활성(IC50=3.7 mg/ml)을 보였으며, 이로부터 분리된 펩타이드 LIVTQ는 더 높은 활성을 보이는 것으로 보고되었다 (IC50=0.087μM)(비특허문헌 2).
또한, 두부로부터 추출한 펩타이드(IFL, WL)도 높은 ACE 저해 활성(IC50 값 : 각각 44.8과 29.9μM)을 나타내어 고혈압 개선 효과가 있는 것으로 나타났으며(비특허문헌 3), 다른 연구에서는 대두 펩타이드 Gly-Tyr 및 Ser-Tyr이 ACE 활성을 억제하여 고혈압 쥐의 혈압을 감소시키는 것으로 보고되었다(비특허문헌 4).
한편, 대두 펩타이드의 항고혈압 활성의 주요 기전은 혈청 알도스테론의 농도를 낮추고, 안지오텐신저해효소(ACE) 활성 저해 시켜 혈압을 감소시키는 것으로 보이며(비특허문헌 5), 일부 발효 콩 제품은 혈관확장 기능으로 혈압을 감소시키는 것으로도 보고되었다(비특허문헌 6).
또한, 특허문헌으로는 항고혈압 활성 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 발효물(특허문헌 1), 대두발효 조성물, 그 제조방법 및 상기 조성물로부터 정제되고 ACE 저해활성을 갖는 펩타이드(특허문헌 2) 등이 개시되어 있다.
그러나, 대두로부터 유래한 대두분리단백을 이용하여 효소처치 및 유산균 발효 등의 다양한 생물전환공정을 적용하여 ACE 저해활성이 높은 식품원료를 개발하고자 하는 본 발명의 기술적 구성에 대해서는 상기 종래기술에 전혀 알려져 있지 않은 실정이다.
대한민국 등록특허공보 제10-1010913호 대한민국 공개특허공보 제10-2008-0034712호
Food & Function, 6(8), 2440-2452 (2015) International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 20(2), 161-168 (2014) Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(6), 1278-1283 (2003) International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 20(2), 161-168 (2014) Journal of food science, 76(8) (2011) Journal of food science, 75(4) (2010)
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 항고혈압 발효소재로서, 고활성의 ACE 저해활성을 갖는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 방법에 의해 제조되는 항고혈압 발효소재로서의 항고혈압 활성 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항고혈압 활성 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 대두분리단백에 정제수를 첨가하고 혼합하여, 대두분리단백 용액을 얻는 단계, (b) 상기 대두분리단백 용액에 단백질분해효소를 처리하여 대두분리단백을 가수분해하는 단계, 및 (c) 상기 (b) 단계에서 얻은 대두분리단백의 가수분해물에 유산균을 접종한 후 발효시켜, 항고혈압 활성 펩타이드를 생성시키는 단계로서, 상기 유산균은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 IIRCTGC, 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 GPKALPII 및 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 PPNNNPASPSFSSSS 중에서 선택되는 1종 이상의 펩타이드를 생성하는 단계를 포함하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 유산균은 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 유산균은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 유산균은 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) JDFM6 (KCTC13824BP)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 유산균은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) SDL1409 (KCTC13825BP)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 펩타이드는 80±5%의 안지오텐신전환효소(ACE) 저해활성을 가질 수 있다.
본 발명에 의한 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법의 (a) 단계에서, 상기 대두분리단백의 중량 대비 4~6배, 바람직하게는 5배 중량의 정제수를 첨가할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단백질분해효소는 Alcalase, Neutrase, Protex 40L, PTPF-1430 및 KMF-14로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 효소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 단백질분해효소 처리는 상기 대두분리단백 대비0.1~0.5 %(w/w) 농도, 바람직하게는 0.2~0.4 %(w/w) 농도, 보다 바직하게는0.3 %(w/w) 농도의 상기 단백질분해효소를 45~55℃, 바람직하게는 48~52℃, 보다 바직하게는 50℃의 온도에서, 1~5시간, 바람직하게는 2~4시간, 보다 바직하게는 3시간 동안 효소반응시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 유산균의 접종량은 1×108 내지 5×108 cfu/ml, 바람직하게는 1×108 내지 3×108 cfu/ml, 보다 바직하게는 2×108 cfu/ml일 수 있다.
본 발명에서, 상기 발효는 100~200 rpm, 바람직하게는 130~170 rpm, 보다 바직하게는 170 rpm으로 교반하면서, 36~38℃, 바람직하게는 37℃의 온도에서 36~60시간, 바람직하게는 45~50시간, 보다 바직하게는 48시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명에서, 상기 펩타이드는 서열번호 4의 IAKKLVLP 및 서열번호 5의 PDIGGFGC을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된 항고혈압 활성 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 상기 항고혈압 활성 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 IIRCTGC, 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 GPKALPII 및 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 PPNNNPASPSFSSSS 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 상기 항고혈압 활성 펩타이드는 상기 항고혈압 활성 펩타이드는 서열번호 4의 IAKKLVLP 및 서열번호 5의 PDIGGFGC을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항고혈압 활성 펩타이드를 포함하는 항고혈압 활성 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서, 상기 건강기능식품은 두유 음료일 수 있다.
본 발명에서, 상기 건강기능식품은 사이클로덱스트린을 더 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 건강기능식품의 전체 중량에 대하여, 상기 항고혈압 활성 펩타이드를 0.1~90 중량% 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 건강기능식품이 음료인 경우에는 상기 건강기능식품의 전체 중량에 대하여, 상기 항고혈압 활성 펩타이드를 0.1~5 중량% 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 건강기능식품이 캡슐 또는 정제인 경우에는 상기 건강기능식품의 전체 중량에 대하여, 상기 항고혈압 활성 펩타이드를 60~90 중량% 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 건강기능식품의 전체 중량에 대하여, 사이클로덱스트린 0.1~80 중량%, 바람직하게는 40~60 중량%를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 상기 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법은 효소 전처리 및 유산균 발효 공정을 거치기 때문에, 유산균 발효 공정만을 거친 경우에 비하여 대두분리단백으로부터 ACE 저해활성이 훨씬 높은 항고혈압 활성 펩타이드를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 상기 항고혈압 활성 펩타이드를 항고혈압 기능성 소재로 활용할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 스크리닝된 유산균 균주의 ACE 저해활성을 나타내 것이다.
도 2는 곡류 단백질 원료의 ACE 저해활성을 나타내 것이다.
도 3은 대두분리단백의 효소 처리 조건에 따른 ACE 저해활성을 나타내 것이다.
도 4는 대두분리단백의 효소 전처리 조건과 유산균주 처리 조건에 따른 ACE 저해활성을 나타내 것이다.
도 5는 대두분리단백 발효물의 발효 온도에 따른 ACE 저해활성을 나타내 것이다.
도 6은 대두분리단백 발효물의 발효 시간에 따른 ACE 저해활성을 나타내 것이다.
도 7a 및 도 7b는 원료의 입도분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8 및 도 9는 대두분리단백의 처리 조건에 따른 분자량 분포를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 도 10j는 대두분리단백 발효물의 펩타이드 정성분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11a 내지 도 11j는 펩타이드 프로파일을 나타내는 크로마토그램이다.
도 12는 펩타이드 프로파일을 나타내는 크로마토그램이다.
도 13은 실험실 규모(Lab scale)에서의 생산 공정도를 나타낸 것이다.
도 14는 대두분리단백 발효물의 제조를 위하여 사용된 생산설비를 나타낸 것이다.
도 15는 대두분리단백 발효물의 생산 공정도를 나타낸 것이다.
도 16은 대두분리단백 발효물의 수율 분석을 위하여 적용된 생산 공정을 나타낸 것이다.
도 17은 대두분리단백 발효물의 ACE 저해활성을 나타낸 것이다.
도 18은 선택된 펩타이드의 ACE 저해능을 나타낸 것이다.
도 19는 ACE 저해활성에 대한 대두분리단백 발효물의 IC50을 나타낸 것이다.
도 20은 효소 전처리 대두분리단백 발효물의 소화관내 안정성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 항고혈압 활성 대두분리단백 발효물의 시제품을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 항고혈압 발효소재 개발
1. 항고혈압 소재 생산조건 스크리닝
가. 유산균 균주의 분리 및 동정
(1) 연구 방법
상업용 메주(된장)로부터 Lactobacillus rhamnosus와 Pedicoccus pentosaceus 유산균주를 분리하였다. 본 연구에서 6%의 NaCl이 포함된 de Man, Rogosa 및 Sharp(MRS-Difco) 아가 플레이트를 균주의 분리를 위해 사용하였다.
수종의 균주로부터 유산균주를 분리하기 위해 CaCO3 1%를 배지에 첨가하였다. 된장 시료를 희석하여 6% NaCl과 1% CaCO3를 함유한 MRS 아가 플레이트에 도포한후 단일 콜로니(single colony)를 분리한 후, 37℃에서 10% MRS 브로쓰에서 37℃에서 2일간 배양하였다. 균주는 MRS 아가 플레이트에서 재분리 배양하였다.
상기 분리된 균주의 생화학 검사를 다음과 같이 수행하였다.
1)그램 염색
염색할 균주의 슬라이드를 제작한 후, 상기 슬라이드에 크리스탈 바이올렛(일차 염색)을 넣어 1분간 배양한 다음, 5초 동안 약한 물줄기로 헹구어 언바운드 크리스탈 바이올렛을 제거하였다.
그런 다음, Gram’s iodin(mordant)을 첨가한 후 1분간 크리스탈 바이올렛을 세포벽에 고정시킨 후, 슬라이드를 아세톤으로 3초간 세척한 후에 흐르는 물로 부드럽게 헹군 다음, 사프라닌(이차 염색)을 슬라이드에 첨가한 후 1분간 배양하였다. 슬라이드를 최대 5초간 약한 물줄기로 세척한 후에 현미경으로 관찰하였다.
2) 카탈라아제 시험
유리 슬라이드 위에 박테리아 콜로니를 올리고, 3% H2O2 한방울을 떨군 후, 그램 양성 균주만이 카탈라아제 음성 염색으로 선별하였는데, 선별된 균주는 20% 글리세롤을 첨가하여 -80℃ 냉동고에서 보관하였다.
3)유전자 검사
균주의 16S rRNA의 유전자 분석은 Microgen co.(서울 금천궈)에서 실시하였다. 시퀀스 호몰로지는 NCBI의 시퀀스와 대조하여 균주의 특성을 조사하였다.
(2) 연구 결과
균주를 동정한 결과 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 및 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)로 확인되었으며, 상기 페디오코커스 펜토사세우스의 16S rRNA 염기서열 정보는 서열번호 4, 상기 락토바실러스 람노수스의 6S rRNA 염기서열 정보는 서열번호 5와 같다.
나. 유산균 균주 스크리닝
(1) 연구 방법
대두분리단백(ISP)에 대하여 수종의 유산균을 이용하여 발효물을 제조한 후 ACE 저해활성을 평가하여 활성이 우수한 균주를 선별하고자 하였다. 상업용 대두분리단백으로는 ISP YX2001(Shandong Yuxin Bio-Tech., China)을 사용하였다.
실험에 사용한 발효 균주는 장류로부터 분리한 균주 중 유산균으로 동정된 Lactobacillus brevis SDL1411, Lactobacillus rhamnosus SDL435, Lactobacillus rhamnosus JDFM44, Lactobacillus rhamnosus JDFM6, Lactobacillus plantarum SDL1413과 Pediococcus pentosaceus SDL1409을 사용하였다.
유산균의 기초 성장배지는 증류수에 20% (w/v) 대두분리단백(SPI)으로 구성 하였으며, 발효 사전에 Prozyme 2000P로 처리 후 혼합 및 교반하여 배지를 조제하여 유산균으로 배양하기 전에 121℃에서 15분 동안 고압 멸균하였다.
200㎖의 ISP 배지(pH 6)를 함유하는 500㎖ 삼각 플라스크에 각 균주를 2x108 cfu/ml씩 접종하였으며, 배양은 37℃에서 150rpm으로 교반시키면서 수행하였다. 제조된 샘플은 90℃에서 20분 동안 가열하여 균주활성 정지 및 멸균한 후 농축 및 동결 건조시키고 추가 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다.
ACE 억제 활성은 하기 표 1의 순서에 따라 측정하였다(Biochem Pharmacol, 20(7), 1637-1648 (1971)). 각각의 분석을 위해 0.3M NaCl을 함유한 100mM sodium borate buffer(pH 8.3)에 5mM Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL) 50μl를 첨가한 ACE 억제제 용액 20㎕을 37℃에서 5분간 배양하였다.
반응을 시작하기 위해 0.1U/ml ACE 용액 10μl를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 1M HCl을 100㎕ 첨가하여 반응을 종결시키고, 반응 혼합물을 1.0㎖의 에틸 아세테이트와 혼합하였다. 상기 혼합물을 60초간 보텍싱한 뒤 2000 × g에서 5분간 원심 분리하였다.
에틸 아세테이트 층의 분액(0.8 mL)을 깨끗한 튜브로 옮기고 워터 배쓰에 증발시킨 후, 증류수(0.8mL)를 첨가하여 hippuric acid(HA)을 튜브에 용해시켜 형성된 HA의 양을 스펙트로포토미터(Eppendorf Biospectrometer® fluorescence)를 사용하여 228nm에서 측정하였다. 이때 대조군으로는 억제제 없이 반응조건 하에서 Hip-His-Leu로부터 유리된 HA의 양을 사용하였다.
ACE 억제 활성은 100 % × [(B-A) / B]로 계산하였는데, 상기 A는 ACE 및 ACE 억제 성분이 존재할 때 광학밀도(OD)이며, B는 ACE 억제 성분이 없을 때의 광학밀도(OD)를 의미한다.
IC50을 측정하기 위해 5000μg/ml, 500μg/ml, 50μg/ml, 5μg/ml, 0.5μg/ml 및 0.05μg/ml의 희석액을 준비하였다. 50% ACE 활성을 억제하는데 필요한 펩티드의 양은 각 분획에서 관찰된 회귀 곡선으로부터 계산하였다.
Figure pat00001
(2) 연구 결과
각각의 유산균주를 이용하여 ISP를 발효시킨 후 ACE 저해활성을 측정한 결과 도 1에서 보는 바와 같이, Lactobacillus brevis SDL1411, Lactobacillus rhamnosus JDFM6 및 Pediococcus pentosaceus SDL1409를 이용하여 발효시킨 샘플의 활성이 높은 것으로 평가되었으며, 특히 Lactobacillus brevis SDL1411, Lactobacillus rhamnosus JDFM6를 이용하여 발효시킨 시료의 억제활성이 80% 이상으로 매우 유의하게 높은 것으로 평가되었다.
상기 선별된 Lactobacillus rhamnosus JDFM6 및 Pediococcus pentosaceus SDL1409를 2019년 3월 12일자로 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC 13824BP 및 KCTC 13825BP로 각각 기탁하였다.
나. 곡류 단백질 원료 스크리닝
(1) 연구 방법
수종의 상업용 곡류 기원의 단백질 원료에 대하여 유산균 발효를 통하여 생산된 시료의 ACE 저해활성을 평가하여, 항고혈압 활성을 갖는 단백질 발효물의 제조에 대한 최적의 원료를 선별하고자 하였다.
국내 유통이 가능한 공급사들을 통하여 다양한 곡류 단백질 원료를 입수하였고, 단가와 순도 등을 고려하여 하기 표 2와 같이 9종의 원료들을 실험 원료로 선별하여 연구에 사용하였다.
Figure pat00002
상기 표 2의 밀 단백질(Nutralys W), 완두 단백질(Nutralys S85F), 대두 단백질(Supro661), 대두 단백질(NEWPRO D200), 귀리 단백질(ProOatein), 쌀 단백질(Remypro N80), 대두 단백질(PRO-FAM974), 농축 대두 단백질(ARCON S), 대두 단백질(YX2001)과 같은 9종의 곡류 단백질을 서로 다른 기질의 배지성분으로 하여 37℃에서 48시간 동안 발효시켰으며, 발효 균주는 ACE 저해활성이 높았던 L. rhamnosus JDFM6를 이용하였다.
(2) 연구 결과
서로 다른 곡류 단백질을 배지성분으로 하여 L. rhamnosus JDFM6를 이용하여 발효를 시켜 얻어진 시료에 대하여 ACE 저해활성을 평가하여 비교한 결과, 밀, 완두, 귀리 및 쌀 단백질을 발효시킨 경우에는 ACE 저해활성이 매우 낮은 반면에, 대두 단백질을 발효시킨 경우에는 ACE 저해 활성이 매우 높은 것으로 나타났다. 특히 도 2에서 보는 바와 같이, ADM사의 대두분리단백 PRO-FAM974와 Shandong Yuxin Bio-Tech사의 대두분리단백 YX2001을 발효시킨 경우, ACE 저해 활성이 매우 높은 것으로 확인되었다.
2. 항고혈압 소재 생산 최적조건 확립
가. 대두분리단백의 효소 전처리 조건
(1) 연구 방법
원료의 스크리닝 조건 시험의 결과에서 활성과 원료의 단가를 고려하여 ADM사의 대두분리단백 PRO-FAM974를 배지성분으로 사용하였으며, ACE 저해 활성이 높은 L. rhamnosus JDFM6를 이용하여 발효를 적용하였다.
시험 샘플은 대두분리단백의 함량을 10%와 20%의 두 농도로 조정하고, 단백질 가수분해효소 전처리를 적용한 조건과 적용하지 않은 조건에 따른 발효된 시료의 ACE 저해 활성을 평가하여 비교하였다.
(2) 연구 결과
도 3에서 보는 바와 같이, 대두분리단백의 배지 농도는 10% 보다 20%의 농도에서 ACE 저해 활성이 보다 높은 것으로 나타났다.
또한, 효소 가수분해만을 처리한 경우와 L. rhamnosus JDFM6를 이용하여 발효만으로 조제한 경우는 효소 가수분해 처리의 경우가 ACE 저해 활성이 높은 것으로 나타났으나, 효소 가수분해 전처리를 한 후에 발효를 시킨 경우 양성 대조물질인 캡토프릴(captoprill)과 유사한 정도로 ACE 저해활성이 크게 증가한 것으로 나타났다.
따라서, 대두분리단백을 효소 전처리 후에 발효공정으로 적용하는 경우, 활성 물질의 생성이 보다 크게 나타나는 것으로 확인되었다.
나. 대두분리단백의 효소 전처리 조건과 유산균주 처치 조건
(1) 연구 방법
ADM사의 대두분리단백 PRO-FAM974 원료를 앞에서 활성이 높았던 20%(w/v)의 농도로 배지에 첨가하였다. 이때 발효 균주는 Pediococcus pentosaceus SDL1409 또는 Lactobacillus rhamnosus JDFM6를 사용하여 발효 공정을 적용하였다.
효소처리의 정도에 따른 차이를 보기 위해서 효소처리 강도를 3시간 처리(Enz), 2시간 처리(reduced Enz), 1시간 처리(further reduced Enz)의 3 단계로 달리하여 전처리 공정에 적용하였다.
이때, 대조물질로서는 항고혈압 기능의 개별인정형 소재로 상용화되어 있는 코엔자임 Q10과 올리브 잎 추출물을 사용하였으며, 아무런 처치를 하지 않은 대두분리단백 시료를 음성 대조군으로 하여 비교하였다.
(2) 연구 결과
도 4에서 보는 바와 같이, 발효 균주의 차이에 대하여 Pediococcus pentosaceus SDL1409로 발효한 경우 또는 Lactobacillus rhamnosus JDFM6를 이용하여 발효한 경우 ACE 저해활성은 모두 높은 것으로 나타났으나, L. rhamnosus JDFM6를 처치한 경우 보다 활성이 높은 것으로 나타났다.
또한, 효소의 처치 강도에 따라서 처치 강도를 높일수록 ACE 저해 활성이 유의하게 증가하는 것으로 나타났으며, 효소를 단독으로 처치하는 것 보다 효소 전처리후 발효를 적용하는 경우 활성이 보다 크게 증가하는 것으로 확인되었다.
한편, 개별인정형 원료인 코엔자임 Q10과 올리브 잎 추출물에 대해서도 효소 전처리후 발효를 시킨 원료가 ACE 저해활성이 보다 높은 것으로 확인되었다.
다. 대두분리단백 발효물의 발효 온도
(1) 연구 방법
ADM사의 대두분리단백 PRO-FAM974 원료를 20%(w/v)의 농도로 배지에 첨가한 후에 발효 균주로 Lactobacillus rhamnosus JDFM6를 사용하여 30~45℃ 까지의 서로 다른 온도 범위에서 발효를 수행한 후 ACE 저해활성을 평가하여 적정 발효조건을 탐색하였다.
(2) 연구 결과
도 5에서 보는 바와 같이, 30℃, 37℃ 및 45℃의 사로 다른 온도 조건으로 발효를 시킨 대두분리단백 발효물 시료는 모두 높은 ACE 활성 저해를 나타내었다. 한편, 30℃에서 발효시킨 샘플에 대하여 37℃ 및 45℃로 발효를 시킨 시료가 유의하게 ACE 저해활성이 높은 것으로 평가되었으며, 37℃와 45℃로 발효시킨 샘플 간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다.
따라서, 최적의 발효 온도는 37℃로 확인되었다.
라. 대두분리단백 발효물의 발효 시간
(1) 연구 방법
ADM사의 대두분리단백 PRO-FAM974 원료를 20%(w/v)의 농도로 배지에 첨가한 후에 발효 균주로 Lactobacillus rhamnosus JDFM6를 사용하여 37℃의 온도 조건에서 0, 4, 8, 16, 24, 36 및 48시간 까지의 서로 다른 시간 범위에서 발효를 수행 한 후 ACE 저해활성을 평가하여, 적정 발효시간을 탐색하였다.
(2) 연구 결과
도 6에서 보는 바와 같이, 0, 4, 8, 16, 24, 36 및 48시간 까지의 서로 다른 발효시간 조건에서 발효를 수행한 결과, 발효 시간이 증가할수록 유의하게 ACE 저해활성이 증가하는 것으로 확인되었으며, 48시간 발효시에 ACE 저해활성이 가장 높은 것으로 나타났다.
따라서, 최적 발효시간은 48시간으로 확인되었다.
< 실시예 2> 항고혈압 활성물질 규명
1. 항고혈압 활성물질 연구 개요
선행 연구들로부터 대두의 단백질로부터 유래되는 항고혈압 활성물질은 효소처리 또는 미생물에 의한 발효과정을 통하여 단백질이 보다 작은 분자의 펩타이드로 분해되면서 생성되는 것으로 나타났다.
따라서, 본 연구에서 생산하고자 하는 항고혈압 활성의 대두분리단백 발효물의 주요 활성 물질은 저분자의 펩타이드 물질로 추정되며, 대두분리단백 발효물의 물리화학적 성질 및 활성기전의 규명과 원료의 규격 확립을 위한 기초 연구로서 활성물질을 규명하고자 하였다.
2. 대두분리단백 발효물의 이화학적 특성
가. 원료의 입도 분석
(1) 연구 방법
ADM사의 대두분리단백 PRO-FAM974 원료를 앞서 활성이 높았던 20%(w/v)의 농도로 배지에 첨가한 후 효소처리 강도를 3단계로 달리하여(1; Enz, 2; reduced Enz, 3; further reduced Enz) 전처리 공정에 적용한 시료와, 효소 전처리를 한 경우와, 효소 전처리후 Lactobacillus rhamnosus JDFM6를 사용하여 발효 공정까지 적용한 시료에 대하여 원료의 입도의 분포를 측정하여 비교하였다.
원료의 입자 크기는 레이저 회절 원리를 이용한 입도 분석기 Malvern Masterizer 3000(Malvern instrument Ltd, England)를 사용하여 측정하였다.
(2) 연구 결과
하기 표 3 및 도 7a, 도 7b에서 보는 바와 같이, ISP 원료의 입도는 1.03μm로부터 400μm까지 분포하는 것으로 나타났으며, 111μm 전후의 큰 사이즈의 입자가 가장 많이 분포하는 것으로 나타났다.
도 7a 및 도 7b에서, A는 ISP, B는 효소처리후 발효된 ISP, C는 효소처리된 ISP(Enz ISP-1), D는 reduced enzyme 처리된 ISP(Enz ISP-2), E는 further reduced enzyme 처리된 ISP(Enz ISP-3)의 결과이다.
한편, 효소 전처리의 강도에 대하여 효소처리를 가장 강하게 한 시료는 3.12μm에서 240μm까지 분포하였고, 중간 단계의 시료는 3.12μm에서 352μm까지 분포하였으며, 가장 약하게 처리한 시료의 경우는 4.03μm에서 516μm까지 분포하는 것으로 나타나, 전반적으로 ISP 원물에 대하여 효소처리 강도가 강해질수록 입자의 크기가 작아지는 것으로 확인되었다.
특히, 효소처리의 강도가 강해질수록 작은 크기의 입자의 분포가 더 높아지는 것으로 확인되어, 고분자의 단백질이 효소 전처리에 의해 분해되는 것으로 확인되었다.
효소 전처리 후에 발효까지 적용한 대두분리단백 발효물의 입자 분포는 3.12μm에서 240μm로 분포하여, 효소처치만 한 시료와 유사한 정도의 입도 분포를 갖는 것으로 나타났다.
Figure pat00003
나. 원료의 분자량 분포
(1) 연구 방법
ADM사의 대두분리단백 PRO-FAM974 원료를 앞서 활성이 높았던 20%(w/v)의 농도로 배지에 첨가한 후 효소처리 강도를 3단계로 달리하여(1; Enz, 2; reduced Enz, 3; further reduced Enz) 전처리 공정에 적용한 시료에 대하여, 전처리에 따른 단백질의 분해도와 분자량 분포의 변화를 PAGE(poly acrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 측정하였다.
또한, 효소 전처리를 한 경우와 효소 전처리 후 Lactobacillus rhamnosus JDFM6를 사용하여 발효 공정까지 적용한 경우의 단백질의 분해도와 분자량의 분포를 측정하여 비교하였다.
(2) 연구 결과
도 8은 대두분리단백의 처리 조건에 따른 분자량 분포를 나타낸 것으로서, M은 단백질 사이즈 마커, 1은 대두분리단백질(ISP) 원료, 2는 Enz. 처리, 3은 reduced Enz. 처리, 4는 further reduced Enz. 처리이다.
도 8에서 보는 바와 같이, 발효대두단백에 효소처리의 강도를 달리하여 처치한 후에 PAGE를 통하여 단백질의 분해도 및 분자량 분포를 분석한 결과, 효소 전처리를 하지 않은 대두분리단백 원료는 약 5kDa에서부터 250kDa까지 넓은 범위의 단백질이 분포하는 것으로 나타났으며, 특히 약 37kDa 전후와 75kDa에서 100kDa 사이의 고분자 단백질이 많이 존재하는 것으로 나타났다.
발효대두단백에 대하여 효소 전처리를 한 후에는 약 30kDa 이상의 고분자 단백질이 모두 분해되어 20kDa에서 25kDa의 분자량과 약 2kDa의 분자량의 저분자 단백질이 많이 분포하는 것으로 나타났다.
한편, 전반적인 밴드의 강도(intensity)는 대두분리단백 원물에 대하여 효소 전처리 이후에 강도가 크게 낮아진 것으로부터, 2kDa 이하의 보다 적은 분자량의 펩타이드로 전환이 많이 된 것으로 사료된다.
3단계의 효소 전처리 조건에 따른 시료에 대해서는 효소처리 강도가 가장 큰 시료에 비해 효소처리 강도가 가장 낮은 시료에서 약하지만 25kDa에서 100kDa의 밴드가 존재하는 것으로 나타나, 단백질의 가수분해도가 더 낮은 것으로 나타났다. 또한, 중간 단계의 효소처리 조건에서는 25kDa에서 37kDa 사이에 아주 약하게 밴드가 존재하는 것으로 나타나지만, 효소처리 강도가 가장 큰 시료와 유사한 정도의 분자량 분포를 나타내었다.
한편, 도 9는 대두분리단백의 처리 조건에 따른 분자량 분포를 나타낸 것으로서, M은 단백질 사이즈 마커, 1은 대두분리단백(ISP), 2는 효소처리 ISP, 3은 효소 전처리후 유산균 발효시킨 시료이다.
도 9에서 보는 바와 같이, 효소 전처리 만을 처치한 대두분리단백 시료와 효소 전처리 후에 Lactobacillus rhamnosus JDFM6를 이용하여 유산균 발효까지 수행한 시료의 분자량 분포를 비교한 결과, PAGE 상에서는 2kDa에서 37kDa까지의 분포에서 차이를 보이지 않았다.
한편, 앞서의 연구에서 효소 전처리만 한 시료 보다 발효까지 수행한 시료의 ACE 저해활성이 높은 결과로부터, 상기의 조건이 대두분리단백의 활성물질을 생성하기 위한 최대의 분해활성 조건으로 사료되며, 또한 ACE에 대한 저해활성을 나타내는 활성물질은 2kDa 보다 작은 분자량의 펩타이드일 것으로 추정된다.
다. 원료의 아미노산 조성
(1) 연구 방법
ADM사의 대두분리단백 PRO-FAM974 원료를 앞서 활성이 높았던 20%(w/v)의 농도로 배지에 첨가하고, 효소 전처리만 적용한 경우와, 발효 균주 Pediococcus pentosaceus SDL1409 또는 Lactobacillus rhamnosus JDFM6를 사용하여 발효만을 적용한 경우 및 효소 전처리와 발효까지 적용한 경우의 서로 다른 생산 조건에 따른 시료에 대하여 아미노산 조성을 분석하여 비교하였다.
(2) 연구 결과
각각의 서로 다른 대두분리단백의 처치 조건에 따른 아미노산 조성의 변화는 하기 표 4와 같다.
Figure pat00004
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 대두분리단백에 효소 전처리만 적용한 경우와, 발효 균주 Pediococcus pentosus 또는 Lactobacillus rhamnosus를 사용하여 발효만을 적용한 경우 및 효소 전처리와 발효까지 적용한 경우의 서로 다른 조건의 샘플의 아미노산 조성은 유의한 차이를 보이지 않았다.
3. 대두분리단백 발효물의 활성 성분 동정
가. 대두분리단백 발효물의 펩타이드 정성 분석
(1) 연구 방법
ADM사의 대두분리단백 PRO-FAM974 원료를 앞서 활성이 높았던 20%(w/v)의 농도로 배지에 첨가하고, 효소 전처리를 한 후에 Lactobacillus rhamnosus JDFM6를 사용하여 발효하여 제조한 대두분리단백 발효물의 활성물질을 규명하기 위하여 펩타이드의 정성분석을 수행하였다.
대두분리단백 발효물 시료는 2 μg/mL 농도로 50% 메탄올에 녹여 LC-MS/MS(Orbitrap) 장비를 사용하여 분석을 수행한 후 Blank(50% Methanol)를 대조하여, 대두분리단백 발효물의 Full mass spectrum을 비교하였으며, 분석 조건은 하기 표 5와 같았다.
Figure pat00005
(2) 연구 결과
블랭크(50% 메탄올)와 대두분리단백 발효물의 Full mass spectrum을 비교한 결과, 하기 표 6 및 도 10a 내지 도 10j에서 보는 바와 같은 질량(mass) 값들을 얻을 수 있었다.
도 10a는 발효 ISP의 TIC 크로마토그램, 도 10b는 RT 20~30분의 TIC 크로마토그램, 도 10c는 700~1900 m/z의 질량범위를 위한 RT 21.15~21.26분의 full mass spectrum, 도 10d는 1000~1190 m/z의 질량범위를 위한 RT 21.15~21.26분의 full mass spectrum, 도 10e는 1200~1340 m/z의 질량범위를 위한 RT 21.15~21.26분의 full mass spectrum, 도 10f는 700~1900 m/z의 질량범위를 위한 RT 21.68~21.73분의 full mass spectrum, 도 10g는 1140~1440 m/z의 질량범위를 위한 RT 21.68~21.73분의 full mass spectrum, 도 10h는 700~2000 m/z의 질량범위를 위한 RT 27.20~27.27분의 full mass spectrum, 도 10i는 200~900 m/z의 질량범위를 위한 RT 27.37~27.46분의 full mass spectrum, 도 10j는 RT 27.39~27.46분의 MS2 spectrum이다.
한편, 피크의 강도가 너무 낮아 MS2 spectrum의 확인이 불가하여 정성분석을 하지는 못하였으나, 평균 분자량 2kDa 이상의 물질로 구성되는 것으로 추정되었다.
Figure pat00006
나. 대두분리단백 발효물의 활성 펩타이드 동정
(1) 연구 방법
대두분리단백 발효물의 활성 펩타이드를 동정하기 위하여 대두분리단백 원물에 대하여 효소 전처리 만을 수행한 시료와, 발효 균주 Pediococcus pentosaceus SDL1409 또는 Lactobacillus rhamnosus JDFM6를 사용하여 발효만을 적용한 경우 및 효소 전처리와 발효까지 적용한 경우의 서로 다른 생산 조건에 따른 시료에 대하여 질량 분광법(mass spectrometry)을 이용하여 활성 성분을 분석 및 동정하였다.
분석 방법은 Liquid chromatography-electrospray ionization-quantitative time-of-flight tandem mass spectrometry(LC-ESI-TOF-MS/MS)를 수행하였다. MS 분석은 자동 스위칭 나노 펌프, 오토 샘플러(TempoTM nano LC system, MDS SCIEX, 캐나다), fused silica emitter tip(New Objective, USA)이 장착된 하이브리드 quadrupole-time-of-flight 질량 분석기(QStar Elite, Applied Biosystems, USA)를 사용하였으며, 이온화를 위해 ESI를 적용하였다.
분획(2μL)을 LC-nano ESI-MS/MS 시스템에 주입한 후, 샘플을 ZORBAX 300SB-C18 트랩 컬럼(300 μm i.d x 5 mm, 입자 크기 : 5μm, 기공 크기 : 100, Agilent Technologies, 부품 번호 5065-9913)에 트랩하고 98% 용매 A[물/아세토니트릴 (98 : 2, v/v), 0.1 % 포름산]와 2% 용매 B[물/아세토니트릴 (2:98, v/v), 0.1 % 포름산]를 사용하여 5μL/분의 유속으로 6분 동안 세척한 후, 펩타이드를 ZORBAX 300SB-C18 모세관 컬럼상(300 μm i.d x 5mm, 입자 크기 : 5μm, 기공 크기 : 100, Agilent Technologies, #5065-9913)에서 2%-35% 용제 B를 이용해 300 nL/분의 유속으로 30분 이상 분리하였다.
그 후 10분에 걸쳐 35%-90%로 처리하고, 이어서 5분 동안 90% 용매 B로 최종적으로 5% 용매 B로 15분간 처리하였다. 전기 스프레이는 코팅된 실리카 팁(FS360-20-10-N20-C12, PicoTip emitter, New Objective)을 통해 2000eV의 이온 스프레이 전압에서 수행되었다.
펩타이드는 Analyst QS 2.0 소프트웨어(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 자동 분석되었으며, m/z 값의 범위는 200-2000이었다.
(2) 연구 결과
본 MS/MS 분석 크로마토그래피로부터 효소 처리는 대부분리단백의 가수분해에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다. 하지만 발효 공정을 적용한 경우 대두분리단백 발효물에서 많은 단백질이 효과적으로 가수분해된 것으로 나타났다. 또한, 두 유산균의 가수 분해 활성이 유사한 점을 분석 크로마토그램으로부터 확인할 수 있었다.
따라서, LC-ESI-TOF-MS/MS를 사용하여 모든 시료의 펩타이드 프로파일을 분석하여 발효 및 효소 가수분해 과정에서 생성된 펩타이드를 확인할 수 있었다(도 11a 내지 도 11j 참조).
도 11a는 원료 ISP, 도 11b는 ISP+enzyme, 도 11c는 ISP+P. pentosaseus, 도 11d는 ISP+ L. rhamnosus, 도 11e는 ISP+Enzyme+L. rhamnosus, 도 11f는 ISP+Enzyme+P. pentosaseus, 도 11f는 ISP+Enzyme+P. pentosaseus, 도 11g는 원료 ISP와 효소 전처리 ISP의 비교, 도 11h는 L. rhamnosus와 P. pentosaseus의 가수분해능 비교, 도 11i는 P. pentosaseus 발효 시료와 원료 ISP의 비교, 도 11j는 L. rhamnosus 발효 시료와 원료 ISP의 비교 결과이다.
각 샘플에 대해 약 4000 개의 펩타이드 서열이 발견되었으며, 효소 처리후 발효 샘플(L. rhamnosus 또는 P. pentosaseus) 및 발효 샘플(L. rhamnosus 또는 P. pentosaseus)로부터 펩타이드를 스크리닝하여 ACE 저해 활성능을 갖는 후보 펩타이드를 동정하였다.
스크리닝 과정에서 모든 샘플에서 공통적으로 가장 많이 존재하는 펩타이드를 선별하였으며, 하기 표 7 및 도 12에서 보는 바와 같이, 최종적으로 IIRCTGC, IAKKLVLP, GPKALPII, PDIGGFGC 및 PPNNNPASPSFSSSS의 5개의 펩타이드를 선정하였다.
Figure pat00007
< 실시예 3> 항고혈압 발효소재 대량생산 조건 확립
1. 생산공정 개발 개요
선행된 기초 연구들로부터 확립된 대두분리단백을 이용하여 효소처리 및 발효공정을 적용하여 항고혈압 활성의 펩타이드의 제조방법에 대하여 대량생산 공정에 적용하기 위한 기초공정의 개발과 생산 스케일업(scale-up) 시험을 통하여 대량생산 표준화를 확립하고자 하였다.
2. 최적 발효조건 설정 및 시생산
가. 실험실 규모(Lab scale)에서의 생산 효소 설정 시험
(1) 연구 방법
본 실험에 사용된 분리대두단백(Isolated Soy Protein, 이하 ISP)은 식품유형 두류가공품으로, 선행 연구에서 활성이 높았던 ADM사의 대두분리단백 PRO-FAM974 원료를 구매하여 사용하였으며, 원료의 규격은 하기 표 8과 같다.
본 실험에 사용된 효소는 현재 시판되는 Alcalase(비전바이오켐,한국), Neutrase(비전바이오켐,한국), Protex 40L(비전바이오켐,한국), PTPF-1430(비전바이오켐,한국)등의 4가지 효소를 사용하였다.
실험실용 가수분해에 사용된 진탕배양기(HB 205SWM, Hanbeak Scientific Co., Korea)에서 5개 효소의 최적 가수분해 조건인 50℃에서 0.3%(w/w)로 시간별 1차 가수분해하여 고형분 함량, 저분자화 및 이화적 특성을 비교하여 효소를 선정하였다.
식물성 펩타이드 가수분해물 조제에 적합한 효소 농도를 선정하기 위하여, 각 효소를 농도별(0.1~1%)로 처리하여 50℃에서 2시간 동안 가수분해하였으며, 고형분 함량이 가장 높은 실험군의 효소농도를 최종 선정하였다.
상기 1차 가수분해물에 Lactobacillus rhamnosus JDFM6 2×108 cfu/ml을 접종한 후, 2차 발효하여 시제품을 생산하였다.
Figure pat00008
(2) 대두분리단백 가수 분해물의 품질 특성
대두분리단백에 대하여 수종의 효소를 처치하여 생산된 가수분해물의 품질 특성은 하기 표 9와 같다.
Figure pat00009
(3) 효소처리 시간에 따른 유리아미노산 함량의 변화(Lab scale)
가수분해 시간에 따른 조건을 확인하기 위하여, 도 13에서 보는 비와 같이, 대두단백에 물을 첨가하여 20%(w/v)의 수용액으로 제조하였다.
상기 단계에서 얻은 수용액에 단백질분해효소(KMF14)를 총 중량대비 0.3%(w/w)의 비율로 혼합한 다음, 50℃에서 1시간, 3시간, 5시간 동안 효소적 가수분해 후 냉각하여, 강원대에서 제공받은 균주(L. rhamnosus JDFM6 2*108 cfu/ml)로 발효한 후 동결 건조하여 저분자화 분리대두단백을 확보하였다.
그 결과, 5시간의 유리 아미노산의 함량과 관능을 확인하였을 때, 하기 표 10에 나타난 바와 같이, 가수분해 처리시간 대비 유리아미노산 함량은 증가되지 않아서, 최종 3시간으로 조건을 설정하였다.
Figure pat00010
나. 대두분리단백 발효물의 제조 공정 개발(Pilot test)
(1) 생산설비 및 생산공정도
대두분리단백 발효물의 제조를 위하여 사용된 생산 설비는 도 14와 같고, 대두분리단백 발효물의 생산 공정은 도 15와 같이 수행하였다.
(2) 품질 체크
생산된 대두분리단백 발효물의 품질규격을 설정하기 위하여, 기본분석으로 고형분 함량, 산도 및 아미노태질소를 측정하여 그 결과를 표 11에 나타내었다.
Figure pat00011
또한, 생산된 대두분리단백 발효물의 유리아미노산 분석을 수행한 결과를 표 12에 나타내었다.
Figure pat00012
다. 대두분리단백 발효물의 수율 분석
(1) 연구 방법
대두분리단백 발효물의 제조 공정에 대하여 가용성 분획을 최대화시키기 위한 수용성 공정을 적용한 후, 수용성 물질과 불용성 물질에 대한 수율을 분석하였다. 이때 적용된 생산 공정은 도 16과 같다.
(2) 연구 결과
대두분리단백 발효물의 수용성 공정을 적용하여 생산한 후 제조된 원료부터 수유을 확인한 결과, 표 13에서 보는 바와 같이, 기존의 불용성 물질 포함된 분획은 수율 약 96%인데 대하여, 여과 및 회수 공정을 추가하여 수용성 분획만을 분리한 경우 수율은 약 39%로서, 비교적 높은 수율로 회수되는 것으로 확인되었다.
Figure pat00013
라. 고미(bitterness) 개선 공정 개발
(1) 연구 방법
대두분리단백의 효소처리 및 유산균 발효에 의해 저분자의 활성 펩타이드의 함량이 높아질 경우 ACE의 저해 활성은 높아지는 한편, 쓴맛이 매우 강해져 관능상의 문제가 있다.
효소처리 강도를 조절할 경우 비교적 활성이 크게 감소하지 않고, 쓴맛의 강도를 개선할 수 있는 것으로 확인되었으나, 보다 품질을 향상시키기 위하여 부원료 등을 혼합하여 관능의 변화 및 ACEI의 저해활성의 변화를 평가하였다.
관능 개선을 위한 부원료로 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 시험적으로 적용하였으며, 배합비는 표 14와 같이 혼합하여 시험에 사용하였다.
Figure pat00014
(2) 연구 결과
도 17에서 보는 바와 같이, 대두분리단백 발효물에 대하여 사이클로덱스트린을 일정 비율별로 혼합한 경우, 쓴맛은 사이클로덱스트린의 함량이 증가함에 따라 크게 감소하는 것으로 확인되었다.
사이클로덱스트린의 함량비에 따른 ACE 저해 활성은 사이클로덱스트린의 혼합비율을 80%까지 증가시켜도 크게 감소하지 않는 것으로 확인되어, 부원료의 혼합을 통하여 효능을 유지하는 동시에 관능의 개선하는 것이 가능할 것으로 확인하였다.
< 실시예 4> In vitro 항고혈압 활성 평가
1. In vitro 항고혈압 활성 평가 개요
대두분리단백을 이용하여 효소처리 및 발효공정을 적용하여 개발된 항고혈압 활성의 펩타이드 원료에 대하여 in vitro 상에서 ACE 저해활성을 평가하여, 항고혈압 활성을 규명하고자 하였다.
2. I n vitro 항고혈압 활성 평가
가. 펩타이드의 ACE 억제 활성 평가
(1). 연구 방법
상기 선정된 IIRCTGC, IAKKLVLP, GPKALPII, PDIGGFGC 및 PPNNNPASPSFSSSS 5개의 펩타이드를 대상으로 ACE 억제 활성을 평가하였다.
상기 ACE 억제 활성 평가를 위하여, Biochem Pharmacol, 20(7), 1637-1648 (1971)에 의해 기술된 절차에 따라 in vitro 분석을 하였다.
즉, 0.3M NaCl을 포함하는 100mM sodium borate 완충액(pH 8.3) 중 5mM HHL 50㎕를 함유한 20㎕의 ACE 억제제 용액을 37℃에서 5 분간 배양하였다. 반응을 시작하기 위해, 0.1 U/mL ACE 용액 10 μL를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 30분 동안 항온 배양하였다.
100 μL의 1M HCl을 첨가하여 반응을 종결시키고, 반응 혼합물을 1 mL의 에틸 아세테이트와 혼합하였다. 혼합물을 60 초간 보텍싱하고 2000 × g에서 5 분간 원심 분리하였다. 에틸 아세테이트 층(0.8 mL)을 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮기고 수욕상에서 증발시켰다.
튜브내의 hippuric acid(HA)을 증류수(0.8 ㎖)로 용해시켰다. 형성되는 HA의 양은 바이오스펙트로미터(Eppendorf Biospectrometer® fluorescence, Eppendorf Korea Ltd. Korea)을 사용하여 228 nm에서 측정되었다. 억제제 없이 상기 반응조건 하에서 Hip-His-Leu로부터 유리된 HA의 양을 대조군으로 사용하였다. 억제의 정도는 하기의 식과 같이 계산되었다 :
ACE 저해 = 100 %×[(B-A)/B]
상기 식에서, A는 ACE 및 ACE 억제 성분의 존재하에 광학 밀도(OD)이고, B는 ACE 억제 성분이 없는 OD이다.
(2). 연구 결과
도 18에서 보는 바와 같이, 분석된 펩타이드 중에서 IIRCTGC는 83±0.9%의 가장 강력한 저해 활성을 보였으며, 그 다음으로 PPNNNPASPSFSSS와 GPKALPII가 저해 능력에서 유의한 차이가 없었다(P>0.05).
한편, 펩타이드 PDIGGFGC는 18±7%의 저해 활성을 나타내지만, IAKKLVLP는 10±3%의 저해 활성을 나타내었다. 양성 대조군인 캡토프릴(Captopril)은 94±4%의 가장 강력한 억제 활성을 보였다.
상기 PPNNPASPSFSSSS, GPKALPII 및 IIRCTGC가 ACE 억제 펩타이드로 확인된 것은 본 발명이 최초이다.
나. ACE 저해 활성에 대한 대두분리단백 발효물의 IC50
(1) 연구 방법
대두분리단백 발효물의 항고혈압 활성의 in vitro 활성지표로서 ACE 억제 활성을 측정하였다(Biochem Pharmacol, 20(7), 1637-1648 (1971)).
ACE 억제 활성은 앞에서 기술한 방법으로 측정하였으며, IC50을 측정하기 위해 대두분리단백 발효물 시료를 5000μg/ml, 500μg/ml, 50μg/ml, 5μg/ml, 0.5μg/ml 및 0.05μg/ml의 희석 배수로 하여 시료를 준비하였다. 50% ACE 활성을 억제하는데 필요한 시료의 양은 각 분획에서 관찰된 회귀곡선으로부터 계산하였다.
(2) 연구 결과
다양한 농도의 대두분리단백 발효물 원료는 ACE 저해활성이 높은 것으로 나타났다. 5000μg/ml, 500μg/ml, 50μg/ml, 5μg/ml, 0.5μg/ml 및 0.05μg/ml의 희석 배수로 조제한 대두분리단백 발효물 시료에 대한 ACE 저해활성을 평가한 결과, 도 19에서 보는 바와 같이, ACE 활성을 50% 감소시키는데 필요한 시료의 최소 농도, 즉 IC50은 0.592 mg/mL로 확인되었다.
다. 대두분리단백 발효물의 소화관내 안정성 평가
(1) 연구 방법
대두분리단백 발효물의 주요 활성물질은 펩타이드 성분으로서 위장관 내에 존재하는 소화효소에 의해 변성 또는 분해되어 활성을 잃어버릴 수 있다. 따라서 위장관과 유사한 in vitro 모델을 이용하여 대두분리단백 발효물의 ACE 저해활성을 평가하여소화관내 안정성을 평가하였다.
모의 위장 소화는 You and Wu (2011)에 의해 수정된 것과 유사하게 수행되었다. 즉, 1M HCl을 사용하여 pH 2.0으로 조정한 펩타이드 수용액(10 mL, 1 mM)에 펩신(0.2 mg)을 넣고 37℃에서 배양하였다.
120분 후, 1M NaOH를 첨가하여 pH를 7.5로 조정한 후에 0.2mg의 판크레아틴(pancreatin)을 첨가하고, 시료를 37℃에서 180분 동안 추가 배양하였다. 수조를 이용하여 80℃에서 10분간 가열해 반응을 정지시킨 후, 실온에서 냉각시킨 다음, ACE 저해활성을 평가하여 비교하였다.
(2) 연구 결과
모의 위장 소화 모델에서 대두분리단백 발효물에 대하여 위장관 내의 소화효소인 펩신과 펩신 및 판크레아틴을 처치한 후 ACE 저해활성을 평가한 결과, 도 20에서 보는 바와 같이, 소화효소를 처치하지 않은 시료에 대하여 소화효소를 처치한 후에 ACE 저해활성은 큰 변화를 보이지 않았다.
또한, 소화효소를 처치한 후에 ACE 저해활성은 소폭 증가하는 것으로 나타나, 대두분리단백 발효물의 활성물질은 인체의 위장관 환경에 대하여 매우 안정적인 것으로 확인되었다.
< 실시예 6> 시제품 개발
1. 시제품 개발 개요
항고혈압 활성 기능의 대두분리단백 발효물의 상용화를 위하여 대두분리단백 발효물 원료의 대량생산 시제품의 생산과, 원료를 두우제품에 적용하여 관능과 혈압조절 및 관리 효능이 우수한 신개념의 두유제품 시제품의 개발 및 생산을 진행하였다.
2. 시제품 개발
가. 항고혈압 활성 대두분리단백 발효물 원료 시생산
대두분리단백을 효소처리 및 L. rhamnosus 균주로 발효하여 항고혈압 활성 펩타이드 원료를 생산하는 공정을 확립하여 원료 시생산을 완료하였다(도 21 참조).
나. 대두분리단백 발효물 원료를 적용한 두유제품 개발 및 시생산
항고혈압 활성의 대두분리단백 발효물 원료의 1차 생산조건을 적용한 시생산 원료를 두유액에 1%(w/w)를 적용하여 관능을 비교한 결과, 하기 표 17에서 보는 바와 같이, 고미가 강하여 부원료 등을 통한 개선이 필요한 것으로 확인하여 관능적으로 보다 우수한 두유 제품의 개발 연구를 수행 중에 있다.
Figure pat00015
상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC13824BP 20190312 한국생명공학연구원 KCTC13825BP 20190312
<110> Erom&Kangwon Univ. <120> Peptides having antihypertensive activity, method of manufacturing the same and use of the same <130> 11295 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 1 Ile Ile Arg Cys Thr Gly Cys 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Pediococcus pentosaceus <400> 2 Gly Pro Lys Ala Leu Pro Ile Ile 1 5 <210> 3 <211> 45 <212> PRT <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 3 Pro Arg Ala Pro Arg Ala Ala Ser Asn Ala Ser Asn Ala Ser Asn Pro 1 5 10 15 Arg Ala Ala Leu Ala Ser Glu Arg Pro Arg Ala Ser Glu Arg Pro His 20 25 30 Glu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg 35 40 45 <210> 4 <211> 1512 <212> DNA <213> Pediococcus pentosaceus <400> 4 aggatgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga acgaacttcc gttaattgat 60 tatgacgtac ttgtactgat tgagatttta acacgaagta gntggcgaac gggtgagtaa 120 cacgtgggta acctgcccag aagtagggga taacacctgg aaacagatgc taataccgta 180 taacagagaa aaccgcatgg ttttctttta aaagatggct ctgctatcac ttctggatgg 240 acccgcggcg tattagctag ttggtgaggt aaaggcccac caaggcagtg atacgtagcc 300 gacctgagag ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 360 cagcagtagg gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga 420 agaagggttt cggctcgtaa agctctgttg ttaaagaaga acgtgggtaa gagtaactgt 480 ttacccagtg acggtattta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 540 aatacgtagg tggcaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggtct 600 tttaagtcta atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag tgcattggaa actgggagac 660 ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg 720 aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgcaact gacgctgagg ctcgaaagca 780 tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg attactaagt 840 gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat taagtaatcc gcctggggag 900 tacgaccgca aggttgaaac tcaaaagaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 960 gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt ctgacagtct 1020 aagagattag aggttccctt cggggacaga atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1080 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatta ctagttgcca 1140 gcattaagtt gggcactcta gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggacga 1200 cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa 1260 cgagtcgcga gaccgcgagg ttaagctaat ctcttaaaac cattctcagt tcggactgta 1320 ggctgcaact cgcctacacg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1380 tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc 1440 aaagccggtg gggtaacctt ttaggagcta gccgtctaag gtgggacaga tgattagggt 1500 gaagtcgtaa ca 1512 <210> 5 <211> 1431 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 5 gctsgcggcg tgcctaatac atgcaagtcg aacgagttct gattattgaa aggtgcttgc 60 atcttgattt aattttgaac gagtggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccct 120 taagtggggg ataacatttg gaaacagatg ctaataccgc ataaatccaa gaaccgcatg 180 gttcttggct gaaagatggc gtaagctatc gcttttggat ggacccgcgg cgtattagct 240 agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa tgatacgtag ccgaactgag aggttgatcg 300 gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360 acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtn aagaaggctt tcgggtcgta 420 aaactctgtt gttggagaag aatggtcggc agagtaactg ttgtcggcgt gacggtatcc 480 aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540 ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag 600 ccctcggctt aaccgaggaa gtgcatcgga aactgggaaa cttgagtnca gaagaggaca 660 gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag 720 gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta 780 gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gaatgctagg tgttggaggg tttccgccct 840 tcagtgccgc agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa 900 ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 960 cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct tttgatcacc tgagagatca ggtttcccct 1020 tcgggggcaa aatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080 ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatg actagttgcc agcatttagt tgggcactct 1140 agtaagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1200 ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg agaccgcgag 1260 gtcaagctaa tctcttaaag ccattctcag ttcggactgt aggctgcaac tcgcctacac 1320 gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380 tgtaacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc gagccggtgg c 1431

Claims (19)

  1. (a) 대두분리단백에 정제수를 첨가하고 혼합하여, 대두분리단백 용액을 얻는 단계;
    (b) 상기 대두분리단백 용액에 단백질분해효소를 처리하여 대두분리단백을 가수분해하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 얻은 대두분리단백의 가수분해물에 유산균을 접종한 후 발효시켜, 항고혈압 활성 펩타이드를 생성시키는 단계로서, 상기 유산균은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 IIRCTGC, 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 GPKALPII 및 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 PPNNNPASPSFSSSS 중에서 선택되는 1종 이상의 펩타이드를 생성하는 단계를 포함하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유산균이 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)인 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유산균이 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)인 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유산균이 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) JDFM6 (KCTC13824BP)인 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유산균이 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) SDL1409 (KCTC13825BP)인 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 80±5%의 안지오텐신전환효소(ACE) 저해활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서, 상기 대두분리단백의 중량 대비 4~6배 중량의 정제수를 첨가하는 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단백질분해효소는 Alcalase, Neutrase, Protex 40L, PTPF-1430 및 KMF-14로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 효소인 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단백질분해효소 처리는 상기 대두분리단백 대비 0.1~0.5 %(w/w) 농도의 상기 단백질분해효소를 45~55℃의 온도에서 1~5시간 동안 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 유산균의 접종량은 1×108 내지 5×108 cfu/ml인 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 발효는 100~200 rpm으로 교반하면서 36~38℃의 온도에서 36~60시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 4의 IAKKLVLP 및 서열번호 5의 PDIGGFGC을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 항고혈압 활성 펩타이드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항고혈압 활성 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 IIRCTGC, 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 GPKALPII 및 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 PPNNNPASPSFSSSS 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드.
  15. 제13항에 있어서, 상기 항고혈압 활성 펩타이드는 서열번호 4의 IAKKLVLP 및 서열번호 5의 PDIGGFGC을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성 펩타이드.
  16. 제13항의 항고혈압 활성 펩타이드를 포함하는 항고혈압 활성 개선용 건강기능식품.
  17. 제16항에 있어서, 상기 건강기능식품이 두유 음료인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  18. 제16항에 있어서, 상기 건강기능식품은 사이클로덱스트린을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  19. 제18항에 있어서, 상기 건강기능식품의 전체 중량에 대하여, 사이클로덱스트린 0.1~80 중량%를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20220133345A (ko) * 2021-03-24 2022-10-05 강원대학교산학협력단 신규한 페디오코커스 악시딜락티시 균주 및 상기 균주를 이용하여 발효시킨 대두 발효물의 다양한 용도

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100787949B1 (ko) * 2007-08-29 2007-12-24 한양대학교 산학협력단 대두 발효 조성물의 제조방법 및 이 조성물로부터 유래된펩타이드
KR20080034712A (ko) 2006-10-17 2008-04-22 한양대학교 산학협력단 대두 발효 조성물의 제조방법 및 이 조성물
KR101010913B1 (ko) 2008-04-28 2011-01-26 주식회사 엔유씨전자 항고혈압활성 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 발효물
KR20110105761A (ko) * 2009-01-19 2011-09-27 기꼬만 가부시키가이샤 안지오텐신 변환 효소 저해 펩티드
KR20140141872A (ko) * 2013-05-31 2014-12-11 고려대학교 산학협력단 발아 콩 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항고혈압 조성물

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080034712A (ko) 2006-10-17 2008-04-22 한양대학교 산학협력단 대두 발효 조성물의 제조방법 및 이 조성물
KR100787949B1 (ko) * 2007-08-29 2007-12-24 한양대학교 산학협력단 대두 발효 조성물의 제조방법 및 이 조성물로부터 유래된펩타이드
KR101010913B1 (ko) 2008-04-28 2011-01-26 주식회사 엔유씨전자 항고혈압활성 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 발효물
KR20110105761A (ko) * 2009-01-19 2011-09-27 기꼬만 가부시키가이샤 안지오텐신 변환 효소 저해 펩티드
KR20140141872A (ko) * 2013-05-31 2014-12-11 고려대학교 산학협력단 발아 콩 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항고혈압 조성물

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(6), 1278-1283 (2003)
Food & Function, 6(8), 2440-2452 (2015)
Int. J. Pept. Res. Ther., Vol. 20, pp.161-168(2014) *
International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 20(2), 161-168 (2014)
Journal of food science, 75(4) (2010)
Journal of food science, 76(8) (2011)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220133345A (ko) * 2021-03-24 2022-10-05 강원대학교산학협력단 신규한 페디오코커스 악시딜락티시 균주 및 상기 균주를 이용하여 발효시킨 대두 발효물의 다양한 용도

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