CN102787155A - 牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用牦牛乳酪蛋白为原料制备降血压肽的方法，该方法主要技术步骤如下：（1）牦牛乳酪蛋白溶解；（2）加胰蛋白酶水解；（3）灭活胰蛋白酶；（4）沉淀酪蛋白；（5）离心除沉淀；（6）超滤；（7）纳滤；（8）喷雾干燥。本发明的原料独特，工艺科学合理、简单易行，产品为纯度较高的酪蛋白降血压肽，ACE抑制活性高达70%以上，安全、无副作用，兼具营养和辅助医疗功能，可作为添加剂广泛应用于食品、保健品、药品等领域。

Description

牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法

技术领域

本发明利用胰蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备降血压肽，属于生物技术领域，尤其涉及多肽的膜分离技术。

背景技术

大量的研究发现，蛋白质在人体内并不完全是以氨基酸的形式被人体所吸收，而更多的是以小分子肽的形式被人体吸收利用。这些由数个氨基酸组成小分子肽不仅具有营养功能和生理活性，还具有一定的功能特性，如抗氧化性、抗菌性、提高免疫性等诸多新功能。

降血压肽就是这样一种具有降低血压功能的小分子肽，分子量主要集中在1500u左右，它是血管紧张素转换酶（Angiotension-converting Enzyme,ACE）的抑制剂，因而也称为ACE抑制肽（Angiotension-converting Enzyme Inhibitory peptides,ACEIP）。人体中存在肾素—血管紧张素系统（Renin-AngiotensinSystem,RAS）和激肽释放酶—激肽系统（Kallikrein-Kinin System,KKS）对血压的调节起着重要作用。ACE催化RAS系统中的血管素Ⅰ转化成具有强烈血管收缩作用的血管紧张素Ⅱ，将KKS系统中具有血管扩张作用的缓激肽降解成无活性的缓释肽，通过这两种方式引起血压上升。ACE抑制肽与ACE结合后阻止了其对血管紧张素Ⅰ及缓激肽的催化分解，从而起到了降低血压的作用。

目前已有多种化学合成肽类药物作为ACE抑制剂，但这类合成降血压药存在作用时间不长，血压容易反弹，并且药物经肾脏排出容易造成肾功能的损伤。而从食品蛋白质经酶解产生的ACE抑制肽具有食用安全性高、无副作用，特别是其对高血压患者具有降压作用，但对血压正常人无降压作用等优点。

专利号为ZL02139559.4的专利，授权公布了一种用粗奶酪为原料制备酪蛋白降血压肽的工艺，其制备工艺简单，但由于其酶水解产物未经过超滤、纳滤等纯化工艺，水解产物含有较多杂肽段和大量盐，限制了产品在保健品和药品中的应用。同时其工艺用盐酸调节pH终止酶解反应，但并未对蛋白酶进行彻底灭火，水解产物潜在的活性蛋白酶类作为食品，会存在潜在的安全风险。其次，未参与水解的酪蛋白，其专利也未提供去除工艺，由于酪蛋白分子量大，不易被吸收，疏水性强，不易溶于水，势必会影响最终产品品质，降低产品营养价值。

发明内容

本发明的目的在于利用青藏高原特有的牦牛曲拉，通过提取纯化得到的酪蛋白为原料，提供一种对引起高血压的ACE有明显抑制作用的牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，工艺简单，纯度高，水解产物不含小分子盐、大分子酪蛋白和活性蛋白酶，适合在食品、保健品及医药领域中使用。

本发明是这样实现的，一种牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）牦牛乳酪蛋白加水溶解，调整浓度为1%～10%，调节温度为20℃～50℃，pH6.0～9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白完全溶解；

（2）加胰蛋白酶水解，维持反应温度20℃～50℃，pH6.0～9.0，水解1～7小时；

（3）灭活胰蛋白酶，升温至80℃～100℃，维持30～50分钟；

（4）沉淀酪蛋白，用5mol/L食用级盐酸调节pH到3.8～4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；

（5）离心除沉淀，4000g～12000g离心力，离心5～30分钟，留上清液；

（6）超滤，用截留量3000Da的超滤膜，超滤步骤（5）所得上清液，除去大分子蛋白及多肽，收集透过液；

（7）纳滤，用截留量500Da的纳滤膜，纳滤步骤（6）所得超滤液去除小分子盐和氨基酸，收集回流液；

（8）对步骤（7）收集的回流液进行喷雾干燥，即得所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽。

在步骤（1）中所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白，购自华羚酪蛋白股份有限公司，步骤（1）中所述的牦牛乳酪蛋白加水溶解是：取5～50g牦牛乳酪蛋白，加水500mL进行溶解。

在步骤（2）中胰蛋白酶，酶添加量为牦牛乳酪蛋白加入量的0.5%～2%，所述的胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，酶活为1:2500。

在步骤（8）中，是采用喷雾干燥机对步骤（7）收集的回流液进行干燥的，所述喷雾干燥机进风温度为150～165℃，出风温度为65～85℃，流速300～400mL/h。所述的喷雾干燥机现主要采用上海沃迪科技有限公司提供的SD-1500型喷雾干燥机。

最终，我们还可以对所述牦牛乳酪蛋白降血压肽进行了降血压活性测定：

ACE酶液：50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL预冷至4℃硼酸缓冲液(pH8.3，100mmol/L)中，4℃保持12h后4℃、20000r/min离心40min，收集上清液并4℃保。

FAPGG底物溶液：将FAPGG溶于100mmol/L的硼酸冲液(含300mmol/L的NaCl，pH8.3)，配制成1.6mmol/L溶液。

500μL FAPGG底物溶液与100μL超纯水或抑制剂ACE抑制肽或卡托普利)混匀，37℃预热2min，加入100μL ACE酶液开始反应，30min后立即加入100μLDTA(100mmol/L)终止反应，加入4000μL超纯水稀释,实验平行3次。0min样品的测定，要先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。于340nm波长处分别测系在0min和30min时的吸光度，计算差值ΔA(ΔA＝A0min－A30min)。以单位时间内吸光度的变化表示ACE酶活力，抑制剂对ACE的抑制程度用(2)式计算。

式中：ΔAc为加入超纯水时吸光度在30min内的变；

ΔAi为加入抑制剂时吸光度在30min内的变化。

半抑制浓度(IC50)定义为抑制50%ACE酶活力时抑制剂浓度。配制不同浓度的ACE抑制剂(nmol/L或mg/mL)上述步骤测定其ACE抑制活性，以lg抑制剂的浓度横坐标，ACE抑制活性(%)为纵坐标，进行回归分析回归方程，利用回归方程计算抑制剂的IC50。

本发明的有益效果是：

1.本发明采用青藏高原无污染的牦牛乳酪蛋白为原料，原料蛋白含量高，价格低，间接降低了生产成本；同时开发了牧区资源，对牧区经济发展具有重要意义。

2.食源牦牛乳酪蛋白降血压肽，与合成降血压产品相比，食用安全性高、无副作用，特别是其对高血压患者具有降压作用，但对血压正常人无降压作用。可广泛应用于治疗心血管疾病方面的药品、保健食品和食品添加剂中。

3.采用膜技术除大分子片段和盐，产品分子量稳定，纯度更高。

4.本发明操作工艺简单，绿色环保，生产成本低，适合工业化生产和推广。

具体实施方式

本发明结合具体实施实例做进一步详述：

实施例1：

（1）牦牛乳酪蛋白加水溶解：称取牦牛乳酪蛋白30g，加水500mL，调节反应温度37℃，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级；

（2）加胰蛋白酶水解，胰蛋白酶添加量为1.5g，维持反应温度30℃，pH8.0，水解2小时；所述胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，酶活为1:2500；

（3）灭活胰蛋白酶，升温至90℃，维持30分钟；

（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；

（5）离心除沉淀：4000g离心力，离心5～30分钟，除去酪蛋白沉淀，留上清液；

（6）超滤：取离心后上清液，过截留量3000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；

（7）纳滤：取超滤透过液，通过截留分子量为500Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸；

（8）喷雾干燥：取纳滤回流液，采用喷雾干燥机，对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白降血压肽，得干粉20.1g，得率67%；

（9）降血压活性测定：ACE抑制活性为87.5%。

对所述牦牛乳酪蛋白降血压肽进行了降血压活性测定步骤是：

ACE酶液：50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL预冷至4℃硼酸缓冲液(pH 8.3，100mmol/L)中，4℃保持12h后4℃、20000r/min离心40min，收集上清液并4℃保。

FAPGG底物溶液：将FAPGG溶于100mmol/L的硼酸冲液(含300mmol/L的NaCl，pH8.3)，配制成1.6mmol/L溶液。

500μL FAPGG底物溶液与100μL超纯水或抑制剂ACE抑制肽或卡托普利)混匀，37℃预热2min，加入100μL ACE酶液开始反应，30min后立即加入100LDTA(100mmol/L)终止反应，加入4000μL超纯水稀释,实验平行3次。0min样品的测定，要先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。于340nm波长处分别测系在0min和30min时的吸光度，计算差值ΔA(ΔA＝A0min－A30min)。以单位时间内吸光度的变化表示ACE酶活力，抑制剂对ACE的抑制程度用(2)式计算。

式中：ΔAc为加入超纯水时吸光度在30min内的变；

ΔAi为加入抑制剂时吸光度在30min内的变化。

半抑制浓度(IC50)定义为抑制50%ACE酶活力时抑制剂浓度。配制不同浓度的ACE抑制剂(nmol/L或mg/mL)上述步骤测定其ACE抑制活性，以lg抑制剂的浓度横坐标，ACE抑制活性(%)为纵坐标，进行回归分析回归方程，利用回归方程计算抑制剂的IC50。

实施例2：

（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白40g，加水500mL，调节反应温度40℃，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级；

（2）加胰蛋白酶水解，胰蛋白酶添加量为1.2g，维持反应温度40℃，pH8.0，水解5小时；所述胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，酶活为1:2500；

（3）灭活胰蛋白酶，升温至90℃，维持30分钟；

（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.1，使酪蛋白在其等电点处析出；

（5）离心：4000g离心力，离心5～30分钟，除去酪蛋白沉淀，留上清液；

（6）超滤：取离心后上清液，过截留量3000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；

（7）纳滤：取超滤透过液，通过截留分子量为500Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸；

（8）喷雾干燥：取纳滤回流液，采用喷雾干燥机，对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白降血压肽，得干粉28.4g，得率71%；

（9）降血压活性测定：ACE抑制活性为75%。

实施例3：

（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白20g，加水500mL，调节反应温度30℃，pH8.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级；

（2）加胰蛋白酶水解，购自北京格源天润生物技术有限公司，胰蛋白酶添加量为1.2g，维持反应温度30℃，pH8.0，水解4小时；所述胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，酶活为1:2500；

（3）灭活胰蛋白酶，升温至95℃，维持30分钟；

（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.1，使酪蛋白在其等电点处析出；

（5）离心：12000g离心力，离心5～30分钟，除去酪蛋白沉淀，留上清液；

（6）超滤：取离心后上清液，过截留量3000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；

（7）纳滤：取超滤透过液，通过截留分子量为500Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸；

（8）喷雾干燥：取纳滤回流液，采用喷雾干燥机，对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白降血压肽，得干粉11.2g，得率56%；

（9）降血压活性测定：ACE抑制活性为93%。

实施例4：

一种牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）牦牛乳酪蛋白加水溶解：取20g牦牛乳酪蛋白，加水500mL进行溶解，调整浓度为6%，调节温度为30℃，pH7.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白完全溶解；所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白，购自华羚酪蛋白股份有限公司；

（2）加胰蛋白酶水解，酶添加量为牦牛乳酪蛋白加入量的1%，维持反应温度35℃，pH7.5，水解5小时；所述的胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，酶活为1:2500。

（3）灭活胰蛋白酶，升温至90℃，维持40分钟；

（4）沉淀酪蛋白，用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.1，使酪蛋白在其等电点处析出；

（5）离心除沉淀，7000g离心力，离心15分钟，留上清液；

（6）超滤，用截留量3000Da的超滤膜，超滤步骤（5）所得上清液，除去大分子蛋白及多肽，收集透过液；

（7）纳滤，用截留量500Da的纳滤膜，纳滤步骤（6）所得超滤液去除小分子盐和氨基酸，收集回流液；

（8）对步骤（7）收集的回流液进行喷雾干燥，即得所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽。此步骤是采用喷雾干燥机对步骤（7）收集的回流液进行干燥的，所述喷雾干燥机进风温度为160℃，出风温度为75℃，流速350mL/h。所述的喷雾干燥机现主要采用上海沃迪科技有限公司提供的SD-1500型喷雾干燥机。

实施例5：

一种牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）牦牛乳酪蛋白加水溶解：取5g牦牛乳酪蛋白，加水500mL进行溶解，调整浓度为1%，调节温度为20℃，pH6.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白完全溶解；所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白，购自华羚酪蛋白股份有限公司；

（2）加胰蛋白酶水解，酶添加量为牦牛乳酪蛋白加入量的0.5%，维持反应温度20℃，pH6.0，水解1小时；所述的胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，酶活为1:2500。

（3）灭活胰蛋白酶，升温至80℃，维持30分钟；

（4）沉淀酪蛋白，用5mol/L食用级盐酸调节pH到3.8，使酪蛋白在其等电点处析出；

（5）离心除沉淀，4000g离心力，离心5分钟，留上清液；

（6）超滤，用截留量3000Da的超滤膜，超滤步骤（5）所得上清液，除去大分子蛋白及多肽，收集透过液；

（7）纳滤，用截留量500Da的纳滤膜，纳滤步骤（6）所得超滤液去除小分子盐和氨基酸，收集回流液；

（8）对步骤（7）收集的回流液进行喷雾干燥，即得所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽。此步骤是采用喷雾干燥机对步骤（7）收集的回流液进行干燥的，所述喷雾干燥机进风温度为150℃，出风温度为65℃，流速300mL/h。所述的喷雾干燥机现主要采用上海沃迪科技有限公司提供的SD-1500型喷雾干燥机。

实施例6：

一种牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）牦牛乳酪蛋白加水溶解：取50g牦牛乳酪蛋白，加水500mL进行溶解，调整浓度10%，调节温度为50℃，pH9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白完全溶解；所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白，购自华羚酪蛋白股份有限公司；

（2）加胰蛋白酶水解，酶添加量为牦牛乳酪蛋白加入量的2%，维持反应温度50℃，pH9.0，水解7小时；所述的胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，酶活为1:2500。

（3）灭活胰蛋白酶，升温至100℃，维持50分钟；

（4）沉淀酪蛋白，用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；

（5）离心除沉淀，12000g离心力，离心30分钟，留上清液；

（6）超滤，用截留量3000Da的超滤膜，超滤步骤（5）所得上清液，除去大分子蛋白及多肽，收集透过液；

（7）纳滤，用截留量500Da的纳滤膜，纳滤步骤（6）所得超滤液去除小分子盐和氨基酸，收集回流液；

（8）对步骤（7）收集的回流液进行喷雾干燥，即得所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽。此步骤是采用喷雾干燥机对步骤（7）收集的回流液进行干燥的，所述喷雾干燥机进风温度为165℃，出风温度为85℃，流速400mL/h。所述的喷雾干燥机现主要采用上海沃迪科技有限公司提供的SD-1500型喷雾干燥机。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）牦牛乳酪蛋白加水溶解，调整浓度为1%～10%，调节温度为20℃～50℃，pH6.0～9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白完全溶解；

（2）加胰蛋白酶水解，维持反应温度20℃～50℃，pH6.0～9.0，水解1～7小时；

（3）灭活胰蛋白酶，升温至80℃～100℃，维持30～50分钟；

（4）沉淀酪蛋白，用5mol/L食用级盐酸调节pH到3.8～4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；

（5）离心除沉淀，4000g～12000g离心力，离心5～30分钟，留上清液；

（6）超滤，用截留量3000Da的超滤膜，超滤步骤（5）所得上清液，除去大分子蛋白及多肽，收集透过液；

（7）纳滤，用截留量500Da的纳滤膜，纳滤步骤（6）所得超滤液去除小分子盐和氨基酸，收集回流液；

（8）对步骤（7）收集的回流液进行喷雾干燥，即得所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽。

2.如权利要求1所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征是：在步骤（1）中所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白，步骤（1）中所述的牦牛乳酪蛋白加水溶解是：取5～50g牦牛乳酪蛋白，加水500mL进行溶解。

3.如权利要求1所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征是：在步骤（2）中胰蛋白酶，酶添加量为牦牛乳酪蛋白加入量的0.5%～2%。

4.如权利要求1所述的牦牛乳酪蛋白降血压肽的制备方法，其特征是：在步骤（8）中，是采用喷雾干燥机对步骤（7）收集的回流液进行干燥的，所述喷雾干燥机进风温度为150～165℃，出风温度为65～85℃，流速300～400mL/h。